Article de méthode

Un modèle de vessie in vitro d’infection des voies urinaires associée à un cathéter

DOI :

10.3791/67966

⸱

24 juin 2025

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille un modèle in vitro des voies urinaires par cathéter, qui peut être utilisé pour étudier à la fois les populations de cellules bactériennes associées au planctonique et au biofilm dans les infections des voies urinaires simulées associées au cathéter. Ce modèle peut être utilisé pour étudier l’efficacité des produits antimicrobiens visant à contrôler les infections des voies urinaires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les infections des voies urinaires associées aux cathéters (AIAC) sont parmi les infections associées aux soins de santé les plus courantes. La formation de biofilm sur les cathéters urinaires est un aspect clé de la pathogenèse de ces infections, et conduit fréquemment à l’obstruction des cathéters et à des complications graves telles que la pyélonéphrite et la septicémie. Les approches de modélisation et d’étude de la formation du biofilm dans ce contexte sont essentielles à la fois pour une compréhension fondamentale des mécanismes sous-jacents à la pathogenèse des CAUTI, ainsi que pour le développement et l’évaluation préclinique robuste de stratégies thérapeutiques efficaces pour contrôler les CAUTI et le blocage du cathéter. Ce protocole décrit un modèle in vitro des voies urinaires par cathéter, qui reproduit le système de drainage fermé par cathéter tel qu’il est utilisé dans la pratique clinique, facilitant l’étude de l’IUCA et de la formation du biofilm du cathéter dans des conditions représentatives. De plus, ce protocole détaille l’application du modèle de vessie in vitro pour évaluer l’efficacité des produits d’entretien des cathéters antimicrobiens, y compris les produits actuellement disponibles dans la chaîne d’approvisionnement du NHS.

Introduction

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Les cathéters urinaires sont parmi les dispositifs médicaux les plus couramment utilisés, avec une prévalence estimée à 19 % dans les établissements de soins aigus 1,2,3. Les cathéters sont principalement déployés pour aider à la gestion du débit urinaire en cas de dysfonctionnement de la vessie, et sont insérés directement dans la vessie, permettant à l’urine de s’évacuer de la vessie via une lumière centrale 2,3. Les cathéters urinaires peuvent être utilisés soit par intermittence, où ils sont insérés périodiquement dans la vessie pour drainer l’urine, soit des cathéters à demeure peuvent être utilisés, où les cathéters sont laissés in situ dans la vessie pour drainer l’urine en continu 3,4. Malgré leur utilisation répandue, les cathéters urinaires sont le plus grand facteur de risque de développement d’infections des voies urinaires (IVU), qui représentent environ un cinquième des infections associées aux soins de santé 5,6. En effet, le cathéter lui-même agit souvent comme le site initial de la colonisation microbienne, fournissant une surface à laquelle les uropathogènes peuvent adhérer et coloniser davantage les voies urinaires 1,6,7,8. Pratiquement tous les patients subissant un cathétérisme continu à long terme (où le cathéter est laissé en place pendant ≥28 jours) souffriront de bactériurie, le risque augmentant de ~5 % pour chaque jour où le cathéter est in situ 2,9,10,11. Proportionnellement, environ 80 % des infections urinaires sont associées à l’utilisation d’une sonde urinaire6.

Les infections des voies urinaires associées aux cathéters représentent un fardeau important pour les services de santé et sont souvent associées à des symptômes d’infection urinaire supérieure plus graves (tels que l’urétérite et la pyélonéphrite) que les infections urinaires non compliquées, ainsi qu’à un risque accru d’infections sanguines secondaires 1,7,12,13,14 . Les traitements standard des infections urinaires aiguës aiguës comprennent l’antibiothérapie, cependant, ces infections sont souvent récalcitrantes au traitement antimicrobien en raison du développement de communautés de biofilm complexes à la surface du cathéter 15,16,17,18,19,20. En effet, on estime que ~80 % des infections urinaires résultent d’agents pathogènes des voies urinaires formant un biofilm19. La formation d’un biofilm est caractérisée par l’attachement de cellules bactériennes aux surfaces du cathéter et le développement de communautés intégrées dans une matrice étendue de substances polymères extracellulaires (EPS)21,22,23,24. La production de l’EPS est une caractéristique déterminante des communautés de biofilms et est responsable de nombreuses propriétés émergentes affichées par les cellules associées au biofilm, telles que la résistance élevée aux agents antimicrobiens et la clairance immunitaire 21,22,24. L’EPS peut jouer un rôle direct dans ces phénotypes en protégeant physiquement les cellules contre les antimicrobiens ou les effecteurs immunitaires, ainsi qu’indirectement en facilitant le développement d’aspects plus larges des communautés de biofilms tels que le microenvironnement physico-chimique du biofilm et la formation de cellules persistantes 23,24,25,26. De plus, certains uropathogènes, y compris Proteus spp., qui représentent ~11 % des infections urinaires, possèdent de puissantes enzymes uréases, leur permettant d’hydrolyser l’urée présente dans l’urine et entraînant une augmentation globale du pH urinaire 2,27,28,29,30. Cette augmentation du pH s’accompagne de la précipitation de cristaux de phosphate de calcium et de magnésium, qui peuvent être incorporés dans le biofilm en croissance, entraînant une biominéralisation et la formation de structures de biofilm cristallin denses qui peuvent bloquer les cathéters. Ces biofilms cristallins rendent non seulement le traitement problématique, mais peuvent également initier des complications graves telles que la pyélonéphrite et la septicémie 2,28,31,32,33,34.

La niche environnementale complexe dans les voies urinaires cathétérisées et le rôle important de la formation de biofilms dans ces infections posent des défis particuliers dans l’étude de la pathogenèse des CAUTI. Des modèles de laboratoire simples et largement utilisés pour étudier et quantifier la formation de biofilms, tels que les tests sur plaque à 96 puits, sont inadéquats pour l’étude de la formation de biofilms dans CATUI, en particulier les biofilms cristallins. Par exemple, de tels modèles ne tiennent pas compte des aspects clés de la niche des CAUTI, tels que l’environnement nutritif complexe fourni par l’urine, la façon dont la surface du cathéter affecte l’adhérence et la production ultérieure de biofilm, et le flux continu des milieux urinaires 35,36,37,38,39,40. De plus, les tests standard utilisés pour déterminer la sensibilité aux antimicrobiens des uropathogènes ne reflètent souvent pas la sensibilité clinique réelle. Les tests de concentration minimale inhibitrice et les tests de suspension microbienne sont fréquemment utilisés pour déduire la sensibilité aux antimicrobiens des agents pathogènes des infections urinaires, mais ne simulent généralement pas les variables importantes de l’environnement des infections urinaires, telles que l’effet que la présence d’une sonde urinaire et la formation ultérieure d’un biofilm peuvent avoir sur la sensibilité aux antimicrobiens 41,42,43.

Cette étude détaille la configuration et l’exécution d’un modèle de vessie in vitro qui simule l’environnement des voies urinaires cathétérisées et reproduit un système de drainage fermé par cathéter standard tel qu’il est utilisé dans la pratique clinique, décrit pour la première fois par Stickler et coll.44 en 1999 (figure 1). Ce modèle utilise des cathéters de Foley de taille standard (qui sont actuellement disponibles dans la chaîne d’approvisionnement du NHS) et des milieux d’urine artificielle (AUM) tels que décrits précédemment par Nzakizwanayo et al.45pour simuler la formation d’IUCA et de biofilm. Le modèle de vessie in vitro se compose d’une chambre en verre à double paroi qui agit comme la « vessie » et dispose d’une sortie par laquelle un cathéter de Foley peut être inséré dans la chambre de verre centrale. Au sommet de la chambre vitrée centrale, il y a une entrée par laquelle l’AUM peut être fourni à la « vessie » à un débit biologiquement pertinent à l’aide d’une pompe péristaltique, qui s’écoulera à travers le cathéter via les trous de drainage dans un sac à déchets. De plus, la chambre extérieure est reliée à un circuit de bain-marie, ce qui permet de maintenir les modèles à une température constante. Le modèle de vessie in vitro peut être inoculé via la chambre centrale, ce qui permet d’étudier les agents pathogènes de l’infection urinaire dans une niche biologiquement représentative. De plus, comme les modèles sont cathétérisés et constamment alimentés en AUM frais, la croissance et la dynamique de population des cellules planctoniques et associées au biofilm peuvent être étudiées.

Des études antérieures ont utilisé des modèles de vessie in vitro pour plusieurs applications, y compris l’étude fondamentale de la formation de biofilms chez les principaux agents pathogènes CAUTI, notamment Proteus mirabilis et Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. De plus, le modèle in vitro a été utilisé pour évaluer l’efficacité des produits destinés à contrôler les infections urinaires aiguës ou à prévenir le blocage 50,51,52. Plus récemment, des modèles ont été utilisés pour déterminer si les adaptations et les mutations liées à la résistance aux antimicrobiens ont un impact sur la formation du biofilm et la pathogenèse des CAUTI chez P. mirabilis43,46. Le modèle de vessie in vitro a également été utilisé pour étudier de nouveaux traitements antimicrobiens visant à traiter l’infection urinaire aiguë, y compris des revêtements de cathéter théranostique nouvellement formulés et des traitements de phagothérapie47,48. Ce protocole comprend la mise en place et l’exécution de modèles de vessie in vitro, le dénombrement des cellules planctoniques viables et associées au biofilm à partir du modèle et de la surface du cathéter urinaire respectivement, et la mesure du pH urinaire pour surveiller la production d’uréase. Des protocoles sont également détaillés pour l’évaluation des produits antimicrobiens visant à traiter ou à prévenir les infections urinaires, y compris les solutions d’irrigation de la vessie et les gels lubrifiants antimicrobiens, qui sont actuellement disponibles dans la chaîne d’approvisionnement du NHS.

Protocole

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Une représentation schématique de la configuration du modèle de vessie in vitro est illustrée à la figure 1. Les modèles de vessie in vitro sont conçus pour être compatibles avec les cathéters de Foley standard (les dimensions indiquées à la figure 1 sont compatibles avec les cathéters français de taille standard 14). Stérilisez tout l’équipement de modèle de vessie in vitro et fixez tout tube en silicone utilisé dans le circuit de média avant de l’utiliser. Le strict respect de la technique aseptique est requis tout au long de l’installation des modèles in vitro , et il est recommandé d’assembler le modèle dans des conditions stériles (c’est-à-dire dans une enceinte de sécurité microbienne de catégorie II ou une hotte à flux laminaire). Un minimum de n = 5 répétitions est recommandé pour déterminer la signification statistique des expériences sur des modèles de vessie in vitro . Les détails sur les réactifs et l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation de milieux d’urine artificiels

REMARQUE : L’utilisation de milieux d’urine artificielle (AUM) dans les modèles de vessie in vitro en raison des volumes élevés de milieux requis pour l’expérimentation et de la variabilité associée aux échantillons d’urine humaine. Ce protocole détaille la préparation de l’AUM telle qu’elle a été décrite précédemment et optimisée pour être utilisée dans le modèle de vessie in vitro par Nzakizwanayo et al. (volume final de 5 L) 43,45,46,48,53,54.

  1. Préparer la solution 1 de l’AUM
    1. Peser les composés suivants et les ajouter dans une bouteille de borosilicate de 1 L remplie de 850 mL d’eau désionisée : 3,25 g de chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2,6H 2O), 23 g de chlorure de sodium (NaCl), 11,5 g de sulfate de sodium anhydre (Na2SO4), 3,25 g de citrate trisodique (Na3C6H5O7), 0,1 g d’oxalate de sodium (Na2C2O4), 14 g de phosphate monopotassique (KH2PO4), 8 g de chlorure de potassium (KCl), 5 g de chlorure d’ammonium (NH4Cl), 25 g de gélatine et 5 g de bouillon de soja tryptone.
  2. Tout en agitant la solution AUM, mesurez le pH à l’aide d’un pH-mètre et ajustez-le à 5,75 (± 0,02) en ajoutant 3 M de NaOH ou de HCl selon le cas.
    REMARQUE : Le NaOH/HCl pour l’ajustement du pH doit être ajouté à AUM goutte à goutte pour empêcher la précipitation de sel de la solution.
  3. Une fois que le pH de l’AUM a été ajusté, complétez la solution jusqu’à un volume final de 1 L avec de l’eau désionisée et stérilisez à l’autoclave.
    REMARQUE : Une fois stérile, la solution peut être conservée jusqu’à trois mois à température ambiante (la solution AUM 1 doit être jetée si des précipitations ou une turbidité sont observées).
  4. Séparément, préparer la solution AUM 2 en ajoutant 125 g d’urée (CH4N2O) et 2,45 g de chlorure de calcium (CaCl2) à 400 ml d’eau stérile désionisée dans un bécher stérile de 500 ml.
    REMARQUE : La préparation de la solution d’urée calcique 2 entraîne une réaction endothermique, par conséquent, il est recommandé d’agiter et de chauffer la solution AUM 2 à ~ 50 °C sur une plaque chauffante/agitateur magnétique pendant que les composés se dissolvent pour éviter la congélation.
  5. Une fois l’urée et le chlorure de calcium dissous, filtrez la solution 2 à l’aide d’une pompe à vide et d’unités de filtre en nitrocellulose de 0,45 μM, dans une bouteille en verre stérile de 500 ml. Une fois stérilisée, la solution 2 est stable pendant trois mois à 4 °C ou un mois à température ambiante
    REMARQUE : La solution AUM 2 doit être jetée si des précipitations ou une nébulosité sont observées.
  6. Dans une hotte à flux laminaire ou une enceinte de sécurité microbiologique de catégorie II, combinez de manière aseptique les solutions AUM 1 et 2 avec 3,6 L d’eau déminéralisée stérile dans une bouteille d’aspirateur en verre stérile de 5 L. Les actifs sous gestion doivent être de couleur jaune pâle et transparents.
  7. À l’aide d’une pipette sérologique, prélever 50 mL du volume total de l’AUM et aliquote dans un tube à centrifuger de 50 mL, et réserver pour une utilisation ultérieure.
  8. Fermez le flacon aspirateur à l’aide d’une bonde en caoutchouc ou d’une feuille d’aluminium et laissez-le à température ambiante jusqu’à ce que les modèles in vitro soient assemblés.
  9. Prélever aseptiquement 10 mL d’AUM de l’aliquote de 50 mL et réserver le reste de la solution pour la préparation de l’inoculum. À l’aide d’un pH-mètre, mesurez le pH de l’aliquote de 10 mL d’AUM, qui doit être de ~pH 6,1 (±0,2). Les actifs sous gestion préparés sont stables à température ambiante pendant environ un mois et doivent être jetés en cas de précipitations ou de nébulosité.

2. Configuration du modèle de vessie in vitro

  1. Insérez un cathéter de Foley dans la chambre de verre centrale du modèle de vessie in vitro (schéma détaillé à la figure 1). Fixez le cathéter en place en gonflant le ballonnet avec la seringue d’eau stérile fournie, et fixez le sac à déchets à l’orifice du cathéter.
  2. Raccordez le dispositif de vessie in vitro 45 au réservoir AUM à l’aide d’une tubulure de raccordement. Connectez le tube du circuit de média à la pompe péristaltique selon les instructions du fabricant, en vous assurant que le tube a une tension adéquate sans être étiré.
  3. Fixez les modèles à vessie in vitro aux supports de serrage et fixez les sacs à déchets dans les supports sous les modèles pour assurer la circulation à travers les modèles par gravité.
  4. Connectez la chambre extérieure du modèle à vessie à un bain-marie en circulation à l’aide d’un tube en silicone (Figure 1B). Réglez le bain-marie pour qu’il chauffe à 37 °C et allumez les circulateurs du réservoir.
    1. Faites couler les bains-marie pendant 30 minutes avant d’inoculer les modèles de vessie in vitro pour vous assurer que la température est stable à 37 °C, et assurez-vous que le bain d’eau reste rempli au niveau d’eau approprié pendant toute la durée de l’expérimentation.
  5. Retirer toutes les pinces de la tubulure du média et régler les pompes péristaltiques pour qu’elles fonctionnent à environ 0,75 ml/min pour reproduire la production d’urine humaine (~1080 ml/jour). Les débits réels seront calculés lors de l’expérimentation.
  6. Passer AUM dans les modèles de vessie in vitro à l’aide de la pompe péristaltique pendant 30 minutes avant l’inoculation pour confirmer que le débit du milieu est constant et que le système de drainage stérile est intact.
  7. Videz tout milieu accumulé du sac à déchets avant l’expérimentation. Le volume du fluide peut être mesuré pour calculer les débits exacts (détaillés à l’étape 4).

3. Inoculation de modèles de vessie in vitro

  1. Préparez des cultures de nuit pour des modèles de vessie in vitro en suspendant une boucle de colonies bactériennes cultivées sur une gélose solide dans 10 mL de bouillon LB. Incuber toute la nuit à 37 °C en agitant.
    REMARQUE : Le modèle de vessie in vitro peut être utilisé pour étudier une variété d’agents pathogènes de l’IUCA, y compris les souches positives à l’uréase telles que Proteus mirabilis, et le milieu de croissance utilisé peut être modifié en conséquence.
  2. Centrifugez tout le volume de culture de nuit à 4 500 x g pendant 10 min à température ambiante et jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 10 mL d’AUM et mesurer l’absorbance àOD 595 nm à l’aide d’un spectromètre.
  3. Normaliser les cultures remises en suspension à une DOde 595 nm de 1,0 et un volume final de 10 mL en AUM à l’aide de l’équation suivante :
    figure-protocol-1
    où, A1 est l’absorbance à DO600 nm de la culture pendant la nuit, A2 est l’absorbance souhaitée à DO600 nm de l’inoculum (1,0), V2 est le volume souhaité de l’inoculum (10 mL) et V1 est le volume requis de la culture pendant la nuit pour la normalisation.
    REMARQUE : 10 mL d’une suspension de595 nm de DO 1.0 permettront d’inoculer environ 10 à10 UFC de la plupart des souches bactériennes (validées pour Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus), reproduisant une infection établie. L’inoculum de départ peut être modifié en fonction de l’espèce utilisée ou du stade de l’infection modélisé (c.-à-d. qu’une densité d’inoculum plus faible peut être utilisée pour simuler l’infection à un stade précoce)47.
  4. Stérilisez les modèles de vessie in vitro avec de l’éthanol à 70 % et retirez le bouchon (entrée du média) pour que la chambre intérieure soit accessible. Retirer 10 mL d’AUM du volume à l’intérieur du modèle à vessie à l’aide d’une pipette sérologique.
    REMARQUE : Lors de l’inoculation et de l’échantillonnage de modèles in vitro à partir de la chambre centrale, assurez-vous que le travail est rapide et aseptique, portez toujours l’EPI approprié et décontaminez régulièrement les gants et les surfaces avec de l’éthanol à 70 %.
  5. Inoculer les modèles de vessie in vitro par la chambre centrale à l’aide de la suspension normalisée de 10 mL et bien mélanger à l’aide d’une pipette sérologique. Prélever 10 mL de la chambre centrale des modèles à vessie in vitro à l’aide d’une pipette sérologique et aliquote dans un universel de 15 mL pour des calculs ultérieurs de CFU/mL et une mesure du pH.
  6. Décontaminez soigneusement les surfaces externes du modèle à vessie et de la bonde avec de l’éthanol à 70 %, puis remplacez le bouchon. Reprenez brièvement le flux de fluide pour vous assurer que le niveau AUM dans la chambre centrale atteint le trou de l’œil, avant d’arrêter le flux.
  7. Laisser les cultures s’établir dans le modèle à vessie pendant 1 h avant d’activer le débit du milieu par la pompe péristaltique à ~0,75 mL/min.
  8. Pendant que l’inoculum s’établit, préparez des dilutions à partir de l’échantillon prélevé dans la chambre centrale.
    1. Diluer en série 100 μL d’échantillon dans 900 μL de PBS stérile jusqu’à ce que l’échantillon soit dilué à 10-7. Déposer 10 μL de points de dilution en trois exemplaires sur un milieu solide approprié et incuber à 37 °C pendant la nuit.
    2. Après l’incubation, comptez les colonies sur chaque plaque de dilution et calculez la valeur CFU/mL exacte de l’inoculum initial.
      REMARQUE : Si vous utilisez des espèces qui essaiment, c’est-à-dire Proteus mirabilis, utilisez la gélose MacConkey sans sel (peptone 20,0 g/L, lactose 10,0 g/L, sels biliaires 5,0 g/L, rouge neutre 0,075 g/L et gélose 12,0 g/L) pour vous assurer que les colonies individuelles sont toujours visibles et que le comptage est facile.
  9. Après 1 h d’incubation, allumez le débit de fluide via la pompe péristaltique pour commencer à faire fonctionner les modèles de vessie in vitro , en notant l’heure à laquelle les modèles sont allumés.

4. Calcul du débit d’un modèle de vessie in vitro

  1. Une fois que les modèles in vitro ont été inoculés et que l’écoulement du milieu a commencé, laisser les modèles fonctionner pendant 4 h. Interrompre brièvement le flux de fluide et collecter tout le volume d’AUM résiduel du sac à déchets dans une fiole jaugée via l’orifice de drainage. Notez le volume collecté.
    REMARQUE : Le débit peut être calculé à partir du volume de fluide collecté à l’étape 2.7., mais des débits plus précis peuvent être obtenus en faisant fonctionner les modèles pendant plus longtemps (c’est-à-dire 4 h recommandés), car cela réduit la probabilité que de l’air résiduel dans le tube du circuit de média affecte le débit calculé.
  2. Reprendre l’écoulement du fluide via la pompe péristaltique, en s’assurant que l’orifice de drainage du sac à déchets est fermé, afin de maintenir un système de drainage stérile.
  3. Pour calculer le débit réel des modèles in vitro , utilisez l’équation suivante :
    figure-protocol-2
    REMARQUE : Des débits de l’ordre de 0,55 à 1,0 mL/min sont recommandés pour reproduire la production d’urine humaine.
  4. Si le débit du fluide est calculé en dehors de la plage acceptable, jetez la réplique et ajustez le régime de la pompe péristaltique pour l’adapter à la plage acceptable.

5. Échantillonnage de cellules planctoniques à partir du modèle de vessie in vitro

REMARQUE : Des modèles de vessie in vitro doivent être échantillonnés régulièrement tout au long de l’expérience afin de surveiller la dynamique de la population. Tous les modèles doivent être échantillonnés immédiatement après l’inoculation, au point d’activation de l’écoulement AUM, 4 h après l’inoculation (lorsque le débit est calculé), et au point où les modèles sont terminés (soit l’obstruction, soit un paramètre prédéterminé). Si vous utilisez les modèles pendant >24 h, il est recommandé de prélever des échantillons toutes les 24 heures pour surveiller les UFC/mL, et des échantillons supplémentaires peuvent être prélevés selon les besoins des utilisateurs.

  1. Décontaminez le bouchon du modèle de vessie avec de l’éthanol à 70 % et retirez-le pour accéder à la chambre centrale.
  2. En évitant l’embout du cathéter et le ballonnet, mélangez délicatement le contenu de la chambre centrale à l’aide d’une pipette sérologique.
  3. À l’aide d’une pipette sérologique, prélever un échantillon de 10 mL de la chambre et le transférer dans un tube stérile. Décontaminez immédiatement le bouchon avec de l’éthanol à 70 % et remplacez-le, complétant ainsi le circuit de drainage stérile et fermé.
  4. Prélever 1 mL de l’échantillon à l’aide d’une pipette et faire l’aliquote dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL pour les dilutions en série.
  5. Mesurez le pH de l’échantillon restant à l’aide d’un pH-mètre, en vous assurant que l’échantillon est bien mélangé et que le pH-mètre est étalonné avant utilisation.
  6. Diluer en série l’aliquote de 1 mL réservée de l’échantillon et déposer la plaque sur un milieu solide approprié, comme décrit précédemment à l’étape 3.8, en enlevant toutes les dilutions.
    REMARQUE : Les échantillons planctoniques prélevés sur le modèle de vessie conviennent à d’autres analyses, y compris les applications de biologie génomique ou moléculaire (facultatif).

6. Échantillonnage de cellules associées au biofilm à partir du modèle de vessie in vitro

  1. Retrait et préparation du cathéter
    REMARQUE : L’échantillonnage de biofilm de modèles de vessie in vitro est une analyse de point final, nécessitant la désactivation des modèles et le retrait des cathéters pour le traitement.
    1. Débranchez le sac à déchets du cathète et évacuez toute urine résiduelle du modèle en dégonflant le ballonnet. Retirez le cathéter du bas du modèle à l’aide d’une pince stérile.
    2. Placez le cathéter retiré sur une planche stérile et, à l’aide d’un scalpel stérile, coupez le cathéter aux points requis pour la section (illustrés à la figure 2).
    3. Assurez-vous que les sections du cathéter sont coupées dans le sens de la longueur pour exposer la lumière ; puis, à l’aide d’une pince stérile, trempez la section du cathéter 3 fois dans du PBS stérile pour éliminer les cellules non adhérentes.
      REMARQUE : Si vous imagez des sections de cathéter en aval, c’est-à-dire à l’aide d’un MEB, laissez les sections de 1 cm intactes (ne coupez pas dans le sens de la longueur) et éliminez plutôt l’excès d’humidité de la lumière avec une serviette en papier stérile avant la fixation.
  2. Perturbation du biofilm pour le dénombrement des UFC/mL
    REMARQUE : Les protocoles détaillant la perturbation des cellules associées au biofilm peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire si les biofilms sont largement cristallins ou mucoïdes.
    1. Incuber la section du cathéter préparée dans de la trypsine à 0,25 % à 37 °C pendant 30 min. Le volume de trypsine utilisé doit être le minimum requis pour couvrir le cathéter ; Par exemple, pour une section de cathéter de 1 cm coupée perpendiculairement, 1 mL de trypsine à 0,25 % est suffisant.
    2. Après l’incubation, sonicer la solution contenant le cathéter pendant 10 min. La section du cathéter peut ensuite être retirée et jetée. Pour désactiver la trypsine, la solution cellulaire doit être immédiatement diluée dans du PBS stérile et conditionnée pour le comptage des UFC sur un milieu solide approprié, comme décrit précédemment à l’étape 3.8.
  3. Quantification du biofilm du cathéter par coloration au violet cristallin
    1. Ajoutez les sections de cathéter préparées dans les puits dans une plaque à puits à fond plat de taille appropriée. Utilisez un volume approprié de solution de cristal violet à 0,1 % pour immerger complètement la section du cathéter et incuber statiquement à température ambiante pendant 15 min. Assurez-vous qu’une section de cathéter stérile est également incluse comme contrôle d’arrière-plan.
    2. Retirez les sections du cathéter de la plaque et transférez-les sur une nouvelle plaque. Lavez chaque section de cathéter deux fois dans de l’eau distillée.
    3. Après le rinçage, transférez les sections du cathéter dans une nouvelle plaque et recouvrez d’acide acétique à 33 %. Incuber 15 min à température ambiante.
    4. Retirez la section du cathéter de la plaque, puis, à l’aide d’un lecteur de plaque, mesurez la DO595 nm pour chaque réplication, en utilisant les puits qui contenaient les sections de cathéter stériles comme témoins de fond.

7. Sensibilité aux antimicrobiens dans le modèle de vessie in vitro

REMARQUE : La plupart des traitements visant à contrôler l’infection des voies urinaires associée au cathéter sont compatibles avec les cathéters de Foley standard, vérifiez la compatibilité avant de commencer des expériences in vitro sur des modèles de vessie.

  1. Gels lubrifiants antimicrobiens
    REMARQUE : Pour simuler l’utilisation d’agents lubrifiants lors de l’insertion du cathéter, cette étape doit être effectuée au cours de l’étape 2.1, immédiatement avant l’insertion du cathéter de Foley. Après avoir inséré le cathéter, le modèle doit être immédiatement connecté, et l’étape 2.6. doit être omis afin que le gel ne soit pas dilué et drainé avant l’inoculation. L’inoculation doit avoir lieu le même jour que l’insertion du cathéter. Les agents lubrifiants conçus pour être utilisés avec des cathéters sont conditionnés sous forme de seringues individuelles, stériles à usage unique d’un volume de 6 ml ou de 11 ml. Environ 5 ml de lubrifiant suffisent pour remplir le col du modèle à vessie et recouvrir la base du modèle.
    1. À l’aide de la technique aseptique, insérez l’extrémité de la seringue contenant l’agent lubrifiant dans le col du modèle à vessie, et insérez 5 mL de gel pour remplir le col et pénétrer dans la base de la chambre.
    2. Faites pivoter le modèle de manière à ce que la base soit uniformément recouverte de gel, puis insérez un cathéter de Foley dans le modèle en poussant l’extrémité du cathéter à travers le gel et fixez-le en remplissant le ballonnet comme d’habitude.
    3. Connectez le modèle au reste de la configuration, puis remplissez la lumière du modèle d’urine jusqu’à ce qu’elle commence à s’écouler. Dès que l’urine commence à s’écouler par le trou de l’œil du cathéter, arrêtez la pompe pour éviter la perte de gel avant l’inoculation.
      1. Incuber les modèles pendant 30 minutes pour permettre à l’urine d’atteindre 37 °C, puis inoculer les modèles comme décrit précédemment pour assurer l’uniformité du temps de diffusion des composants du gel dans le volume d’urine.
    4. Inoculez le modèle comme décrit à l’étape 3.5 et laissez-le incuber pendant 1 h avant de mettre en marche les pompes péristaltiques. Au moment de mettre la pompe en marche, prélever un échantillon de planctonique de 1 mL et doser les dilutions pour le nombre d’UFC, comme décrit à l’étape 3.8.
  2. Solutions d’irrigation
    REMARQUE : Les solutions d’irrigation sont souvent disponibles en vrac ou sous forme de « sachets » individuels, stériles et à usage unique. Si vous utilisez des solutions individuelles, assurez-vous qu’elles sont compatibles avec les orifices de drainage des cathéters à utiliser avant l’expérimentation. Si vous utilisez des solutions d’irrigation en vrac, assurez-vous d’utiliser des cathéters à triple lumière et de suivre les instructions du fabricant pour déterminer le volume et le délai d’administration du produit.
    1. Avant le traitement, exécutez des modèles in vitro pendant au moins 4 heures pour vous assurer que les communautés associées au biofilm ont eu suffisamment de temps pour s’établir. Une fois que les modèles ont fonctionné pendant 4 h, interrompez le flux de média et prélevez un échantillon de prétraitement dans la chambre interne des modèles in vitro , comme indiqué à l’étape 5.
      REMARQUE : Si vous utilisez des solutions d’irrigation en vrac, passez à l’étape 7.2.5.
    2. Si vous utilisez une « poche » d’irrigation individuelle, débranchez le sac à déchets du cathéter et utilisez le capuchon fourni avec la poche pour sceller le sac à déchets. Fixez immédiatement le sachet de solution d’irrigation au cathéter et, en exerçant une légère pression, pressez le produit dans la lumière centrale. Appliquer selon les instructions du fabricant (c.-à-d. 15 minutes d’application).
    3. Une fois le traitement recommandé terminé, laissez la solution résiduelle s’écouler de la chambre intérieure via le trou de l’œil du cathéter dans la poche d’irrigation, puis débranchez la poche. Le contenu restant du sachet peut être mis au rebut ou utilisé pour d’autres applications en aval.
    4. Stérilisez l’orifice de drainage du cathéter et l’orifice de raccordement du sac à déchets avec de l’éthanol à 70 %, puis reconnectez-les, complétant ainsi un système de drainage stérile et fermé.
      REMARQUE : Passez à l’étape 7.2.7 si vous utilisez des sachets d’irrigation.
    5. Si vous utilisez un cathéter à triple lumière, désinfectez l’orifice d’irrigation avec de l’éthanol à 70 % et commencez immédiatement à irriguer à l’aide d’une seringue stérile selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE : Mesurez le volume d’urine résiduelle dans le sac à déchets avant d’irriguer afin de pouvoir en tenir compte dans les calculs de temps ou de débit de blocage en aval.
    6. Une fois l’irrigation terminée, jetez la seringue et toute solution d’irrigation résiduelle laissée dans le sac à déchets.
    7. Prélever un échantillon post-traitement dans la chambre centrale du modèle de vessie in vitro , comme détaillé à l’étape 5, et reprendre l’écoulement AUM via la pompe péristaltique pour poursuivre l’expérimentation.

8. Mettre fin à l’expérimentation sur des modèles de vessie in vitro

REMARQUE : Les organismes positifs à l’uréase tels que P. mirabilis peuvent provoquer le blocage des cathéters urinaires par la formation d’un biofilm cristallin. Le blocage peut donc être utilisé comme critère d’évaluation biologiquement pertinent pour les modèles de vessie in vitro et est identifié visiblement par l’occlusion complète des trous du cathéter avec des biofilms cristallins et une augmentation du volume de l’AUM dans la chambre centrale de la « vessie » de verre (Figure 3).

  1. Une fois que les modèles de vessie in vitro ont atteint le point final prédéterminé, qui peut être un blocage ou une durée de fonctionnement définie, coupez le débit AUM via la pompe péristaltique et prélevez un échantillon du point final dans la chambre centrale comme décrit à l’étape 5.
  2. Coupez le débit du bain-marie et débranchez le circuit de média et la tubulure du circuit du bain-marie des modèles à vessie in vitro .
  3. Retirez les bouchons des modèles de vessie in vitro et retirez tout le volume d’urine résiduelle à l’aide d’une pipette sérologique. Jetez tout milieu contaminé de manière appropriée (c.-à-d. stérilisez à l’autoclave).
  4. Videz les sacs à déchets et jetez tout support résiduel. Débranchez les sacs de déchets de cathéter de l’orifice du cathéter et jetez-les.
  5. À l’aide d’une seringue, dégonflez lentement les ballonnets du cathéter avant de retirer les cathéters des modèles.
    REMARQUE : Si vous utilisez des espèces bactériennes positives à l’uréase, les cathéters peuvent se « coller » aux parois en verre des modèles in vitro . Évitez d’appliquer de grandes quantités de force sur les cathéters et passez plutôt à l’étape 8.6.
  6. Faites tremper les modèles in vitro dans une solution nettoyante antimicrobienne à 5 % (voir le tableau des matériaux) pendant la nuit, puis lavez-les abondamment à l’eau pour vous assurer que tout désinfectant résiduel est éliminé. Autoclave pour stériliser.
    REMARQUE : Si vous utilisez des espèces positives à l’uréase, ajoutez 5 % p/v d’acide citrique à la solution désinfectante pour aider à dissoudre toute biominéralisation dans la chambre centrale. Cette solution acide aidera également à libérer les cathéters qui se sont collés aux modèles en décomposant les dépôts de biofilm cristallin.
  7. Débranchez le tube du circuit de fluide du réservoir AUM et jetez tout fluide résiduel. Rincer le tube avec de l’eau pour éliminer tout résidu d’AUM et d’autoclave.
  8. Pour calculer le temps de blocage exact, notez le volume final dans le sac à déchets et utilisez l’équation de l’étape 4.4 et le débit précédemment calculé pour déterminer le temps de blocage.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le succès du modèle de vessie in vitro dépend de la pratique d’une bonne technique d’asepsie et d’une observation minutieuse de la turbidité du milieu tout au long de l’expérience (Figure 3). Avant l’inoculation, l’AUM stérile était de couleur jaune pâle et transparent dans la chambre centrale du modèle de vessie in vitro (figure 3A). Les actifs sous gestion dans le réservoir du milieu doivent rester clairs tout au long de l’expérience, car tout changement de turbidité peut indiquer une précipitation des sels de la solution ou une contamination du milieu. Si l’AUM dans le réservoir de média ou le tube du circuit de média devient trouble ou présente un changement radical de couleur, les répétitions doivent être jetées et répétées. Après l’inoculation, une augmentation de la turbidité de l’AUM dans la chambre centrale du modèle de vessie in vitro est clairement visible (Figure 3B). Les changements de turbidité sont souvent plus prononcés chez les organismes positifs à l’uréase tels que P. mirabilis, mais devraient encore être visibles après l’inoculation chez les organismes négatifs à l’uréase. Une fois que l’écoulement sous AUM est initié, une réduction de la turbidité AUM est souvent observée lorsque les cellules planctoniques sont lessivées, et n’indique pas un manque de cellules viables dans le modèle. L’observation du niveau de média dans la chambre centrale peut également être utilisée pour déterminer le temps de blocage si l’on utilise des organismes positifs à l’uréase (Figure 3C). Pendant que les modèles fonctionnent, le trou de l’œil et l’extrémité du cathéter doivent être complètement visibles pour indiquer un bon drainage dans les sacs à déchets. En cas d’obstruction, le niveau d’AUM dans la chambre centrale s’élèvera au-dessus des trous et de l’extrémité du cathéter, indiquant que l’expérience est prête pour toutes les lectures et la fin du point final. Au cours de l’expérimentation, les effets de pression dans le circuit de média du modèle de vessie in vitro peuvent faire apparaître les modèles bloqués. Si un blocage est suspecté, vérifiez que le circuit AUM, le cathéter et le tube du sac à déchets sont tendus avant de terminer le test, car toute bulle d’air ou pli potentiel dans le tube peut provoquer des « sas » et empêcher le cathéter de se vider.

Au cours d’expériences in vitro sur des modèles de vessie, l’échantillonnage planctonique peut fournir des informations précieuses sur la dynamique de croissance au sein du modèle ainsi que sur la progression de l’IUCA. La croissance cellulaire, le pH et la formation de biofilms peuvent tous être surveillés tout au long de l’expérience sans qu’il soit nécessaire d’arrêter les modèles (Figure 4). Si l’on utilise des organismes positifs à l’uréase, les calculs de temps de blocage peuvent être utilisés comme mesure du taux de formation du biofilm et utilisés pour comparer les propriétés de différentes souches bactériennes (figure 4). La comparaison d’une souche de type sauvage de P. mirabilis et d’un mutant LPS (insertion de mini-tn5 dans waaC) a démontré une prolongation du temps de blocage et donc une réduction de la formation de biofilm chez le mutant (Figure 4). Les organismes négatifs à l’uréase ne bloquent généralement pas les modèles de vessie in vitro , et il est donc recommandé de déterminer un critère d’évaluation défini avant l’expérimentation. Dans certains cas, les organismes négatifs à l’uréase peuvent entraîner le blocage du cathéter. Par exemple, les souches de Klebsiella pneumoniae négatives à l’uréase peuvent produire des biofilms mucoïdes étendus, mais ceux-ci prennent généralement beaucoup plus de temps que les biofilms positifs à l’uréase pour bloquer le drainage, de sorte qu’un critère d’évaluation défini est toujours recommandé.

La mesure du pH tout au long de l’expérimentation sur des modèles de vessie peut également donner un aperçu des différences entre les souches, ainsi que des progrès de l’IUCA. Si des organismes négatifs à l’uréase sont utilisés, le pH dans la chambre centrale du modèle de vessie in vitro devrait rester en grande partie stable tout au long de l’expérience, bien que de petites fluctuations du pH soient attendues à mesure que la dynamique de la population change au cours de l’expérience. L’inoculation de modèles in vitro avec des organismes positifs à l’uréase entraîne une augmentation significative du pH au fil du temps, le pH le plus élevé étant généralement observé au moment du blocage, où des lectures de pH aussi élevées que ~8-9 peuvent être observées (Figure 4B).

Le dénombrement des UFC planctoniques/ml est un élément important de la modélisation in vitro de la vessie, car il permet aux opérateurs d’évaluer si l’inoculation a été réussie et de suivre les progrès de l’expérimentation. La mesure de l’UFC/mL à la fin de l’expérience peut mettre en évidence toute différence de colonisation de la vessie entre différentes souches bactériennes. En comparant la souche mutante mini-Tn5 de P. mirabilis au type sauvage, une réduction significative de l’UFC/mL au moment du blocage a été observée (figure 4C). De plus, le dénombrement des UFC à partir des biofilms à la surface du cathéter et la quantification de la biomasse du biofilm peuvent donner un aperçu de la capacité de différents agents pathogènes à coloniser les voies urinaires par cathétérisme. Des colorants cristallins violets ont été utilisés pour déterminer les différences dans la formation du biofilm entre une souche HI4320 de P. mirabilis de type sauvage et des isolats passés dans la chlorhexidine (figure 5). Les mesures de densité optique à 595 nm ont démontré que les isolats passés dans la chlorhexidine présentaient une réduction de la formation de biofilm par rapport au type sauvage et aux témoins passés en l’absence de chlorhexidine.

Comme l’objectif du modèle de vessie in vitro est de reproduire avec précision le créneau des infections urinaires, les modèles peuvent également être utilisés pour étudier les effets des traitements antimicrobiens visant à traiter les infections urinaires aiguës dans un environnement cliniquement pertinent. Pour les organismes positifs à l’uréase, la comparaison des temps de blocage des modèles traités avec des modèles non traités peut fournir des informations utiles sur l’efficacité du traitement. Le traitement de modèles de vessie in vitro inoculés avec P. mirabilis avec une solution d’irrigation de la vessie à la chlorhexidine à 0,02 % a considérablement prolongé le délai d’obstruction par rapport aux modèles non traités ou traités avec une solution saline à 0,9 % (figure 6A). De plus, le modèle de vessie in vitro peut être utilisé pour étudier l’activité bactéricide des traitements antimicrobiens. La surveillance des variations des UFC/mL des cellules planctoniques et associées au biofilm après un traitement antimicrobien peut indiquer si les traitements sont efficaces. Le traitement de modèles de vessie in vitro inoculés avec P. mirabilis a montré une réduction de >7 log de l’UFC planctonique/mL immédiatement après le traitement, comparativement aux modèles non traités et aux modèles irrigués à 0,9 % de solution saline lorsqu’ils étaient appliqués conformément aux instructions du fabricant (figure 6B).

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Figure 1 : Schéma des principaux composants du modèle de vessie in vitro. (A) Le modèle à vessie (système de drainage fermé) : (1) chambre en verre à double paroi simulant la vessie (2) entrée de média, l’UA est fournie par une pompe péristaltique à la chambre intérieure du modèle à vessie (3) entrée d’eau alimentée par un bain d’eau circulant à la chambre extérieure (4) sortie d’eau (5) cathéter de Foley, inséré dans la chambre intérieure (6) point de connexion de la lumière de drainage ; Point de raccordement pour sac à déchets/poches d’irrigation (7) Sac de drainage collectant l’écoulement de l’urine. (B) Schéma illustrant la configuration du modèle de vessie in vitro et la direction de l’écoulement du milieu et de l’eau à travers le modèle. L’urine artificielle est stockée dans un réservoir de milieu (1) à température ambiante et fournie au modèle par une pompe péristaltique (2) à un débit constant de ~ 0,75 mL min-1 pendant la durée de l’expérience. Le fluide s’écoule dans la chambre centrale du récipient en verre à double paroi représentant la vessie (3) et s’écoule par le trou de l’œil d’un cathéter de Foley (4) dans un sac de drainage (5), complétant ainsi le système de drainage stérile et fermé. Le modèle à vessie in vitro est maintenu à une température constante de 37 °C par un bain-marie à circulation (6), qui s’écoule à travers la chambre extérieure du récipient en verre à double paroi. Les lignes pointillées représentent les tubes en silicone et les flèches représentent la direction de l’écoulement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Section de cathéters urinaires pour traiter les cellules associées au biofilm. Exemples de points sur une sonde urinaire pour la dissection pour la quantification du biofilm en aval. (A) Les cathéters sont d’abord sectionnés latitudinalement dans la région de 8 cm à proximité de l’extrémité ou des trous pour les yeux (où la formation de la plupart des biofilms est observée). Des sections de 1 cm sont prélevées à l’aide d’un scalpel, évitant généralement la région contenant le ballonnet du cathéter dégonflé en raison des difficultés de reproductibilité du traitement (1-3). (B) Une fois que les cathéters sont initialement sectionnés en morceaux de 1 cm, une autre coupe longitudinale est pratiquée dans la lumière centrale pour exposer tout biofilm présent pour une quantification ultérieure du biofilm, c’est-à-dire le dénombrement UFC/mL de la coloration violette cristalline. Les lignes pointillées représentent les points de dissection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Étapes d’une expérience sur un modèle de vessie in vitro. Images du modèle de vessie in vitro chambre centrale, à travers les différentes étapes de l’expérimentation. (A) AUM dans la chambre centrale du modèle de vessie in vitro avant l’inoculation. Le support dans la chambre centrale est complètement transparent, ce qui indique que la stérilisation a réussi, et l’extrémité du cathéter et les trous pour les yeux sont visibles au-dessus de la ligne de support, ce qui indique que le cathéter se draine avec succès. (B) Milieu dans la chambre centrale du modèle de vessie in vitro après l’inoculation de P. mirabilis (4 h après l’inoculation). Le succès de l’inoculation est indiqué par l’augmentation de la turbidité du milieu. La visibilité de l’extrémité du cathéter et des trous oculaires indique que l’AUM s’écoule correctement à travers le cathéter et qu’il n’y a pas eu de blocage. (C) Un exemple de modèle de vessie bloquée in vitro. L’inoculation avec P. mirabilis et la formation et la minéralisation du biofilm qui en ont résulté ont entraîné le blocage des trous oculaires du cathéter, empêchant le drainage et provoquant une élévation du niveau de média dans la chambre centrale au-dessus de l’extrémité du cathéter. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Mesures du point final pour un modèle de vessie in vitro jusqu’à l’obstruction. Exemples de mesures du paramètre au moment de l’obstruction à partir d’un modèle de vessie in vitro inoculé avec une souche clinique de P. mirabilis, RS47 (WT), et une souche mutante avec formation de biofilm atténuée, RS47-2 (mutant). (A) Temps de blocage (h) des souches WT et mutantes de P. mirabilis. (B) pH des modèles de vessie in vitro au moment de l’obstruction. (C) UFC/mL de cellules planctoniques dans une chambre modèle de vessie in vitro au moment de l’obstruction. Toutes les données représentent la moyenne de cinq répétitions biologiques. Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne (SEM). *p ≤ 0,05 ; **p ≤ 0,01. Cette figure a été modifiée à partir de Clarke et al.46. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Mesures cellulaires associées au biofilm à partir du modèle de vessie in vitro. Quantification de la formation du biofilm de P. mirabilis, comparaison de la souche de type sauvage HI4320 à des populations adaptées passées avec ou sans chlorhexidine (CHD) par coloration cristalline violette et mesure de la densité optique (DO) à 595 nm. WT : P. mirabilis HI4320 ; 1, 3, 5 : contrôles de passage sans exposition à la coronaropathie ; 2, 4, 6 : HI4320 passé dans 4 μg/mL CHD. Toutes les données représentent la moyenne de cinq répétitions biologiques. Les barres d’erreur affichent SEM. *p ≤ 0,05 ; **p ≤ 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Mesures à partir de modèles de vessie in vitro après un traitement antimicrobien. Des échantillons planctoniques ont été prélevés sur un modèle de vessie in vitro inoculé avec P. mirabilis, après irrigation avec une solution antimicrobienne de chlorhexidine à 0,02 % (100 ml) ou un témoin salin à 0,9 %. (A) Temps de blocage des modèles de vessie in vitro après l’irrigation. (B) UFC/mL planctonique immédiatement après le traitement d’irrigation. Toutes les données représentent la moyenne de cinq répétitions biologiques. Les barres d’erreur affichent SEM. *p ≤ 0,05 ; **p ≤ 0,01 ; *p ≤ 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les voies urinaires cathétérisées représentent une niche biologique complexe qui peut être difficile à reproduire dans un environnement de laboratoire. Le modèle de vessie in vitro a été conçu dans le but de simuler l’IUCA et utilise des cathéters urinaires standard pour reproduire le système de drainage stérile et fermé utilisé dans la pratique clinique. Les voies urinaires par cathétérisme sont très sensibles aux infections, comme en témoigne le fait que les cathéters urinaires sont le principal facteur de risque de développement de l’infection urinaire 6,55. De même, une technique d’asepsie minutieuse est essentielle au succès de l’exécution de modèles de vessie in vitro. La turbidité des actifs sous gestion est un indicateur clair de stérilité, car les milieux contaminés ou périmés deviendront troubles avec le temps, ce qui obligera à jeter toutes les répétitions. Une technique d’asepsie prudente doit également être utilisée lors de l’inoculation et de l’échantillonnage du modèle de vessie in vitro, car l’ouverture de la chambre centrale pour ajouter l’inoculum préparé rompt le système de drainage stérile et fermé, ce qui rend le modèle de vessie in vitro vulnérable à la contamination. Pour éviter la contamination de la chambre centrale, des cathéters à triple lumière peuvent être utilisés pour échantillonner la population de cellules planctoniques (en fixant la lumière résiduelle et en la drainant via la lumière supplémentaire). On s’attend à ce qu’un certain affouillement se produise dans les 4 heures, mais un dépannage pourrait être nécessaire si aucune cellule planctonique viable n’est dénombrée à ce stade. Si aucune cellule viable n’est dénombrée après 4 heures, il peut être nécessaire d’optimiser la densité de l’inoculum ou la formulation AUM utilisée pour mieux soutenir la colonisation bactérienne. De plus, le lavage de l’inoculum peut indiquer un problème avec le circuit du média ; Des plis à l’intérieur de la tubulure pourraient empêcher un drainage adéquat, entraînant l’accumulation de métabolites toxiques qui peuvent entraver la croissance bactérienne, tandis que tout désinfectant résiduel utilisé pour rincer à travers la tubulure du média pourrait avoir un effet bactéricide.

Ce protocole détaille la préparation de l’AUM telle que décrite précédemment par Nzakizwanayo et al., car elle a déjà été validée pour une utilisation dans le modèle de vessie in vitro avec des agents pathogènes CAUTI proéminents, notamment Proteus mirabilis et Escherichia coli 43,45,46,48 . Cependant, il est possible de modifier la formulation de l’AUM utilisée dans le protocole pour sélectionner la croissance d’autres agents pathogènes. De nombreuses formulations d’AUM diverses ont été publiées et pourraient plutôt être utilisées dans le circuit médiatique 28,56,57,58,59,60. De plus, les AUM dans le réservoir de milieu peuvent être complétées par des nutriments ou des antibiotiques pour sélectionner la croissance d’agents pathogènes spécifiques. Historiquement, les modèles de vessie in vitro ont également été fournis avec de l’urine humaine en pool, cependant, les grands volumes de milieux nécessaires pour exécuter une répétition de modèle de vessie in vitro peuvent rendre la collecte d’échantillons humains peu pratique53,54. De plus, la composition de l’urine humaine peut varier considérablement d’un échantillon à l’autre, ce qui affecte la reproductibilité de l’expérience, car il a été démontré que les différences de concentration d’hormones, de sels et de protéines ainsi que l’état d’hydratation affectent la croissance bactérienne et la formation de biofilms 38,39,61,62.

Le protocole ci-dessus détaille l’inoculation du modèle de vessie in vitro avec ~1010 UFC/ml reproduisant l’IUCA de stade avancé. Cependant, le site d’inoculation du modèle de vessie in vitro pourrait être modifié dans les essais futurs afin de mieux reproduire les stades antérieurs de l’IUCA, c’est-à-dire la colonisation initiale de la sonde urinaire et l’ascension dans la vessie. Le fait de contaminer manuellement les cathéters de Foley avec un inoculum bactérien connu avant la mise en place de modèles in vitro pourrait donner un aperçu des premiers stades de l’infection urinaire aiguë. En effet, la densité de l’inoculum a été modifiée dans des travaux antérieurs pour reproduire l’infection à un stade précoce ; par exemple, Nzakizwanayo et al. inoculé in vitro sur des modèles de vessie avec une UFC/mL de départ inférieure (env. 103 UFC/mL) pour répliquer l’infection à un stade précoce47. Il convient toutefois de noter que la modification de la densité de l’inoculum peut entraîner un délai de blocage prolongé et nécessite une validation supplémentaire avant l’expérimentation.

De plus, alors que le protocole détaille l’inoculation du modèle in vitro avec une monoculture bactérienne, il est possible d’inoculer des modèles avec des agents pathogènes fongiques. Des travaux antérieurs ont suggéré que jusqu’à 8 % des CAUTI résultent d’une infection à Candida spp., qui sont capables de produire des biofilms souvent récalcitrants au traitement antifongique27,63. De plus, le modèle de vessie in vitro peut être modifié pour s’adapter à l’étude de l’IUCA polymicrobienne. En effet, il a été suggéré que jusqu’à 86 % des infections urinaires aiguës sont polymicrobiennes, et ces infections sont souvent associées à des symptômes plus graves et à un taux de mortalité plus élevé que les infections monospécifiques 27,64,65,69. Des modèles in vitro peuvent être inoculés avec plusieurs espèces pour étudier la formation de biofilms polymicrobiens et la progression des CAUTI, mais une validation minutieuse des communautés polymicrobiennes et de la modification de la densité de l’inoculum doit être effectuée avant l’inoculation. Des études antérieures ont utilisé le modèle de vessie in vitro pour surveiller les différences dans la formation de biofilm chez les CAUTI monospécifiques de P. mirabilis par rapport aux CAUTI bispécifiques avec E. faecalis, mettant en évidence l’interaction métabolique entre les souches, ce qui a entraîné une formation accrue de biofilm par rapport à l’infection monospécifique70.

L’un des principaux avantages de l’utilisation du modèle de vessie in vitro pour étudier l’IUCA est la possibilité d’observer la formation d’un biofilm à la surface d’une sonde urinaire standard. La formation de biofilms dans les CAUTI est souvent initiée par la formation de films de conditionnement sur la lumière du cathéter, composés de composants organiques de l’urine auxquels les uropathogènes peuvent adhérer, avant de proliférer et de former des biofilms matures 2,18,71,72,73. Les tests standard utilisés pour étudier la formation du biofilm utilisent souvent des milieux de croissance bactérienne standard plutôt que des sous gestion sous gestion et sont souvent basés sur l’adhérence à des microplaques ou des chevilles en polystyrène, c’est-à-dire le dispositif Calgary ; Cependant, des travaux antérieurs ont suggéré que l’environnement nutritif, le pH et les niveaux d’oxygène du système, ainsi que les propriétés physiques telles que l’écoulement et la différence de structure de surface (silicone vs plastiques), peuvent affecter la formation du biofilm 36,37,74,75,76,77,78. De plus, la culture de bactéries avec une activité d’uréase étendue, comme P. mirabilis dans un système fermé sous AUM, peut entraîner l’accumulation de métabolites toxiques, ce qui peut entraîner la mort cellulaire78,79. Ce phénomène est atténué dans le modèle de vessie in vitro, car l’AUM dans la chambre centrale est constamment remplacée par des milieux frais via le circuit de médias, ce qui permet d’étudier les biofilms des infections urinaires aiguës dans des conditions plus pertinentes sur le plan clinique45. Le fonctionnement quotidien du modèle de vessie in vitro et le critère d’évaluation choisi pour les modèles dépendent en grande partie du fait que les modèles sont inoculés avec des organismes positifs ou négatifs à l’uréase. Théoriquement, les modèles in vitro pourraient fonctionner indéfiniment s’ils sont alimentés avec un volume adéquat d’AUM et si la stérilité du modèle est maintenue ; Cependant, il est recommandé de sélectionner un point final avant l’expérimentation, qu’il s’agisse d’un blocage ou d’un nombre arbitraire de jours. Il est généralement recommandé d’exécuter des modèles in vitro inoculés avec des organismes négatifs à l’uréase pendant ≤7 jours pour simuler l’environnement clinique, car cela est généralement suffisant pour observer la formation de biofilms dans la plupart des organismes, tout en restant conforme aux interventions cliniques, car les meilleures pratiques standard indiquent que les cathéters doivent être remplacés une fois visiblement infectés 1,2, 3, 47, 48. Bien que les organismes positifs à l’uréase soient susceptibles de produire des biofilms cristallins, il existe une grande variation au sein des souches positives à l’uréase dans le temps jusqu’au blocage du modèle de vessie in vitro, certaines souches de Proteus mirabilis provoquant le blocage du cathéter en moins de 10 heures, et d’autres prenant plus de 30 heures pour bloquer39,46. Un test d’uréase standard pourrait être utilisé avant l’expérimentation in vitro sur un modèle de vessie pour déterminer s’il faut exécuter des modèles jusqu’au blocage ou à un critère d’évaluation prédéfini80.

La principale limite de l’utilisation du modèle de vessie in vitro pour étudier la formation du biofilm est peut-être que les mesures du biofilm sont une lecture finale, car elles nécessitent l’ablation et la dissection de la sonde urinaire. À l’inverse, des échantillons de planctonique peuvent être prélevés à partir du modèle de vessie in vitro à n’importe quel moment de l’expérience. De plus, une fois que des échantillons de biofilm sont prélevés à partir des modèles de vessie in vitro, de nombreuses techniques supplémentaires en aval peuvent être utilisées pour mieux quantifier la production de biofilm. Des études antérieures ont utilisé la photométrie de flamme pour quantifier la quantité de calcium et de magnésium présente dans les biofilms cristallins, et des colorants plus complexes peuvent être utilisés pour identifier avec précision les composants de la matrice EPS des biofilms négatifs à l’uréase 45,73,81,82,83,84.

Ce travail décrit également l’application du modèle de vessie in vitro pour étudier les effets des traitements visant à traiter l’infection par la thyroïde due au cancer. Le modèle de vessie in vitro simule des aspects importants du créneau des CAUTI, tels que l’utilisation de l’AUM, ainsi que la formation de biofilms cliniquement pertinents et l’augmentation de la charge organique observée dans les CAUTI. Des traitements tels que les antibiotiques peuvent être ajoutés directement dans le réservoir AUM pour simuler la biodisponibilité cliniquement pertinente des médicaments, et des études antérieures ont utilisé des médicaments repositionnés tels que la thioridazine et la fluoxétine pour démontrer un effet antibiofilm81. De plus, les tests de concentration inhibitrice minimale et les tests de suspension bactérienne sont souvent utilisés pour déduire l’activité antimicrobienne des biocides, bien qu’il y ait peu de preuves suggérant que les tests sont corrélés à la sensibilité réelle aux biocides 41,85,86,87,88. Le modèle de vessie in vitro est avantageux pour l’essai de produits biocides visant à traiter ou à prévenir l’infection urinaire aiguë, car la présence de la sonde urinaire et une simulation plus représentative du créneau de l’infection urinaire aiguë signifient que des produits tels que les gels lubrifiants antimicrobiens et les solutions d’irrigation peuvent être testés selon les instructions du fabricant. Des études antérieures ont également utilisé le modèle de vessie in vitro pour déterminer l’efficacité de la phagothérapie, et ont démontré que le traitement par phages pouvait prolonger le temps de blocage du modèle de vessie in vitro de P. mirabilis de plus de 100 h47. L’utilisation d’un cathéter de Foley de taille standard dans le modèle de vessie in vitro signifie également que de nouveaux cathéters revêtus peuvent être testés pour leur activité antimicrobienne. Travaux antérieurs de Slate et al. démontré que les cathéters recouverts d’un revêtement de ciprofloxacine théranostique pouvaient prolonger le temps d’obstruction de P. mirabilis de ~60 h dans un modèle de vessie in vitro 48. Cela met en évidence l’application potentielle du modèle de vessie in vitro dans l’étude de nouvelles thérapies visant à traiter les infections urinaires aiguës, permettant une évaluation plus précise des antimicrobiens dans une niche d’infections urinaires simulées biologiquement pertinente.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr Jonathan Nzakizwanayo et le Dr Anthony J. Slate pour leur expertise commune dans l’élaboration de ce protocole. Les travaux à l’Université de Bath ont été financés par le Conseil de recherches médicales GW4 Biomed DTP en tant que bourse d’études à V.B. (MR/N0137941/1). B. V. J. est également soutenu par le financement du Dunhill Medical Trust (RPGF1906\171). La recherche de l’O.E.C. a été financée par Kidney Research Northwest (RCR : 1144798). La figure 1 est créée avec Biorender.com.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
313 Extension de tête de pompe à charge rapideWatson-Marlow313Pompe péristaltique - extension de tête de pompe supplémentaire  ;
323S/D Pompe à vitesse variable à commande manuelleWatson-Marlow323S/DPompe péristaltique
3L Sacs de lit, stériles avec robinets à levier  ;Great Bear Healthcare  ;GDW173
Tube en silicone durci au platine de 3 mm de diamètre intérieurFisher10111801Petit tube de circuit AUM (connecter le tube de pompe aux modèles)
Tube en silicone durci au platine de 5 mm de diamètre intérieurFisher10539201Tube de circuit AUM moyen (connecter le tube de pompe au réservoir AUM)
Chlorure d’ammonium (NH4Cl)Fisher11473713
sulfate de sodium anhydre (Na2SO4)Fisher11498717
Azlon Connecteur conique  ;Fisher10712807Utilisé pour connecter différentes longueurs de tubes dans le circuit AUM
Cintres de sacs de lit  ;Great Bear Healthcare  ;10705P
Bochem Pinces à cochon de serrage, diamètre 25 mmFisher11805101
calcium (CaCl2)Fisher10021681
Acide citrique monohydrate  ;MerckC1909-500GUtilisé pour éliminer le biofilm cristallin des modèles après l’expérimentation.
Fisherbrand  ; Pipettes en verre graduées de classe B de type 1Fisher11992168Utilisées pour fournir des modèles de lames in vitro avec AUM via une bonde alésée
GélatineVWR24360.233
Graphpad prism 10GraphPadV10.0Logiciel analytique utilisé pour la représentation graphique des résultats de modèles de vessie in vitro et l’analyse statistique.  ;
Hanna HI 2211-02 pH-mètre de paillassePhillip Harris  ;PP00057414
modèle de vessie  ;--Équipement sur mesure tel que décrit précédemment par Nzakizwanayo et al. (2019).
Instillagel 6 mL gel lubrifiantmydoctorshop.co.uk40-006Gels lubrifiants utilisés à la section 7.1. ; d’autres fournisseurs sont disponibles.
Kartell Plastilab Connecteur conique inégalFisher  ;11914289Utilisé pour raccorder des tubes de différents diamètres
Gélose MacConkey sans sel (déshydratée)Fisher10472643Pour le dénombrement de colonies uniques de bactéries grouillantes, c’est-à-dire Proteus mirabilis
chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2.6H2O)Fisher10386743
phosphate monopotassique (KH2PO4)Connecteur en10573181
Nalgene10186070Utilisé pour faire fonctionner plusieurs circuits AUM à partir d’un seul réservoir AUM (1 à 4 modèles par réservoir)  ;
chlorure de potassium (KCl)Fisher10375810
Bouteille d’aspirateur en pyrex avec douille latérale en verre rodé, capacité : 5000 mLFisher11347884AUM
Bouchons en caoutchouc avec alésage, Diamètre extérieur : 37 mm, Rouge, Diamètre : 37 mmFisher11517612Utilisé dans le réservoir AUM et pour fournir des modèles in vitro avec AUM
Taille 14 Cathéter de Foley français 100 % silicone avec seringue d’eau stérile pour le gonflage  ;Great Bear Healthcare  ;4833-0514
chlorure de sodium (NaCl)Fisher10735921
sodium (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse nettoyant biocide concentré 5L  ;Fisher12447580Utilisé pour stériliser les modèles après l’expérimentation
citrate trisodique (Na3C6H5O7)Fisher11434993
bouillon de soya tryptoneFisher10198002
urée (CH4N2O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9 %B.BraunFB99833Sachet d’irrigation pour vessie saline utilisé à la section 7.2.
Tube en silicone durci au platine Watson-Marlow Pumpsil de 1,6 mm de diamètre intérieur12406280Tube de circuit AUM épais (pour une utilisation dans la pompe perstaltique)
chlorure de , forme de Y Fisher Fisher Réservoir oxalate de Fisher

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Formation de biofilmSondes urinairesR sistance aux antimicrobiensSonde de FoleyObstruction du cath terUnit s formant colonieColoration au cristal violetIrrigation la chlorhexidine

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