Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Identification de la microglie et des macrophages infiltrants périphériques dans la moelle épinière lésée à l’aide de la cytométrie en flux

1.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/67967

⸱

24 juin 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

Dans cet article

Résumé

Il est difficile d’identifier les microglies (MG) et les macrophages infiltrants périphériques (Mø) dans les moelles épinières lésées. Dans ce protocole, la cytométrie en flux (FCM) a été utilisée pour identifier respectivement la MG de type M1, la MG de type M2, la Mø de type M1 et la Mø de type M2. Cette technologie peut également être appliquée à d’autres maladies du système nerveux central pour comprendre le rôle de la MG et de la Mø.

Résumé

Dans une moelle épinière saine, les macrophages infiltrants périphériques sont presque indétectables, et les microglies (MG) participent au maintien de la stabilité du microenvironnement de la moelle épinière par phagocytose, en éliminant les débris cellulaires et en produisant des facteurs neurotrophiques. Après une lésion de la moelle épinière (LM), les MG sont activées et les cellules immunitaires périphériques s’infiltrent dans la moelle épinière blessée. Parmi ces cellules immunitaires, la MG activée et les macrophages infiltrants périphériques (Mø) jouent un rôle crucial dans le processus pathologique de la LME. Ces cellules peuvent être distinguées en phénotypes pro-inflammatoires (de type M1) et anti-inflammatoires (de type M2) ; Cependant, il est difficile de les distinguer en raison de leur similitude de morphologie et de nombreux marqueurs cellulaires. La cytométrie en flux (FCM), une technique largement utilisée dans le domaine biomédical, peut détecter simultanément plusieurs paramètres cellulaires tels que la taille des cellules, la taille des particules, la surface cellulaire et les marqueurs intracellulaires dans une seule expérience. Au fil des années de recherche, FCM a été tenté d’identifier MG et Mø dans la moelle épinière et a été continuellement optimisé pour finalement développer une méthode de détection stable. Cette méthode permet d’identifier les MG de type M1/M2 et M1/M2 après une LME en détectant les profils d’expression de CD45, CD11b, CD68, CCR7 et d’autres marqueurs. Dans ce protocole, les cellules CD11b+CD45−/CD68+CCR7+, CD11b+CD45−/CD68+CCR7-, CD11b+CD45CD68+CCR7+ élevées et CD11b+CD45CD68+CCR7- peuvent être identifiées comme MG de type M1, MG de type M2, M1 de type Mø et Mø de type M2, respectivement.

Introduction

Les lésions de la moelle épinière (LME) sont le résultat de lésions de la moelle épinière causées par diverses raisons. Les lésions médullaires ont un taux élevé d’invalidité et, à l’heure actuelle, il n’existe pas d’options de traitement efficaces, ce qui en fait l’un des problèmes de santé publique les plus graves dans le monde 1,2. Le processus physiopathologique de la LME est complexe, divisé en deux étapes. Initialement, le traumatisme mécanique causé par la blessure provoque immédiatement un dysfonctionnement cellulaire aigu et la mort cellulaire. Ensuite, les dommages secondaires entraînent un dysfonctionnement cellulaire supplémentaire et la mort cellulaire pendant des jours, des semaines, voire des mois. Dans les mécanismes de lésions secondaires, il a été prouvé que l’inflammation est un déterminant clé de la gravité des dommages secondaires, dictant finalement la mort cellulaire et la fonctionnalité cellulaire3. Les caractéristiques des réponses inflammatoires sont l’infiltration et l’activation de cellules inflammatoires dans la moelle épinière blessée, entraînant une augmentation des cellules inflammatoires et des facteurs inflammatoires, créant un microenvironnement inflammatoire et provoquant finalement un dysfonctionnement de la moelle épinière4.

Les microglies du système nerveux central (SNC) et les macrophages infiltrants périphériques jouent un rôle essentiel dans la réponse inflammatoire après une lésion de la moelle épinière (LME)5,6. En tant que macrophages résidents du SNC, les microglies constituent 5 à 10 % des cellules du SNC et sont essentielles à la récupération des lésions médullaires 7,8. La microglie peut engloutir et éliminer les débris cellulaires après une lésion médullaire, favorisant la formation de cicatrices de cicatrisation 9,10. Cependant, une activation excessive de la microglie peut entraîner une réponse inflammatoire soutenue et favoriser la formation de cicatrices gliales, qui entravent la régénération axonale11. Après une lésion médullaire, les microglies activées présentent principalement deux phénotypes : M1-like et M2-like12,13. Le phénotype de type M1 est pro-inflammatoire, favorisant la synthèse des facteurs inflammatoires contribuant à l’apoptose cellulaire et aux lésions secondaires. Les microglies de type M1 ont également des effets neurotoxiques, exacerbant les lésions et l’apoptose neuronale14,15. En revanche, le phénotype de type M2 a des propriétés anti-inflammatoires et favorise l’angiogenèse, la remyélinisation, la croissance axonale et la réparation des tissus16,17. Les microglies de type M2 jouent un rôle crucial dans la modulation de l’inflammation et des processus de réparation.

Les macrophages périphériques s’infiltrent dans le site de la lésion après une lésion médullaire à travers les barrières hémato-moépinières et le système vasculaireendommagés 17,18, régulant davantage la réponse inflammatoire, la phagocytose, la formation de cicatrices et la régénération du tissu neural19,20. Les macrophages infiltrants périphériques peuvent réduire la réponse inflammatoire après une lésion médullaire, phagocyter les débris tissulaires21, favoriser la régénération neurale et le remodelage de la matrice. Cependant, une réponse inflammatoire soutenue médiée par des macrophages infiltrants périphériques peut entraîner des lésions secondaires, ce qui nuit à la récupération à long terme 22,23. Les macrophages infiltrants périphériques de type M1 ont de fortes capacités phagocytaires et de présentation d’antigènes, capables d’éliminer les cellules nécrotiques24. Cependant, leur sécrétion excessive de cytokines pro-inflammatoires, d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et d’espèces réactives de l’azote (RNS) peut endommager les neurones et les cellules gliales, entraînant une apoptose neuronale plus sévère25. À l’inverse, les macrophages infiltrants périphériques de type M2 peuvent inhiber l’apoptose neuronale et atténuer la réponse inflammatoire après une lésion médullaire, favorisant ainsi la réparation du tissu neural26.

Les microglies activées et les macrophages infiltrés à la périphérie après une lésion médullaire présentent des similitudes d’expression morphologique et moléculaire qui les rendent difficiles à différencier. La cytométrie en flux (FCM), une technique largement adoptée, est utilisée pour analyser l’expression de la surface cellulaire et des molécules intracellulaires, identifier différentes sous-populations cellulaires et évaluer simultanément plusieurs paramètres de cellules individuelles. Un test FCM stable a été mis en œuvre pour distinguer les microglies activées des macrophages infiltrés en périphérie, facilitant ainsi l’étude de leurs rôles dans les LME. Cet article décrit la méthode de détection stable qui a été développée.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique des soins aux animaux de l’Université de médecine de Bengbu (n° 2020-050). Les soins aux animaux étaient conformes aux réglementations fournies par le ministère des Sciences et de la Technologie de la Chine. Au total, 18 souris femelles C57/BL6 âgées de huit semaines ont été obtenues et utilisées dans le commerce. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation expérimentale et animale

  1. Hébergez les souris dans des cages ventilées avant l’opération. Maintenez un cycle lumière/obscurité de 12 heures et fournissez un accès libre à la nourriture et à l’eau. Maintenez la température ambiante à 20-22 °C et l’humidité à 30 %-70 % pendant une semaine d’acclimatation.
  2. Stérilisez les instruments chirurgicaux des souris à l’autoclave et séchez-les avant utilisation. Soumettez les instruments et la salle de chirurgie animale à une stérilisation par ultraviolets une demi-heure avant l’opération. Regroupez et étiquetez les souris selon le principe du regroupement aléatoire. Enregistrez et enregistrez leur poids pour une utilisation ultérieure.
  3. Anesthésier les souris avec un cocktail de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritonéale (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Rasez les poils sur le dos des vertèbres T8 à T10.

2. Préparation du modèle de souris LME

  1. Désinfecter la zone chirurgicale à l’aide d’un tampon d’iode de la tête à la queue, en se concentrant sur T9, suivi d’une désinfection avec un tampon d’alcool à 75 %. Faites une incision de 1 cm dans la peau centrée en T9. Disséquez le fascia, le muscle et les ligaments entourant T9 sur 1 cm.
    1. Détachez le muscle adjacent à l’apophyse épineuse T9 pour exposer T9. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, vous pourrez découvrir et retirer la lame entre T9 et T10, en exposant complètement la moelle épinière située à T9, qui mesure environ 2 mm de diamètre.
      REMARQUE : Lorsque vous soulevez la lame T9, assurez-vous que les ciseaux ne touchent pas la moelle épinière.
  2. Stabilisez la colonne vertébrale en serrant les apophyses épineuses de T7 et T11. Créez un modèle de LME modéré à l’aide d’une tige d’un diamètre de 1,3 mm et d’une force de 0,5 N. Observez la queue s’enrouler vers le haut et le membre postérieur se contracter après une LME. Pour les souris opérées fictivement, n’effectuez qu’une laminectomie sans contusion.
  3. Réaliser l’hémostase au site d’incision. Effectuez une fermeture en couches à l’aide de sutures chirurgicales stériles 5-0. Pour une approximation musculaire, saisissez le fascia profond avec une pince Adson avec des dents et suturez la couche du pannicule carnosus à l’aide d’un monofilament résorbable 5-0, en insérant l’aiguille perpendiculairement à 2 mm du bord de la plaie pour obtenir des morsures symétriques de pleine épaisseur (2-3 mm de profondeur) espacées de 3 mm.
    1. Nouez des nœuds carrés avec une tension contrôlée pour aligner les plans fasciaux de manière anatomique. Repositionnez les bords de la peau à l’aide de micro-ciseaux à iris pour créer une éversion épidermique de 1 mm. Alignez précisément le derme à l’aide d’une pince d’horloger et fixez-le à l’aide de simples sutures non résorbables interrompues 5-0 espacées de 2 mm, assurant une coaptation uniforme sans espace mort sous-cutané.
    2. Désinfectez la ligne de suture avec des écouvillons d’iode en utilisant des mouvements unidirectionnels du centre de la plaie vers l’extérieur. Tamponnez doucement le sang résiduel avec de la gaze imbibée d’une solution saline et appliquez une fine couche de pommade antibiotique triple le long de l’incision.
  4. Après la chirurgie, placez les souris dans une cage maintenue à une température et une humidité appropriées. Fournissez des soins d’urine deux fois par jour (matin et soir) pour aider les souris jusqu’à ce qu’elles retrouvent une miction indépendante.
  5. Injectez chaque souris par voie sous-cutanée avec 0,5 ml de solution saline et d’antibiotiques (gentamicine, 2000-2500 U/souris) par jour pour prévenir l’infection.

3. Isolement du tissu de la moelle épinière de souris C57/BL6

  1. Anesthésie les souris avant la chirurgie (étape 1.3). Une fois complètement anesthésiés, fixez-les sur la table d’opération en position couchée. Les souris opérées par placebo sont traitées de la même manière.
  2. Faites une incision transversale dans la cavité thoracique, sous le sternum et le long du diaphragme pour exposer le cœur. Stabilisez doucement le cœur avec des hémostatiques et insérez la canule de perfusion dans le ventricule apical gauche, en l’avançant dans l’aorte.
    1. Coupez immédiatement le pavillon droit et commencez la perfusion à un débit de 250 ml/h avec 10 ml de solution de PBS. La perfusion est considérée comme réussie lorsque le liquide qui s’écoule du pavillon droit passe du rouge sang au clair et incolore, ou lorsque le foie passe du rouge au blanc27.
  3. Transectez la colonne vertébrale à l’extrémité de la queue de la souris pour exposer le foramen vertébral. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, disséquez soigneusement le tissu de la moelle épinière à 0,5 cm au-dessus et en dessous du site de la blessure. Placez le tissu isolé de la moelle épinière dans une boîte de culture stérile et exempte d’enzymes contenant un tampon de coloration à 5 %, et stockez-le sur de la glace à 4 °C pour une utilisation ultérieure dans une centrifugation à gradient de densité de polyvinylpyrrolidone (PVP) enrobée de silice colloïdale.
    REMARQUE : Lorsque vous disséquez la moelle épinière près du centre de la blessure, assurez-vous de l’intégrité du tissu pour éviter de déchirer ou d’endommager la moelle épinière au site de la blessure. Le tampon de coloration à 5 % (SB) se compose de 2,5 mL de sérum de veau fœtal (FBS) et de 47,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).

4. Centrifugation par gradient de densité à l’aide de silice colloïdale recouverte de polyvinylpyrrolidone

  1. Placez le tissu de la moelle épinière dans une passoire à cellules de 300 mailles et broyez-le à l’aide du piston d’une seringue jetable de 5 ml/10 ml. Après le broyage, filtrez la suspension cellulaire à travers la crépine de 300 mailles dans un tube à centrifuger de 15 ml pour la centrifugation (5 min, 110 x g, température ambiante).
    1. Après la centrifugation, ajouter 1 mL de solution de digestion cellulaire de trypsine au sédiment cellulaire et l’incuber dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 15 min. Arrêtez la digestion en ajoutant 1,5 mL de sérum fœtal bovin, puis centrifugez à nouveau (110 x g, 5 min, température ambiante). Remettre en suspension le sédiment cellulaire dans 1 mL de tampon de coloration à 5 % (SB).
  2. Ajouter séquentiellement 4 mL de solution de polyvinylpyrrolidone enrobée de silice colloïdale à 70 %, 4 mL de solution de polyvinylpyrrolidone enrobée de silice colloïdale à 30 % et 1 mL de solution de cellules reconditionnées à 5 % de SB dans un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger le mélange (300 x g, 30 min, 20 °C).
    REMARQUE : Préparez le réactif de séparation de polyvinylpyrrolidone enrobé de silice colloïdale sous forme de mélange 9:1 de polyvinylpyrrolidone enrobé de silice colloïdale et de PBS 10×. Diluer la solution de polyvinylpyrrolidone enrobée de silice colloïdale à 70 % avec du PBS 1× et la solution de polyvinylpyrrolidone enrobée de silice colloïdale à 30 % avec du milieu de culture cellulaire DMEM ou RPMI 1640.
  3. Après la centrifugation, les cellules formeront des couches dans le tube de centrifugation (Figure 1). Jetez les débris cellulaires et les couches de plaquettes au-dessus de la marque d’étalonnage de 8 ml. Aspirez soigneusement le reste de la solution (jusqu’au repère d’étalonnage de 1,5 mL) et jetez les sédiments sous le repère.
    1. Transvaser le reste de la solution dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL et ajouter 1× PBS pour porter le volume total à 15 mL pour la centrifugation (400 x g, 5 min, 4 °C).
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension le sédiment cellulaire dans 5 % de SB. Transférer la solution dans un tube de cytométrie en flux (FCM) pour le lavage et la centrifugation (110 x g, 5 min, 4 °C). Remettre en suspension le sédiment cellulaire dans le tube FCM avec 200 μL de SB à 5 %.

5. Coloration FCM

  1. Répartissez également 200 μL de suspension cellulaire dans deux nouveaux tubes de cytométrie en flux. Étiquetez un tube comme « Contrôle des isotypes » et l’autre comme « Coloration spécifique ».
  2. Procédure de coloration
    1. À la sonde de contrôle des isotypes, ajoutez les anticorps isotypiques suivants : IgG2b kappa pour rat marqué au PE, IgG2b kappa pour rat marqué au FITC, IgG2b kappa pour rat marqué APC et IgG2b kappa pour rat marqué APC-eFluor 780.
    2. Au tube « Coloration Spécifique », ajoutez le panel suivant d’anticorps marqués fluorescents selon les taux de dilution recommandés : Rat anti-souris CD45 APC, Rat anti-souris CD11b PE, Rat anti-souris CD68 FITC et Rat anti-souris CCR7 APC-eFluor 780.
    3. Incuber les tubes à température ambiante, à l’abri de la lumière, pendant 30 min.
  3. Lavez les cellules colorées deux fois en ajoutant 1 ml de SB à chaque fois. Centrifuger les cellules (110 x g, 5 min, 4 °C). Enfin, fixez les cellules avec du paraformaldéhyde (PFA) à 2 % pour l’analyse par cytométrie en flux.

6. Détection FCM

REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, reportez-vous aux rapports précédents27,28.

  1. Analysez les échantillons à l’aide du cytomètre en flux avec le logiciel compatible (voir tableau des matériaux).
    1. Tout d’abord, analysez le tube de contrôle de l’isotype pour établir le graphique primaire (FSC sur l’axe des x et SSC sur l’axe des y). Ajustez les tensions de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) pour positionner la population de cellules dans une plage appropriée.
    2. Configurez deux graphiques supplémentaires : l’un avec IgG-APC sur l’axe des x et l’autre avec les IgG-PE sur l’axe des y. Un autre avec IgG-FITC sur l’axe des x et IgG APC-Cy7 (note : APC-eFluor 780 a été détecté dans ce canal) sur l’axe des y.
    3. Ajustez les tensions des canaux de fluorescence pour les IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC et IgG APC-Cy7 afin de positionner la population cellulaire dans les 103 de la région double négative.
  2. Une fois que les tensions FSC et SSC, ainsi que les tensions des canaux de fluorescence, ont été ajustées et optimisées à l’aide du tube de contrôle d’isotype, ces paramètres doivent rester inchangés. Procédez à l’analyse des tubes expérimentaux colorés par des anticorps.
    1. Établissez un graphique primaire avec CD11b-PE sur l’axe des x et SSC sur l’axe des y. Configurez un autre graphique avec CD68-FITC sur l’axe des x et CCR7 APC-Cy7 sur l’axe des y. À l’aide du tube de contrôle de l’isotype comme référence, définissez les valeurs de référence et délimitez la « région » des cellules CD11b+ . Sur le graphique primaire, contrôlez la région de la cellule CD11b+ et définissez-la comme la « porte P1 ».
    2. Ensuite, sélectionnez le graphique avec CD68-FITC sur l’axe des x et CCR7 APC-Cy7 sur l’axe des y. Cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Afficher la population, puis choisissez P1. Cela affichera les populations cellulaires du groupe CD11b+ qui expriment CD68+/CCR7+ ou CD68+/CCR7-. Collectez 50 000 événements par échantillon.
    3. Après avoir acquis les données, ajustez la compensation de fluorescence si nécessaire. Analysez et déterminez le pourcentage de cellules CD11b+ CD68+ CCR7+ (de type M1) et de cellules CD11b+ CD68+ CCR7- (de type M2). Le pourcentage moyen de cellules marquées positivement est exprimé en pourcentage de la population totale de l’échantillon.
  3. À l’aide des paramètres de tension bien ajustés du tube de contrôle de l’isotype, procédez à l’analyse des tubes expérimentaux.
    1. Tout d’abord, établissez un graphique avec CD45-APC et CD11b-PE, suivi de deux graphiques avec CD68-FITC et CCR7 APC-Cy7. Collectez 50 000 événements par échantillon et, après avoir acquis les données, ajustez la compensation de fluorescence.
    2. Dans les graphiques de pseudo-couleurs CD45/CD11b, analysez les « régions » des cellules CD11b+ CD45−/low et CD11b+ CD45high pour chaque échantillon. Ensuite, analysez les cellules CD68+ CCR7+ et CD68+ CCR7- au sein de ces deux régions.
    3. Intégrez les analyses pour déterminer les pourcentages des populations cellulaires suivantes : CD11b+ CD45−/CD68+ faible, CCR7+ (microglie de type M1), CD11b+ CD45−/CD68+ faible, CCR7- (microglie de type M2), CD11b+ CD45élevé, CD68+ CCR7+ (macrophages de type M1), CD11b+ CD45élevé, CD68+ CCR7- (macrophages de type M2).
      REMARQUE : Le pourcentage moyen de cellules marquées positivement est exprimé en pourcentage de la population totale de l’échantillon.

7. Analyse des données de la FCM

  1. Lancez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux et faites glisser les fichiers d’expérience de cytométrie en flux vers la section « Tous les échantillons » de l’interface. Les expériences de cytométrie en flux seront affichées sous « Tous les échantillons » sur l’interface. Commencez par analyser le tube de contrôle de l’isotype pour déterminer le seuil entre les signaux de fluorescence positifs et négatifs.
    1. Double-cliquez sur l’échantillon du tube de contrôle de l’isotype pour faire apparaître une fenêtre graphique affichant un graphique à points bidimensionnels. Sélectionnez FSC-A pour l’axe des x et SSC-A pour l’axe des y. Cliquez sur le bouton Porte rectangulaire en haut de l’interface et utilisez le rectangle pour sélectionner la zone après avoir retiré les débris cellulaires (Figure 2A).
    2. Double-cliquez sur la zone sélectionnée pour générer une nouvelle fenêtre graphique. Choisissez FITC pour l’axe des x et Histogramme pour l’axe des y. Cliquez sur le bouton Porte de région en haut de l’interface pour définir une porte dans l’histogramme à paramètre unique afin de déterminer le seuil entre les signaux de fluorescence négatifs et positifs. La porte de région définit la zone positive (Figure 2A).
      REMARQUE : La zone avec des valeurs FSC plus petites représente les débris cellulaires.
    3. Pour chacun des quatre anticorps fluorescents utilisés dans l’expérience, déterminez le seuil entre les signaux négatifs et positifs à l’aide de l’échantillon du tube de contrôle isotype. Sur l’axe des x, remplacez séquentiellement les fluorochromes par PE, APC et APC-Cy7, tout en conservant l’axe des y comme histogramme.
    4. Utilisez l’outil de porte de région dans l’histogramme à paramètre unique pour définir les portes et déterminer le seuil entre les signaux négatifs et positifs pour chacun des quatre anticorps fluorescents (Figure 2A).
  2. Pour analyser les proportions de cellules de type M1 et de cellules de type M2 :
    1. Double-cliquez sur l’échantillon du tube expérimental pour faire apparaître un graphique à points bidimensionnel. Sélectionnez FSC-A pour l’axe des x et SSC-A pour l’axe des y. Cliquez sur le bouton Porte rectangulaire en haut de l’interface et utilisez le rectangle pour sélectionner la zone après avoir retiré les débris cellulaires (Figure 2B).
    2. Double-cliquez sur la zone sélectionnée pour générer une nouvelle fenêtre graphique. Choisissez CD11b-PE pour l’axe des x et SSC-A pour l’axe des y. Cliquez sur le bouton Gate rectangulaire en haut de l’interface et, à l’aide du seuil positif ou négatif PE défini par la commande d’isotype comme référence, définissez le gate CD11b+ (Figure 2B).
    3. Double-cliquez sur la zone de porte CD11b+ pour générer une nouvelle fenêtre graphique. Sélectionnez CD68-FITC pour l’axe des x et CCR7 APC-Cy7 pour l’axe des y. Cliquez sur le bouton Porte transversale . À l’aide des seuils positifs/négatifs FITC et APC-Cy7 définis par le contrôle de l’isotype comme références, utilisez la porte croisée pour catégoriser les cellules, en déterminant les proportions de cellules CD11b+ CD68+ CCR7+ (de type M1) et de cellules CD11b+ CD68+ CCR7- (de type M2) (Figure 2B).
      REMARQUE : Les principes de contrôle pour l’analyse des proportions de macrophages de type M1 (M1-like Mø), de macrophages de type M2 (M2-like Mø), de microglie de type M1 (MG-like M1) et de microglia de type M2 (MG-like M2) sont cohérents avec ceux utilisés pour l’analyse des cellules de type M1 et de type M2. Les seuils permettant de distinguer les signaux de fluorescence positifs et négatifs sont basés sur le tube de contrôle de l’isotype, qui sert de référence pour le réglage des portes. Le processus de fonctionnement du logiciel est illustré à la figure 2B, et les profils d’expression de marqueurs utilisés pour déterminer les proportions des cellules sont décrits en détail dans la section des résultats représentatifs.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Les cellules immunitaires du tissu de la moelle épinière sont séparées à l’aide de silice colloïdale recouverte d’une centrifugation à gradient de densité de polyvinylpyrrolidone. Au cours du processus de centrifugation, les cellules sont réparties en différentes couches en fonction de leur densité de flottabilité, ce qui permet de les séparer (Figure 1). De haut en bas, la distribution est la suivante : débris cellulaires, couche riche en cellules mononucléaires, couche riche en lymphocytes...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La création réussie d’un modèle animal SCI est essentielle. Le modèle LME a été établi en exposant la moelle épinière au niveau du segment T9 à une force de 0,5 N. Le succès du modèle animal a été démontré par le recroquevillement de la queue de la souris, les deux membres postérieurs souffrant de spasmes et la paralysie des membres postérieurs, rendant impossible pour la souris de marcher après la LME (voir étape 2.3). Les soins postopératoires sont essentiels à la survie de la souris. ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82072416) ; et le fonds de l’équipe d’innovation scientifique et technologique de haut niveau du premier hôpital affilié de la faculté de médecine de Bengbu (BYYFY2022TD001).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1& fois ; PBS  ; SolarbioRéf. P1020
10&fois ; PBS  ; SolarbioRéf. P1022
18 souris femelles C57/BL6 âgées de huit semaines  ;Cavens Laboratory Animal Ltd, Chang Zhou, Chine
CCR7 anti-souris chez le rat marqué APC-eFluor 780 (IgG2b kappa)Invitrogen47-1971-820,25&mu ; g/test
IgG2b de rat marqué APC-eFluor 780 kappa  ; Contrôle des isotypesInvitrogen47-4321-820,25&mu ; g/test
Anti-souris anti-souris CD45 marqué APC (IgG2b kappa)Invitrogen17-0451-820,125&mu ; g/test
Rat IgG2b marqué APC kappa  ; Contrôle des isotypesInvitrogen17-4031-820,125&mu ; g/test
DMEMGibco11965092
Sérum fœtal bovinLonseraRéf. S711-001
Anti-souris anti-souris CD68 (IgG2b kappa) marqué FITCInvitrogen  ; Référence : MA5-166760,25&mu ; g/test
Rat IgG2b marqué FITC kappa  ; Contrôle des isotypesInvitrogen11-4031-820,25&mu ; g/test
ParaformaldéhydeBiosharp23319084
Anti-souris anti-souris CD11b (IgG2b kappa) marqué PEInvitrogen12-0112-810,25&mu ; g/test
Rat IgG2b marqué PE kappa  ; Contrôle des isotypesInvitrogen12-4031-820,25&mu ; g/test
Percoll  ; SolarbioRéf. P8370
Solution de trypsineBiosharpBL526A

Références

  1. Rubiano, A. M., Carney, N., Chesnut, R., Puyana, J. C. Global neurotrauma research challenges and opportunities. Nature. 527 (7578), S193-S197 (2015).
  2. Fehlings, M., Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clin Epidemiol. 6, 309-331 (2014).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. Immune response following traumatic spinal cord injury: Pathophysiology and therapies. Front Immunol. 13, 1084101(2023).
  4. Sun, X., et al. Multiple organ dysfunction and systemic inflammation after spinal cord injury: A complex relationship. J Neuroinflammation. 13 (1), 260(2016).
  5. Brockie, S., Zhou, C., Fehlings, M. G. Resident immune responses to spinal cord injury: Role of astrocytes and microglia. Neural Regen Res. 19 (8), 1678-1685 (2024).
  6. Wang, Z., Zhou, W., Zhang, Z., Zhang, L., Li, M. Metformin alleviates spinal cord injury by inhibiting nerve cell ferroptosis through upregulation of heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 19 (9), 2041-2049 (2024).
  7. Li, F., et al. Lupenone improves motor dysfunction in spinal cord injury mice through inhibiting the inflammasome activation and pyroptosis in microglia via the nuclear factor kappa B pathway. Neural Regen Res. 19 (8), 1802-1811 (2024).
  8. Zhou, H. -Y., et al. Dynamic development of microglia and macrophages after spinal cord injury. Neural Regen Res. 20 (12), 3606-3619 (2024).
  9. Hakim, R., et al. Spinal cord injury induces permanent reprogramming of microglia into a disease-associated state which contributes to functional recovery. J Neurosci. 41 (40), 8441-8459 (2021).
  10. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096(2022).
  11. Zeng, F., et al. Microglia overexpressing brain-derived neurotrophic factor promote vascular repair and functional recovery in mice after spinal cord injury. Neural Regen Res. , (2024).
  12. Tang, Y., Le, W. Differential roles of M1 and M2 microglia in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol. 53 (2), 1181-1194 (2015).
  13. Butovsky, O., Weiner, H. L. Microglial signatures and their role in health and disease. Nat Rev Neurosci. 19 (10), 622-635 (2018).
  14. Wang, J., He, W., Zhang, J. A richer and more diverse future for microglia phenotypes. Heliyon. 9 (4), e14713(2023).
  15. Zeng, F., et al. Knockout of TNF-α in microglia decreases ferroptosis and convert microglia phenotype after spinal cord injury. Heliyon. 10 (17), e36488(2024).
  16. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  17. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
  18. Hao, D., et al. Trends of epidemiological characteristics of traumatic spinal cord injury in China, 2009-2018. Eur Spine J. 30 (10), 3115-3127 (2021).
  19. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell Mol Life Sci. 72 (21), 4111-4126 (2015).
  20. Kong, X., Gao, J. Macrophage polarization: A key event in the secondary phase of acute spinal cord injury. J Cell Mol Med. 21 (5), 941-954 (2016).
  21. Lech, M., Anders, H. -J. Macrophages and fibrosis: How resident and infiltrating mononuclear phagocytes orchestrate all phases of tissue injury and repair. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1832 (7), 989-997 (2013).
  22. Mosley, R. L., et al. The glial scar-monocyte interplay: A pivotal resolution phase in spinal cord repair. PLoS One. 6 (12), e27969(2011).
  23. Zhu, Y., et al. Hematogenous macrophage depletion reduces the fibrotic scar and increases axonal growth after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 74, 114-125 (2015).
  24. Hou, C., et al. Mono-macrophage-derived MANF protects against lipopolysaccharide-induced acute kidney injury via inhibiting inflammation and renal M1 macrophages. Inflammation. 44 (2), 693-703 (2020).
  25. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  26. Zhang, J., et al. The effects of the M2a macrophage-induced axonal regeneration of neurons by arginase 1. Biosci Rep. 40 (2), BSR20193031(2020).
  27. Li, J. L., et al. The polarization of microglia and infiltrated macrophages in the injured mice spinal cords: A dynamic analysis. PeerJ. 11, e14929(2023).
  28. Gratama, J. W., et al. Analysis of variation in results of flow cytometric lymphocyte immunophenotyping in a multicenter study. Cytometry. 30 (4), 166-177 (1997).
  29. Delarasse, C., Fontaine, B., El-Behi, M., Martin, E. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. (124), e55781(2017).
  30. Chen, Y. J., et al. Temporal kinetics of macrophage polarization in the injured rat spinal cord. J Neurosci Res. 93 (10), 1526-1533 (2015).
  31. Chen, Y. -Q., et al. CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ameliorates murine spinal cord injury by improving local immune microenvironment. J Neuroinflammation. 17 (1), 255(2020).
  32. Vijay, S., Nair, R. R., Sharan, D., Jakkala, K., Ajitkumar, P. Percoll discontinuous density gradient centrifugation method for the fractionation of the subpopulations of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis from in vitro cultures. MethodsX. 11 (7), 102344(2023).
  33. Sharma, A., et al. Successful transplantation of transfected enriched buffalo spermatogonial stem cells to homologous recipients. Theriogenology. 142, 441-449 (2020).
  34. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nat Protoc. 3 (7), 1228-1239 (2008).
  35. Maurer, F., et al. Continuous Percoll gradient centrifugation of erythrocytes: Explanation of cellular bands and compromised age separation. Cells. 11 (8), 1296(2022).
  36. Gamboa-Suárez, B. A., Lotta-Arévalo, I. A., Sarmiento-Salazar, F., Matta, N. E. Finding a needle in a haystack: DNA Haemoproteus columbae enrichment using percoll density gradient and flow cytometry. Vet Parasitol. 328, 110170(2024).
  37. Cao, Y., et al. Paeoniflorin suppresses kidney inflammation by regulating macrophage polarization via KLF4-mediated mitophagy. Phytomedicine. 116, 154901(2023).
  38. Nishihara, T., et al. Chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats causes different activation modes of microglia between the anterior and posterior horns of the spinal cord. Neurochem Int. 134, 104672(2020).
  39. Durafourt, B. A., et al. Comparison of polarization properties of human adult microglia and blood-derived macrophages. Glia. 60 (5), 717-727 (2012).
  40. Wachholz, S., et al. Microglia activation is associated with IFN-alpha induced depressive-like behavior. Brain Behav Immun. 55, 105-113 (2016).
  41. Chen, X., et al. Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics. Acta Biomater. 103, 318-332 (2020).
  42. Guo, S. D., et al. Nasal delivery of Fasudil-modified immune cells exhibits therapeutic potential in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurosci Ther. 25 (6), 783-795 (2019).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Identification des microgliesl sion de la moelle pini recentrifugation sur gradient de densitisolation des cellules immunitairesmarqueur CD11bmarqueur CD68marqueur CCR7ph notypes M1 M2
Identification de la microglie et des macrophages infiltrants périphériques dans la moelle épinière lésée à l’aide de la cytométrie en flux
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.