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Article de méthode

Une méthode simple à double tube de centrifugation pour obtenir du plasma riche en plaquettes à partir de sang équin

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DOI :

10.3791/67985

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15 août 2025

 ,  , 
1Grupo de Investigación Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, 2Grupo de Investigación Patología Clínica Veterinaria, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, 3Grupo de Investigación DICOVI, Departamento de Diseño, Universidad de Caldas

Dans cet article

Résumé

Le plasma riche en plaquettes (PRP) est utilisé dans le traitement des troubles musculo-squelettiques équins. Différentes techniques permettent d’obtenir du PRP avec des concentrations variables en plaquettes et en leucocytes. Cet article décrit une méthode pour obtenir du PRP à partir de sang de cheval.

Résumé

Le plasma riche en plaquettes (PRP) est largement utilisé comme traitement de routine pour les affections musculo-squelettiques chroniques chez les chevaux, telles que l’arthrose, les tendinopathies et les desmopathies. Cette efficacité provient de la forte concentration de facteurs de croissance et de cytokines anti-inflammatoires qui sont libérés lors de l’activation de cet agent orthobiologique, qu’il soit activé de manière endogène ou exogène. Malgré sa popularité croissante, il y a une absence notable de vidéos pédagogiques qui démontrent les techniques d’obtention du PRP chez les chevaux.

Cette étude examine une méthode de double tube de centrifugation pour obtenir du PRP chez le cheval. Le sang total de six chevaux a été prélevé dans des tubes de citrate de sodium et centrifugé deux fois à 120 × g pendant 5 min et à 240 × g pendant 5 min. La concentration plaquettaire moyenne pour le PRP était de 360,95 ± 56,31 plaquettes (PLT) × 103/μL, tandis que la concentration moyenne de leucocytes était de 3,05 ± 1,53 cellules × 103/μL. La numération plaquettaire dans le PRP était 2,41 fois plus élevée que dans le sang total, tandis que la concentration de leucocytes dans le PRP était 0,44 fois plus faible. L’efficacité de collecte du PLT dans le PRP était de 17 %, tandis que l’efficacité de la collecte des leucocytes dans le PRP était de 3,1 %. Les concentrations moyennes du facteur de croissance transformant bêta 1 et du facteur de croissance BB dérivé des plaquettes dans le PRP étaient de 2601,82 (intervalle de confiance (IC) à 95 % : 2358,88-2844,76) pg/mL et de 1208,05 (IC à 95 % : 1051,09-1365,02) pg/mL, respectivement. Ces résultats indiquent que le PRP peut être obtenu de manière efficace et reproductible grâce à une méthode simple et rentable adaptée à l’utilisation par les praticiens équins.

Introduction

Le plasma riche en plaquettes (PRP) est un produit orthobiologique couramment utilisé pour traiter les affections musculo-squelettiques équines chroniques telles que les tendinopathies, les desmopathies, l’arthrose et la fourbure 1,2,3. Il est également efficace dans le traitement des plaies des membres et des maladies de la surface oculaire 4,5. La justification de son utilisation est basée sur les concentrations élevées de facteurs de croissance (GF) libérés principalement par les plaquettes6. Les leucocytes contribuent également à la libération de cytokines régulatrices et anti-inflammatoires7. Les GF tels que le facteur de croissance transformant bêta 1 (TGF-β1) et le facteur de croissance dérivé des plaquettes BB (PDGF-BB) exercent de puissants effets anabolisants, prolifératifs, angiogéniques et anti-inflammatoires8. Lors de l’activation exogène ou endogène, le PRP polymérise en un gel riche en plaquettes, facilitant le trafic, l’ancrage et la différenciation cellulaires 6,9. De cette façon, le PRP sert d’échafaudage vivant complexe et pas seulement de récipient pour les GF et les cytokines10.

Plusieurs systèmes classifient les produits PRP utilisés à la fois chez l’homme et le cheval 6,11,12. L’un des systèmes les plus simples et les plus courants catégorise ces hémocomposants en fonction de la concentration leucocytaire11,12. Selon cette classification, les produits PRP avec des concentrations de leucocytes faibles à négligeables et des concentrations plaquettaires faibles à modérées - par rapport aux niveaux dans le sang total du cheval - sont appelés PRP PUR (P-PRP)6,11,12. En revanche, les produits PRP avec des concentrations leucocytaires détectables à élevées et des concentrations plaquettaires modérées à élevées sont appelés plasma riche en leucocytes et en plaquettes (L-PRP)6,11,12.

Les produits P-PRP sont généralement obtenus par centrifugation tube à tube dans laquelle le sang total est prélevé chez les chevaux dans des tubes contenant des anticoagulants tels que le citrate et le citrate de sodium, le phosphate et le dextrose13. Le sang est centrifugé deux fois pour séparer les plaquettes des autres composants14. En revanche, les produits L-PRP sont principalement préparés à l’aide de kits semi-automatisés conçus pour le sang humain, dont certains ont été validés pour une utilisation chez les chevaux 6,15. Ces kits semi-automatisés nécessitent généralement des centrifugeuses spécialisées et sont plus coûteux16, ainsi que des préoccupations potentielles concernant la manipulation aseptique, ce qui peut compliquer leur utilisation pratique en milieu clinique17. De plus, ces kits peuvent entraîner une concentration indésirable de leucocytes ou de globules rouges, ce qui pourrait être préjudiciable dans certaines situations cliniques18. Par exemple, un nombre élevé de leucocytes peut provoquer une inflammation excessive, et une surabondance de globules rouges peut interférer avec le processus de guérison ou entraîner des complications telles que l’irritation ou le rejet des tissus15 ; cependant, une méthode couramment utilisée pour produire du L-PRP équin implique un processus gravitationnel qui ne nécessite pas d’équipement spécialisé19.

À la lumière de ces limitations, des alternatives plus simples et plus rentables pour la préparation du PRP sont hautement souhaitables. Diverses études in vitro, des modèles expérimentaux de maladies musculo-squelettiques et des observations chez les équidés ont montré que les produits P-PRP et L-PRP ont des effets bénéfiques sur les cellules et les tissus traités 1,2,20. Ces produits favorisent la guérison, réduisent l’inflammation et améliorent la régénération des tissus6. Cependant, la décision d’utiliser le P-PRP ou le L-PRP pour traiter un équidé pourrait être influencée par des facteurs techniques et économiques.

Selon les auteurs, il n’existe aucune étude publiée décrivant et démontrant pleinement une procédure étape par étape largement validée pour obtenir un produit PRP à partir de sang équin. Cet article décrit les procédures nécessaires pour prélever en toute sécurité du sang total des chevaux et produire un produit PRP adapté à la fois à une utilisation expérimentale et clinique. Il comprend également la validation de cet orthobiologique par la quantification des plaquettes et des leucocytes et la détermination de la concentration de TGF-β1 et de PDGF-BB, qui font partie intégrante de ses effets thérapeutiques. En standardisant le processus et en démontrant l’efficacité du produit, cette étude cherche à fournir une méthode fiable et accessible aux praticiens équins pour préparer le PRP avec confiance et précision.

Bien que la méthode de double centrifugation pour produire du PRP équin ait été décrite pour la première fois par Argüelles et al.14 en 2006, c’est la première fois que le protocole est présenté dans une vidéo complète. Cette vidéo est destinée à servir de ressource pratique pour les praticiens équins qui font face à des limitations techniques et des contraintes budgétaires qui les empêchent d’utiliser des kits PRP plus sophistiqués et coûteux pour les chevaux atteints de troubles musculo-squelettiques.

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Protocole

Cette étude a été menée conformément aux protocoles internes pour la préparation et l’utilisation du PRP chez les chevaux à l’hôpital d’enseignement vétérinaire de l’Universidad de Caldas, Manizales, Colombie. Cette étude n’a pas nécessité l’approbation du Comité interne de protection des animaux, car les données ont été obtenues à partir de chevaux boiteux traités cliniquement dans notre établissement. Les données de six chevaux créoles colombiens, trois juments et trois hongres, d’un âge moyen de 7,4 (± 2,6) ans ont été utilisées pour développer ce protocole. Les propriétaires des chevaux ont été informés de la nature de l’étude et ont signé un formulaire de consentement éclairé. Tous les chevaux inclus dans l’étude étaient cliniquement sains, à l’exception du problème musculo-squelettique traité. Seuls les animaux dont la numération plaquettaire basale est supérieure à 100 × 103/mL de sang total ont été inclus. Il est important de noter que les chevaux ayant des concentrations plaquettaires plus faibles peuvent être considérés comme thrombocytopéniques14. De plus, ces animaux présentaient des numérations globulaires, des paramètres biochimiques cliniques hépatiques et rénaux normaux et des valeurs d’analyse d’urine dans la plage normale pour l’espèce équine.

1. Restriction du cheval et désinfection de la peau

  1. Pour la sécurité du cheval et du vétérinaire, immobiliser le cheval (Eqqus caballus) en toute sécurité dans une goulotte d’examen clinique ou avec une bride (Figure 1A), en fonction du comportement de l’animal. Ensuite, coupez une zone de cheveux de 5 cm x 5 cm avec un rasoir électrique au milieu d’un côté du cou, sur la veine jugulaire.
    REMARQUE : Certains propriétaires préfèrent que le cheval ne soit pas tondu. Une étude indique qu’il n’est pas nécessaire de couper les cheveux au site de ponction veineuse pour prévenir la contamination bactérienne du P-PRP21. Par conséquent, cette procédure est à la discrétion du vétérinaire.
  2. Effectuer une préparation cutanée préliminaire non stérile sur la zone coupée de la veine jugulaire sur au moins 10 cm à l’aide d’une gaze non stérile et de gants pendant environ 3 min. Appliquez plusieurs morceaux de gaze imbibés de mousse antiseptique en formant un motif circulaire (figure 1B).
  3. Préparez le site de ponction veineuse de manière aseptique à l’aide de gants stériles et de gaze imbibée de désinfectant. Frottez la peau de la région du cou en mouvements circulaires pendant environ 5 min. Nettoyez la zone avec de la gaze stérile imbibée d’alcool éthylique à 95 %.

2. Prélèvement sanguin aseptique

  1. Placez 16 tubes de citrate de sodium de 4,5 ml, préalablement nettoyés avec de la gaze imbibée d’alcool éthylique à 95 %, dans une grille en plastique propre. Imprégnez les capuchons en caoutchouc des tubes à vide avec de l’alcool éthylique à 95 %, en particulier dans l’évidement pour l’accouplement de l’aiguille.
    REMARQUE : En général, huit tubes de citrate de sodium de 4,5 ml sont nécessaires pour obtenir 2,5 ml de PRP. Le nombre de tubes utilisés dans un cas particulier dépendra des tissus mous ou de l’articulation spécifique traitée.
  2. Insérez stérilement une aiguille papillon dans le site jugulaire désinfecté (figure 2A) et fixez des tubes de citrate de sodium de 4,5 ml au support (figure 2B). Secouez doucement les tubes et placez-les dans une grille en plastique.
    REMARQUE : Un tube de citrate de sodium de 4,5 ml est utilisé pour les hémogrammes automatisés et pour préparer le plasma après une centrifugation par centrifugation par centrifugation par centrifugation dure. Ce plasma est ensuite utilisé comme témoin négatif pour les comparaisons de facteurs de croissance et d’enrichissement en cytokines avec le PRP.

3. Approvisionnement en plasma riche en plaquettes

  1. Placez les tubes de citrate de sodium de 4,5 ml contenant du sang total dans un rotor pivotant à quatre places à un angle de 90° dans une centrifugeuse de paillasse. Centrifuger les tubes à 120 × g pendant 5 min à température ambiante. Après la centrifugation, placez les tubes de 4,5 mL contenant du sang citraté et deux tubes simples supplémentaires de 10 mL dans un support et placez le support du côté non dominant de la main de l’opérateur à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire de classe II sur un champ stérile et imperméable.
    REMARQUE : Une étude suggère qu’une hotte à flux laminaire de classe II n’est pas essentielle pour prévenir la contamination bactérienne lors de l’approvisionnement en PRP21. Au lieu de cela, le PRP peut être préparé dans une salle blanche exempte de courants d’air et de poussière. Dans ce scénario, le support de tube sanguin peut être placé sur une table recouverte d’un rideau stérile et imperméable.
  2. Première centrifugation : À l’aide d’un masque facial et de gants stériles, placez une seringue Luer stérile de 10 mL couplée à une aiguille stérile (21 G 5/8") sur le côté dominant de la main à l’intérieur de la hotte à flux laminaire.
    REMARQUE : À partir de ce moment, la main gantée dominante reste toujours stérile, tandis que les capuchons en caoutchouc des tubes de citrate de sodium doivent être retirés à l’aide de la main gantée non dominante.
  3. Insérez l’aiguille stérile dans chaque tube de sang citraté centrifugé sur 3 mm sur la couche leucocytaire (Figure 3A) et aspirez doucement 50 % de la fraction plasmatique, en évitant les turbulences du fluide et l’aspiration du sang. Une fois que 10 mL de plasma de quatre tubes de 4,5 mL ont été aspirés, répartissez-les dans des tubes simples stériles de 5 à 10 mL (figure 3B).
    REMARQUE : Retirez les capuchons en caoutchouc de ces tubes avec la main non dominante et placez-les sur un site stérile du champ ou tenez-les pour éviter la contamination bactérienne.
  4. Deuxième centrifugation : refermer les tubes à l’aide des bouchons en caoutchouc et les placer à l’état équilibré dans un rotor pivotant à quatre places à un angle de 90° dans la centrifugeuse de paillasse et faire tourner ces tubes à 240 × g pendant 5 min à température ambiante.
    REMARQUE : Le choix de la force de centrifugation relative (RCF ou g) est basé sur une étude séminale14 qui a décrit pour la première fois cette méthode d’obtention du PRP à partir de sang équin. De plus, la reproductibilité de cette méthode a été évaluée par d’autres auteurs22.
  5. Placez les tubes dans une grille et positionnez-les du côté non dominant à l’intérieur de la hotte à flux laminaire de classe II, au-dessus du drapé stérile et imperméable préalablement posé.
  6. À l’aide de la main non dominante, retirez les capuchons en caoutchouc et de la main dominante stérile, aspirez lentement les premiers 75 % de plasma à l’aide d’une aiguille spinale de 18 g de 90 mm fixée à une seringue Luer stérile de 10 ml (figure 3C). Jetez cette seringue ou réservez-la pour d’autres utilisations expérimentales ou cliniques car elle contient du plasma pauvre en plaquettes (PPP). Ensuite, fixez l’aiguille spinale stérile précédemment utilisée à une seringue Luer stérile de 5 ou 10 ml pour aspirer le plasma restant (25 %) du tube ordinaire stérile de 5 à 10 ml. Cette fraction est connue sous le nom de P-PRP (Figure 3D).
    REMARQUE : Dans certaines conditions cliniques et expérimentales, une aliquote de 0,5 à 1 mL de PRP est utilisée pour les hémogrammes automatisés suivis d’une analyse du facteur de croissance (TGF-β1 et PDGF-BB) par dosage immuno-enzymatique. La mesure de ces médiateurs peut être effectuée 3 h après l’activation du P-PRP avec des sels de calcium ou de la thrombine23 ou après l’induction de lésions cellulaires par changement de température ou l’ajout de détergents non ioniques24.
  7. Enveloppez la seringue Luer stérile contenant du PRP dans un petit champ stérile imperméable avec une aiguille ou un capuchon stérile attaché pour prévenir la contamination bactérienne du produit orthobiologique (figure 4A).
    REMARQUE : La structure anatomique du cheval à traiter doit être préparée pour l’injection aseptique comme décrit dans la section 1 de ce protocole. Le cheval doit être correctement attaché et mis sous sédatif pour minimiser l’inconfort et assurer la sécurité du cheval et du vétérinaire. Le produit PRP doit être manipulé à l’aide de gants et d’aiguilles stériles et peut être activé ou non selon la préférence du praticien (figure 4B).

4. Analyse statistique

  1. Recueillir des données sur les numérations plaquettaires et leucocytaires dans le sang total et le PRP. Évaluez la normalité des données à l’aide du test de Kolmogorov-Smirnov. Si les données sont distribuées normalement (P > 0,05), comparez et analysez les données de la cellule à l’aide du test t. Si les données sur les concentrations de plaquettes et de leucocytes ne sont pas normalement distribuées (P < 0,05), comparez et analysez les données à l’aide d’un test de Wilcoxon.
  2. Déterminer l’efficacité plaquettaire et leucocytaire dans le P-PRP selon les formules suivantes25 :
    Efficacité de la collecte des plaquettes = figure-protocol-1 × 100
    Efficacité de collecte des leucocytes = figure-protocol-2 × 100
  3. Recueillir des données sur les concentrations de TGF-β1 et de PDGF-BB dans les surnageants plasmatiques (contrôle négatif) du PRP (après 3 h d’activation avec le gluconate de calcium) et les lysats de PRP obtenus par l’ajout d’une solution détergente non ionique.
  4. Utilisez un modèle mixte linéaire généralisé pour comparer les concentrations de facteurs de croissance entre le plasma, les surnageants PRP et le lysat PRP. En cas de différences statistiques significatives, appliquez un test post-hoc de Tukey.
  5. Considérons que p < valeurs de 0,05 sont statistiquement significatives pour tous les tests.

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Résultats

La numération plaquettaire moyenne (plaquettes × 103/μL) était significativement plus élevée dans le PRP que dans le sang total (p < 0,001). En revanche, la concentration moyenne de leucocytes (leucocytes × 103/μL) dans le PRP était significativement plus faible que dans le sang total (p < 0,001) (tableau 1). Plus précisément, la numération plaquettaire dans le PRP était 2,41 fois plus élevée que dans le sang total, tandis que la concentration de leucocytes dans le PRP était 0...

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Discussion

L’utilisation du PRP en médecine humaine et vétérinaire pour le traitement des troubles musculo-squelettiques chroniques augmente 1,8,26,27. Cependant, une critique majeure des applications du PRP dans les contextes expérimentaux et cliniques est le manque de données de base sur les techniques et les protocoles utilisés pour préparer ces hémocomposants

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de l’Universidad de Caldas, Manizales, Colombie pour leur soutien financier pour la publication de cet article.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de prélèvement de sang veineux simples de 10 ml.BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, États-UnisRéf 366430Ce n’est qu’un exemple, des tubes d’autres marques peuvent être utilisés.
Tubes de citrate de sodium de 4,5 mL (105 M/3,2 %)  ;BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, États-Unis107451Ce n’est qu’un exemple, des tubes d’autres marques peuvent être utilisés.
Centrifugeuse de bancRotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, AllemagneD’autres centrifugeuses de banc peuvent être utilisées.
Aiguille papillon (21 G × ; 0,75 po) avec 12 po. tube et support pré-attachéKit de prélèvement de sang Safety-Lok, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, États-UnisRéf 367296Ce n’est qu’un exemple, des aiguilles papillon d’autres marques peuvent être utilisées.
Solution de mousse de chlorhexidine à 2,3-4 %  ;La marque ou le nom commercial de ces produits peuvent varier d’un pays à l’autre.
Hotte à flux laminaire de classe IIThermo Fischer Scientific, Waltham, MA, États-UnisD’autres hottes à flux laminaire de classe II peuvent être utilisées
Lecteur ELISAThermo Fischer Scientific, Waltham, MA, États-Unis
Alcool éthylique à 95 %La marque ou le nom commercial de ces produits peuvent varier d’un pays à l’autre.
Humain PDGF-BB DuoSet ELISAR& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, États-UnisDY220
TGF-bêta humain 1 DouSet ELISAR& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, États-UnisDY240
Solution de mousse de povidone iodée à 4-10 %  ;La marque ou le nom commercial de ces produits peuvent varier d’un pays à l’autre.
Logiciel SPSS 25.0IBM Corp, SPSS, NY, ÉTATS-UNIS
Seringues Luer stériles de différents volumes  ;Discardit Seringue, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, États-UnisCe n’est qu’un exemple, des seringues d’autres marques peuvent être utilisées.
Aiguille spinale stérile (18 G & fois 90 mm)  ;Aiguille de spinelle BD Quincke, Franklin Lakes, NJ, États-UnisCe n’est qu’un exemple, des aiguilles vertébrales d’autres marques peuvent être utilisées.

Références

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