Article de méthode

Estimation de l’ARN contenant des répétitions télomériques à partir de complexes hybrides ADN/ARN

DOI :

10.3791/67984

⸱

5 décembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole permet l’isolement des hybrides ADN :ARN et de leurs ARN associés (y compris TERRA) à travers plusieurs tissus. Bien que notre approche capture un sous-ensemble d’interactions hybrides, une cartographie génomique supplémentaire serait nécessaire pour une caractérisation complète à l’échelle du génome.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’ARN contenant des répétitions télomériques (TERRA) est un long ARN non codant transcrit à partir de tous les télomères des eucaryotes supérieurs, et seule une partie de ces molécules forme des hybrides ADN/ARN stables aux télomères. Nous avons esquissé un protocole moléculaire détaillé pour identifier et purifier ces estimations hybrides. Cette méthode simplifiée permet l’extraction directe des interactions hybrides ADN/ARN naturellement formées in vivo et peut être appliquée pour détecter toutes ces régions. En minimisant les étapes procédurales, cette technique est très efficace pour isoler l’ARN attaché à l’ADN, estimant la fiabilité et la reproductibilité du séquençage en aval. Le réactif isothiocyanate de guanidine est utilisé pour la lyse et l’homogénéisation totale des cellules, préservant l’intégrité des acides nucléiques (ADN et ARN), en particulier des hybrides ADN/ARN. L’ajout de chloroforme initie la séparation de phase par centrifugation (trois couches distinctes) : une phase phénol-chloroforme inférieure, une interphase et une phase aqueuse supérieure. L’ARN, libéré à la fois par le noyau et le cytoplasme, est retenu dans la phase aqueuse, tandis que l’ADN de poids moléculaire élevé, y compris les régions hybrides ADN/ARN, est confiné à l’interphase. Avec l’alcool isopropylique, suivi de centrifugation, la phase aqueuse (ARN libre), l’interphase et l’ADN, en particulier les hybrides ADN/ARN, sont récupérés. Pour éliminer les traces restantes de protéines, l’échantillon est incubé avec la Protéinase K. Un traitement par DNase, extraction de phénol/chloroforme, alcool isopropylique et centrifugation est utilisé pour libérer l’ARN hybridé en ADN.

Introduction

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La transcription du génome entraîne la formation de molécules hybrides temporaires, appelées R-loops, constituées de structures à trois brins. Ces structures incluent les brins non codants et codants de l’ADN, le brin non codant étant remplacé par la formation d’hybrides avec l’ARNcomplémentaire 1. Lors de la transcription du génome, un grand nombre d’ARN non codants sont produits à des rythmes variables à partir des deux brins d’ADN. La plupart de ces ARN servent d’intermédiaires à courte durée, mais certains jouent un rôle crucial dans les réseaux régulateurs régissant la biologie du génome, en particulier ceux provenant de régions non codantes telles que les télomères et lescentromères 1. La répartition des hybrides ADN/ARN dans le génome peut également refléter l’activité transcriptionnelle des cellules à tout moment.

À mesure que l’intérêt grandit pour les fonctions régulatrices des ARN non codants, la curiosité pour suivre leur transcription et leur distribution à travers le génome grandit, en particulier sous la forme d’hybrides temporaires ADN/ARN. Pour y remédier, nous avons développé un test indépendant pour la détection d’hybrides ADN/ARN stables, applicable à toute cellule ou tissu biologique. Cette méthode permet d’isoler les ARN complémentaires qui co-purifient avec l’ADN, suivie d’une analyse par précipitation PCR ou séquençage.

Des recherches issues de modèles de culture cellulaire ont montré que lors de la réplication et de la transcription de l’ADN, la contrainte de réplication, les dommages à l’ADN, les collisions de fourchettes de réplication et la pause de la polymérase ARN II peuvent se produire en raison d’événements topologiques, structurels et d’hybridation. Ces processus, en particulier le déroulement de la double hélice de l’ADN, introduisent une contrainte torsionnelle, ce qui peut entraîner la formation de structures anormales, telles que des boucles R, lors de latranscription 1.

La plupart des données sur la boucle R ont été générées à l’aide de cellules cancéreuses levures ou cultivées, en s’appuyant sur l’anticorps monoclonal spécifique à l’hybride ADN-ARN, S9.6. Des études structurelles ont montré que le fragment de liaison à l’antigène (Fab) de S9.6 se lie spécifiquement à un hybrideARN-ADN de 13 pb. La détection des R-loops par anticorps a principalement identifié des hybrides qui se forment dans des régions riches en guanine lors de la transcription, où une hybridation ARN-ADN accrue est susceptible de se produire. Des études in vitro utilisant l’anticorps S9.6 suggèrent que les ARN contenant quatre guanines consécutives ou plus près de leur extrémité 5′ sont plus facilement détectables, ce qui est corrélé à une formation accrue de la boucleR 1. Diverses enzymes, telles que les hélicases, topoïsomérases, RNase H1 et RNase H2, aident à maintenir l’équilibre des boucles R pendant la transcription. La perturbation de l’homéostasie des boucles R est liée à une instabilité génomique accrue, contribuant à des maladies comme le cancer et les troublesneurodégénératifs 2.

Les télomères, autrefois considérés comme transcriptionnellement silencieux, ont été identifiés comme transcrivant de longs ARN non codants connus sous le nom d’ARN contenant des répétitions télomériques (TERRA)3. Ces transcripts proviennent de régions subtélomériques et contiennent des répétitions télomériques, jouant un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie destélomères 4. Dans ce manuscrit, nous faisons référence à « ARN TERRA-hybride » comme les molécules d’ARN libérées à partir de complexes hybrides ADN/ARN via un traitement DNase I, présumés inclure des séquences TERRA basées sur les propriétés d’extraction et la spécificité de l’amorce.

La transcription de TERRA se fait dans la direction centromère-télomère et est variable en durée, variant de 100 pb à 9 kb, la majeure partie de TERRA étant récupérée en phase aqueuse sous forme de molécule d’ARN libre. Une petite fraction reste attachée à l’ADN et est associée à des processus biologiques clés, tels que le cancer et levieillissement 4,5. Les niveaux de TERRA varient selon les loci subtélomériques et sont régulés par l’état hétérochromatique destélomères 6. Les études en culture cellulaire indiquent également que les transcrits TERRA provenant de diverses régions subtélomériques présentent une hétérogénéité en longueur. Dans certaines études de culture cellulaire dérivée de tumeurs, les chercheurs ont découvert que la région subtélomérique 20q est la principale source des transcrits TERRA, et que cette région est souvent méthylée à ses îlots CpG 7,8,9. Chez la souris, la région subtélomérique du chromosome 18 est un site majeur de production deTERRA 10,11. De plus, les PAR-TERRA, qui sont des transcrits TERRA provenant de régions pseudo-autosomiques subtélomériques dans les cellules embryonnaires, ont montré qu’ils avaient jusqu’à 200 fois plus de TERRA que les chromosome 18,11, 12.

La transcription de TERRA est contrôlée par la méthylation de l’ADN et des modifications des histones telles que la triméthylation H3K9 et H4K20, qui suppriment TERRA, tandis que l’acétylation des histones est positivement corrélée à la transcriptionTERRA 6,13,14. TERRA se lie également aux régions extratélomériques, y compris les sites intergéniques et les introns, indiquant un rôle plus large dans la régulation dugénome 2.

De plus, la déplétion de TERRA entraîne une dysrégulation de nombreux gènes, en particulier ceux proches de ses sites de liaison, suggérant son rôle dans la régulation épigénétique de la chromatine et l’expressiongénique 2. L’accumulation de TERRA aux télomères raccourcis favorise l’extension des télomères basée sur la recombinaison homologue (HR), contribuant à l’homéostasie de la longueurdes télomères 15,16.

Pour traiter le rôle de TERRA et d’autres hybrides ADN/ARN, nous avons utilisé un test spécifiquement conçu pour isoler des molécules d’ARN hybridées de manière stable à l’ADN. En résumé, les noyaux ont été isolés et traités avec de la RNase sans DNase pour éliminer l’ARN non protégé. Des hybrides ADN/ARN ont ensuite été extraits par digestion sélective de la DNase, qui libère de l’ARN initialement hybridé en ADN. Cette fraction, appelée « ARN hybride associé ADN/ARN », a ensuite été analysée par RNA-seq et comparée à l’ARN soluble total obtenu par extraction standard dephénol-chloroforme 17. Cette approche nous a permis d’identifier à la fois les sites télomériques et non télomériques de formation hybride ARN-ADN, et de comparer les profils transcriptomiques des pools d’ARN lié à l’ADN versus des pools d’ARN solubles. Autrefois considéré comme un simple sous-produit de la transcription des télomères, TERRA est aujourd’hui reconnu pour son double rôle dans le maintien des télomères, influençant l’activité des télomérases et la recombinaison homologue, essentielles à l’homéostasie de la longueur des télomères. De plus, les avancées dans les tests de détection ont permis une compréhension plus détaillée des interactions dynamiques entre l’ARN et l’ADN à travers le génome. Ces connaissances ouvrent la voie à une exploration plus approfondie des implications des hybrides ADN/ARN, tels que TERRA, dans les processus cellulaires et leurs liens potentiels avec des maladies telles que le cancer et les troubles neurodégénératifs. La recherche en cours dans ce domaine approfondira sans aucun doute notre compréhension de la régulation génomique et de sa pertinence pour la santé et la maladie.

La méthode utilisée pour identifier les molécules TERRA et les hybrides ADN/ARN dans cette étude est le même protocole optimisé d’extraction guanidinium-thiocyanate-phénol-chloroforme détaillé ici. Ce protocole a été développé pour permettre l’isolement simultané des hybrides ARN-ADN/ARN, de l’ARN total et de l’ADN génomique au sein d’un flux de travail unifié. En modifiant stratégiquement la méthode classique de séparation triphasée, ce protocole facilite la rétention sélective des hybrides ADN/ARN à l’interphase du phénol, minimisant ainsi leur perte — une limitation inhérente aux techniques d’extraction conventionnelles.

Traditionnellement, la détection et l’isolement des hybrides ADN/ARN reposaient sur l’immunoprécipitation avec l’anticorps monoclonal S9.6, qui reconnaît spécifiquement les structures hybrides ADN/ARN 18,19. Cette approche basée sur S9.6, bien que largement utilisée, peut être limitée par l’accessibilité des anticorps, le coût et la réactivité croisée potentielle. En revanche, notre protocole propose une alternative économique et indépendante des anticorps, facilement applicable aussi bien aux échantillons cellulaires qu’aux tissulaires.

Pour renforcer davantage la pureté et l’intégrité structurelle de la fraction hybride ADN/ARN isolée, nous avons intégré la déprotéinisation médiée par la K par protéinase, suivie d’un traitement par DNase I. La DNase à l’étape I digère sélectivement le brin d’ADN des hybrides ADN/ARN, libérant ainsi l’ARN hybridé pour une isolation ultérieure et une analyse moléculaireen aval 20. Cette approche garantit que les espèces d’ARN récupérées sont spécifiquement celles qui ont été hybridées de manière stable à l’ADN in vivo. Grâce à sa configuration modulaire et à sa scalabilité, notre protocole est largement adaptable à divers contextes biologiques, offrant aux chercheurs un outil robuste pour interroger la biologie hybride ADN/ARN dans un large éventail de systèmes expérimentaux.

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Protocole

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Tous les protocoles expérimentaux impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité d’éthique animale de l’Université Erciyes (numéro de licence 19-07-2019, décision n° 19/127). Des souris Balb/c ont été utilisées dans cette étude : cinq femelles en bonne santé, âgées de 6 semaines (25 g), et cinq mâles, âgées de 8 semaines (30 g). Les souris étaient soignées et traitées selon les Principes de Soins aux Animaux de Laboratoire (règles européennes). L’étude présentée ici a utilisé des échantillons sanguins de 13 sujets témoins sains, issus d’un projet de recherche antérieur ayant reçu l’approbation éthique du Comité d’éthique humaine de l’Université Erciyes (Décision n° 17/002). Un résumé graphique de ce protocole est fourni à la Figure 1. Utilisez des matériaux sans RNase et des techniques aseptiques à toutes les étapes pour minimiser la dégradation de l’ARN.

1. Élevage de souris

  1. Pour déterminer la dose d’anesthésique appropriée nécessaire à l’euthanasie, peser chaque souris et administrer de la kétamine à une dose de 60 mg/kg et de la xylazine à 10 mg/kg par injection intrapéritonéale.
  2. Après administration de l’anesthésie, confirmez l’absence de réflexe de retrait pédalier (pincement de l’orteil) et l’absence de réponse à la stimulation tactile. Une fois l’anesthésie confirmée, effectuer l’euthanasie par luxation cervicale.

2. Échantillons humains

  1. Sélectionnez les participants comme témoins sains après leur dépistage afin d’exclure tout antécédents de maladies chroniques (telles que le diabète, les maladies cardiovasculaires, l’hypertension ou le cancer), les infections aiguës, les troubles auto-immuns ou inflammatoires, les troubles neurologiques ou psychiatriques, ainsi que l’utilisation récente de médicamentssur ordonnance 17.
  2. Prélevez des échantillons de biopsie cutanée dans la zone située derrière le genou (fosse poplitée) de chaque volontaire à l’aide d’un outil de perforation de 2 mm. Administrez une anesthésie locale par voie sous-cutanée avant l’intervention, et effectuez toutes les biopsies dans des conditions stériles.

3. Extraction hybride ADN/ARN de tous types cellulaires

  1. Collecte et lyse des tissus
    1. Pour chaque extraction, utilisez 500 μL de sang cardiaque, un complexe hypothalamo-hypophysaire entier, une glande surrénale entière ou un échantillon de sperme prélevé sur une seule souris.
    2. Transférez tous les échantillons collectés dans des tubes stériles de 1,5 mL. Ajoutez 500 μL de phénol à chaque tube. Échantillons de sang de vortex soigneusement pour mélanger.
      1. Pour les échantillons de tissu, homogénéisez complètement à l’aide d’une seringue de 2 mm jusqu’à ce qu’il ne reste plus aucun fragment visible.
    3. Placez les tubes sur un bloc de refroidissement pour maintenir l’intégrité de l’échantillon.
      REMARQUE : Suivez toujours les consignes de sécurité en laboratoire lors de la manipulation de réactifs dangereux tels que le phénol, le chloroforme et l’acétate d’ammonium.
  2. Séparation de phase
    1. Ajoutez 180 μL de chloroforme à chaque tube et formez brièvement un vortex pour mélanger. Incubez les tubes sur de la glace pendant 15 minutes pour permettre la séparation des phases.
    2. Inspectez les échantillons – assurez-vous que la phase aqueuse semble claire. Si la phase est trouble, reformez un vortex et revenez à la glace pendant 5 minutes supplémentaires.
    3. Centrifugeuse échantillonne à 12 000 × g, 4 °C pendant 15 minutes.
  3. Précipitations de l’ARN
    1. Transférez soigneusement la phase aqueuse claire dans un nouveau tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL placé sur un bloc de refroidissement.
    2. Ajoutez un volume égal (1:1) d’isopropanol à la phase aqueuse, mélangez brièvement un vortex, puis faites couver sur la glace pendant 15 minutes.
    3. Centrifugeuse à 12 000 × g, 4 °C pendant 15 minutes.
      REMARQUE : Le comprimé d’ARN doit être visible au fond du tube.
  4. Lavage de la pelote d’ARN
    1. Inversez soigneusement le tube pour éliminer le surnageant sans déranger la pastille.
    2. Ajoutez 1,5 mL d’éthanol à 70 % au pellet. Tapez doucement le tube pendant 5 secondes pour le laver.
    3. Centrifugeuse à 7 500 × g, 4 °C pendant 5 minutes.
    4. Inversez le tube pour éliminer le surnageant. Répétez le lavage à l’éthanol deux fois (pour un total de trois lavages).
  5. Purification de l’ARN
    1. Après le lavage final à l’éthanol, inversez le tube et laissez sécher à l’air libre tout résiduel d’éthanol ou retirez-le délicatement à la pipette.
    2. Ajoutez 100 μL d’eau sans RNase au comprimé d’ARN et pipettez doucement de haut en bas ou faites un claquement sur le tube pour resuspendre complètement l’ARN.
      REMARQUE : Gardez toujours les échantillons d’ARN sur de la glace ou sur un rack/bloc de refroidissement refroidi pour éviter leur dégradation.
  6. Quantification et stockage de l’ARN
    1. Placez le tube contenant de l’ARN en suspension sur de la glace.
    2. Mesurez la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre. Enregistrez l’absorbance à 260 nm (A260) pour déterminer la concentration d’ARN. Évaluez la pureté en calculant les rapports A260/A280 et A260/A230.
    3. Utilisez uniquement des échantillons d’ARN avec des rapports A260/A280 entre 1,9 et 2,1 pour les applications en aval.
      REMARQUE : Dans cette étude, les concentrations typiques d’ARN variaient de 100 à 180 ng/μL.
    4. Conservez des échantillons d’ARN à −80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
  7. Élimination des protéines et isolement de l’ADN
    1. Après l’isolement de l’ARN, conservez l’interphase de l’étape d’extraction du phénol.
      REMARQUE : Cette étape est nécessaire car l’interphase contient de l’ADN, qui peut être ensuite traité pour l’isolement de l’ADN après ajout de phénol et centrifugation.
    2. Procéder à l’extraction de l’ADN en suivant les étapes 3.2.1-3.4.1, en commençant par l’interphase comme matériau de départ. Transférez soigneusement toute l’interphase (contenant de l’ADN) de l’extraction du phénol vers un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL placé sur une grille de refroidissement.
    3. Digestion des protéines : Ajoutez 0,5 mL de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 100 mM EDTA ; 0,1 % SDS ; 400 μg/mL de Protéinase K) dans le tube. Incubez toute la nuit à 56 °C pour digérer les protéines.
    4. Précipitation selle de l’ADN
      1. Le lendemain, ajoutez 100 μL d’acétate d’ammonium 5 M à chaque échantillon et mélangez brièvement. Centrifugez à 1 788 × g pendant 20 minutes à température ambiante.
      2. Transférez soigneusement la phase aqueuse claire dans un nouveau tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL. Ajoutez un volume égal d’isopropanol de qualité biologique moléculaire (ratio 1:1) à la phase aqueuse, mélangez par inversion douce, puis centrifugez à 1 788 × g pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant sans déranger la pellete d’ADN.
      3. Lavez la pellete d’ADN avec 1 mL d’éthanol à 70 %, puis centrifugez à 1 788 × g pendant 10 minutes.
      4. Retirez et jetez le lavis à l’éthanol. Laissez la pellete d’ADN sécher brièvement l’air.
      5. Resuspendez la pellete d’ADN séchée dans 50 μL d’eau sans nucléase.
  8. Retirez l’acide nucléique libre pour nettoyer l’ADN :
    1. Chargez l’ADN dissous sur une colonne de spin d’ADN. Centrifugez à 15 000 × g pendant 15 s, puis supprimez le flux de travers.
    2. Lavez la colonne deux fois avec 70 % d’éthanol, centrifugant à chaque fois pendant 1 minute à 15 000 × g. Jetez le filtre de passage après chaque lavage.
    3. Transférez la colonne de rotation dans un tube de collecte propre de 1,5 mL. Ajoutez 30 μL d’eau sans nucléase à la matrice colonne, incubez à température ambiante pendant 5 minutes, puis centrifugez pendant 1 minute à 15 000 × g pour éluer l’ADN.
    4. Placez l’ADN élué sur la glace. Divisez l’échantillon en deux tubes : l’un pour le stockage de l’ADN à 4 °C, le second pour l’extraction ultérieure de l’hybride ADN/ARN.
  9. Extraction d’ARN attaché à l’ADN (hybrides ADN/ARN)
    1. Traitement de la DNase
      1. Préparez un mélange digestif de DNase en combinant 5 μL (15 U) de DNase I et 75 μL de tampon de digestion de DNase 10x.
      2. Ajoutez 80 μL du mélange de DNase à la granule d’ADN séchée. Incubez l’échantillon à température ambiante pendant 15 minutes.
    2. Extraction de phénol-chloroforme
      1. Ajoutez 300 μL de phénol à l’échantillon et faites éclore à température ambiante pendant 5 minutes.
      2. Ajoutez 180 μL de chloroforme au mélange et faites couver pendant 5 minutes supplémentaires à température ambiante.
      3. Centrifugez à la vitesse maximale (par exemple, 15 000 × g) pendant 10 minutes à 4 °C pour séparer les phases. Transférez soigneusement la phase aqueuse supérieure (contenant des hybrides ARN :ADN) dans un nouveau tube.
  10. Isolement hybride ADN/ARN
    1. Terminer l’isolement des hybrides ADN/ARN des étapes 3.3 à 3.5.2.
    2. Ajoutez un volume égal (1:1) d’isopropanol à la phase aqueuse, mélangez brièvement un vortex, puis faites couver sur la glace pendant 15 minutes.
    3. Centrifugeuse à 12 000 × g, 4 °C pendant 15 minutes. Cherchez la pastille d’ARN au fond du tube. Inversez soigneusement le tube pour éliminer le surnageant sans déranger la pastille.
    4. Ajoutez 1,5 mL d’éthanol à 70 % au pellet. Tapez doucement le tube pendant 5 secondes pour le laver. Centrifugeuse à 7 500 × g, 4 °C pendant 5 minutes. Inversez le tube pour éliminer le surnageant. Répétez le lavage à l’éthanol deux fois (pour un total de trois lavages).
  11. Purification de l’ARN :
    1. Après le lavage final à l’éthanol, inversez le tube et laissez sécher à l’air libre tout résiduel d’éthanol ou retirez-le délicatement à la pipette.
    2. Ajoutez 30 μL d’eau sans RNase au pellet hybride ADN/ARN et pipettez doucement de haut en bas ou faites un claquement sur le tube pour resuspendre complètement l’ARN.
    3. Conservez des échantillons hybrides ADN/ARN à −80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

4. Synthèse de l’ADNc

REMARQUE : Assurez l’intégrité de l’ARN, de l’ADN intégré et de l’ADN en utilisant des matériaux sans RNase/DNase et en conservant les échantillons sur la glace tout au long de la procédure.

  1. Pour chaque échantillon, utilisez 6 μL (20 ng d’ARN ; isolé à l’étape 3.6.5 pour l’ARN libre ou à l’étape 3.13.3 pour l’ARN hybride ADN/ARN). Transférez le volume requis d’ARN dans des tubes PCR marqués.
  2. Préparez le master mix de synthèse d’ADNc selon les instructions du fabricant du kit. Pour chaque réaction, assurez-vous que le mélange maître contient la transcriptase inverse, les dNTP, les amorces, le tampon et les inhibiteurs de RNase. Pour chaque réaction, combinez 14 μL de mélange maître avec 6 μL de l’échantillon d’ARN dans un tube PCR (volume total : 20 μL par réaction). Inclure au moins un contrôle sans transcriptase inverse (-RT) en préparant une réaction parallèle sans ajouter d’enzyme transcriptase inverse, en utilisant la même quantité d’ARN.
  3. Effectuer la synthèse d’ADNcC dans un thermocycleur en utilisant le programme de température spécifié au Tableau 1.
  4. Diluez l’ADNc obtenu 1:5 avec de l’eau sans nucléase et conservez à −80 °C jusqu’à l’analyse qPCR.

5. Détermination des niveaux d’expression de TERRA via Q-PCR

  1. Préparez le mélange de réaction qPCR à l’aide d’un kit qPCR à base de SYBR Green, en suivant les instructions du fabricant. Pour chaque réaction, combinez 1 μL de SYBR Green Master Mix, 0 μL d’amorce directe pour TERRA (voir Tableau 2), 0 μL d’amorce inverse pour TERRA (voir b), et μL d’eau sans nucléase.
  2. Dispensez 16 μL du mélange de réaction dans chaque puits d’une plaque qPCR à 96 puits.
  3. Ajoutez 4 μL d’ADNc dilué (de l’étape 4.6) à chaque puits, pour un volume de réaction final de 20 μL.
    REMARQUE : Pour chaque échantillon, incluez au moins deux réplications techniques et deux répliques biologiques. Inclure des contrôles sans gabarit (NTC) pour vérifier la contamination et des contrôles sans transcriptase inverse afin d’assurer la spécificité des signaux dérivés de l’ARN.
  4. Effectuez la qPCR en utilisant le programme de température spécifié dans le tableau 3.
  5. Normaliser l’expression de TERRA en β-actine (gène de maintenance) en utilisant la méthode 2-ΔΔCt .

6. Détermination de la longueur des télomères

  1. Préparez le mélange qPCR pour la mesure de la longueur des télomères 21. Pour chaque réaction, combinez 1 μL de SYBR Green Master Mix, 0 μL d’amorce avant des télomères (voir Tableau 2]), 0 μL d’amorce inverse des télomères (voir Tableau 2) et μL d’eau sans nucléase.
  2. Distribuez 16 μL du mélange de réaction télomère dans chaque puits d’une plaque qPCR à 96 puits.
  3. Ajoutez 4 μL d’ADN génomique (de l’étape 3.10.5) à chaque puits, pour un volume de réaction final de 20 μL.
  4. Effectuer la qPCR selon les paramètres de programme appropriés spécifiés par le fabricant (voir Tableau 3).
  5. Parallèlement, mettez en place des réactions pour un gène de référence à copie unique (36B4) en utilisant les mêmes concentrations et volume final.
  6. Des courbes standard ont été générées à l’aide de dilutions sérielées d’un oligonucléotide télomérique synthétique (Tableau 2) pour estimer l’abondance relative et l’efficacité d’amplification. La quantification absolue n’a pas été réalisée. La longueur relative des télomères est calculée comme le rapport T/S (nombre de copies répétées télomères vers nombre de gène à copie unique) en utilisant la méthodeΔCt 21.

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Résultats

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Dans cette étude, nous avons quantifié et comparé les niveaux de TERRA libre, d’hybride ADN/ARN TERRA et de longueur télomère sur plusieurs tissus de souris (sang, spermatozoïde, peau, hypothalamus, hypophyse, surrénal) ainsi que dans des échantillons de sang et de peau humains, afin d’étudier la dynamique tissulaire spécifique et la relation avec la biologie des télomères. Free TERRA a été isolé de la phase aqueuse après extraction de ph...

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Discussion

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Une force centrale du protocole présenté ici réside dans son extraction progressive et sa discrimination de TERRA libre et de TERRA hybride ADN/ARN à partir d’échantillons de tissus complexes. Les étapes cruciales incluent la séparation soigneuse des fractions aqueuse et interphase lors de l’extraction du phénol-chloroforme, car la contamination croisée peut brouiller la distinction entre TERRA libre et hybride. Le traitement subséquent de la fraction d’interphase par DNase I est égaleme...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions l’Unité de Recherche Scientifique de l’Université Erciyes pour son soutien à ce travail avec les numéros de subvention TYL-2019-9224 et TSA-2022-11929.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes PCR de 0,2 mL   ;Greiner671201
Tubes Falcon de 15 mLIsolab078.02.001
Seringue de 2 mLHayatN/A
96 - Plaque multipuitsGreiner50-720-3203
Éthanol absoluMerck1070172511
Acétate d’amonniumSigma238074-500G
Kit de synhésis cDNARoche07 912 439 001
ChloroformeMerck1024451000
DNAse I Kit  ;ZymoE1010
EDTASigmaE9884-1KG
Bouteille en verreIsolabLB. IS.061.01.901
Cylindre graduéIsolab  ; 015.01.901
Guanidine isothiocyanate   ;SigmaG9277-100G
IsopropositionnelMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Tubes microcentrifuges (1,5 mL)Greiner616201
Micropipettes (10 & micro ; L)GilsonFD10001
Micropipettes (100 & micro ; L)GilsonFD10004
Micropipettes (1000 & micro ; L)GilsonFD10003
Micropipettes (2 & micro ; L)GilsonGFAM00064
NanodropShimadzuC101-E112
Tablette PBSSigmaP4417-50TAB
Dispositif PCRSensoquestT3-0140
PGL3 Vecteur de basePromega  ;#212936
Pointes de pipette (10 & micro ; L, 200 & micro ; L, 1000 & micro ; L)Greiner772352
Plaques de Petri en plastiqueGreiner627102
Protéinase KSigmaP6556-10MG
SDSSigma8170342500
Pipette sérologiqueGreiner760107
SpinGilsonPMC880
Maître Sybr GreenRoche4707516001
ThermomixeurEppendorf#5355
Base de TrizmaSigma1503-1KG  ;   ;   ;   ;   ;
TrizolBiorad7326890
Vibrateur Unimax 1010 DTHeidolph543-12310-00-6
VortexHeidolph541-10000-00-1
Colonnes Zymo-Spin IZymoC1003-50

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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