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Article de méthode

Isolement de cellules épithéliales primaires du tubule proximal humain et leur utilisation dans la création d’un modèle microphysiologique du tubule proximal rénal

1.6K vues

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DOI :

10.3791/67997

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9 mai 2025

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1Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, University of Washington, 2Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Washington, 3Kidney Research Institute, Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Washington, 4Barbara T. Murphy Division of Nephrology, Samuel Bronfman Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole optimisé pour le traitement de reins humains entiers afin d’isoler et de cultiver des cellules épithéliales primaires du tubule proximal rénal et l’application de ces cellules dans une plateforme microfluidique microphysiologique tridimensionnelle pour récapituler le tubule proximal rénal.

Résumé

Les maladies rénales touchent plus de 850 millions de personnes dans le monde, dont 37 millions d’Américains. Les facteurs de risque de l’insuffisance rénale chronique comprennent les influences environnementales, les prédispositions génétiques, les conditions médicales coexistantes et des antécédents d’insuffisance rénale aiguë. Ces facteurs prennent souvent des mois ou des années à se développer, ce qui complique les études longitudinales de l’étiologie et de la physiopathologie de la maladie. Des modèles rénaux avancés sont nécessaires pour améliorer notre compréhension des mécanismes de la maladie et améliorer la prédiction de la néphrotoxicité dans le développement de médicaments. Les cellules épithéliales des tubules proximaux (PTEC) dans le rein jouent un rôle essentiel dans l’élimination des xénobiotiques et des toxines ainsi que dans la réabsorption des nutriments essentiels. Nous avons précédemment démontré que des plateformes de systèmes microphysiologiques (MPS) tridimensionnels (3D), peuplées de PTEC primaires isolés, peuvent être utilisées pour étudier les interactions médicamenteuses rénales, évaluer la néphrotoxicité des composés et prédire la clairance des médicaments. Ici, nous présentons des protocoles pour isoler et cultiver des PTEC primaires à partir de reins humains entiers et pour les ensemencer dans une plateforme MPS 3D qui imite la physiologie rénale in vivo . Ce protocole permet des études à long terme soutenant la viabilité des PTEC, la morphologie physiologique et la polarisation fonctionnelle des protéines de transport clés dans les dispositifs MPS pendant une période allant jusqu’à 6 mois.

Introduction

Le rein joue un rôle essentiel dans l’élimination d’un large éventail de xénobiotiques, de toxines et de composés endogènes du corps. Ceci est réalisé en filtrant le sang pour éliminer les déchets et en régulant l’équilibre électrolytique, les niveaux de liquide et le pH. Chaque rein humain contient environ un million de néphrons, les unités structurelles et fonctionnelles du rein1. Au sein de ces néphrons, des cellules épithéliales spécialisées dans les tubules proximaux, appelées cellules épithéliales des tubules proximaux (PTEC), sont responsables de la réabsorption de molécules essentielles telles que le glucose, les acides aminés et les ions, ainsi que de la sécrétion de substrats médicamenteux et de substances potentiellement toxiques dans l’urine 2,3,4. Dans certains cas, les PTEC peuvent également réabsorber les composés de l’urine dans la circulation sanguine4. En raison de leur rôle essentiel dans les interactions médicamenteuses et toxiques, les PTEC primaires isolés des reins humains constituent un outil précieux pour étudier les interactions médicamenteuses rénales (DDI) et évaluer la néphrotoxicité des composés.

La néphrotoxicité induite par les médicaments pose un défi clinique important, car elle peut entraîner des lésions rénales aiguës et des maladies rénales chroniques5. Par conséquent, une compréhension plus approfondie de la physiologie du tubule proximal rénal est essentielle pour prédire et caractériser avec précision le potentiel néphrotoxique des médicaments et des toxines. Les modèles in vitro traditionnels, y compris les lignées cellulaires rénales immortalisées (par exemple, RPTEC-TERT1, HK-2), ont des limites pour imiter la structure complexe et la fonction des tubules proximaux humains6, qui fonctionnent sous un flux laminaire dynamique (avec un faible nombre de Reynolds) et une matrice extracellulaire uniforme (ECM) in vivo 7,8. De plus, les modèles bidimensionnels traditionnels (2D) ne parviennent souvent pas à exprimer fonctionnellement les principaux transporteurs rénaux (par exemple, les transporteurs d’anions organiques 1 et 3 (OAT1 et OAT3), les transporteurs de cations organiques 2 (OCT2)) en raison de la dégradation et de l’internalisation rapides de ces protéines 6,9,10,11 . Les modèles animaux, bien qu’informatifs, peuvent ne pas reproduire entièrement la physiologie rénale humaine et manquent souvent de traduisibilité en raison des différences d’espèces dans l’expression et l’activité du transporteur12. Par exemple, mOct1 est exprimé basolatéralement dans les PTEC de souris, tandis que chez l’homme, l’expression de la protéine membranaire d’OCT1 dans le rein est indétectable13,14.

Les progrès des systèmes microphysiologiques (MPS) et des technologies d’organes sur puce ont permis aux chercheurs de développer des modèles in vitro qui imitent étroitement l’architecture tridimensionnelle (3D) et les conditions d’écoulement dynamique des fluides des organes humains15. Notre groupe a déjà caractérisé deux modèles MPS avec des PTEC16,17, et a utilisé ces modèles pour mener des études de toxicité 18,19,20 et prédire avec précision l’élimination des médicaments 21. L’utilisation de PTEC primaires dans ces modèles offre des avantages significatifs en raison de leur capacité à conserver les caractéristiques fonctionnelles observées in vivo.

Ici, nous présentons les protocoles pour l’isolement des PTEC humains à partir d’un rein humain intact obtenu d’un donneur décédé via une organisation d’approvisionnement en organes approuvée par le United Network for Organ Sharing (UNOS) et l’application de ces PTEC humains cultivés au sein d’une plateforme MPS.

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Protocole

Tous les travaux ont été effectués conformément aux directives de l’Université de Washington sur la manipulation des tissus humains. Les donneurs éligibles doivent répondre aux exigences suivantes : moins de 36 h de temps ischémique à froid (TIC), aucun antécédent connu de maladie rénale, de dialyse ou de toute autre condition médicale (par exemple, diabète sucré de type 1 ou 2, hépatite B, hépatite C, virus de l’immunodéficience humaine (VIH), méningite virale/bactérienne, infection à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline, syphilis, septicémie ou Covid-19). L’ensemble des reins humains utilisés dans cette étude a été prélevé par l’intermédiaire d’un OPO approuvé par l’UNOS.

1. Préparation de l’enceinte de biosécurité

  1. Vaporisez la capuche avec de l’éthanol à 70 %. Décontaminez toutes les surfaces et tous les articles à l’intérieur de l’armoire pour créer un environnement stérile.
  2. Posez des tampons absorbants bleus. Effectuez tous les travaux tissulaires sur ces coussinets.
  3. S’assurer que l’équipement nécessaire est disponible dans l’enceinte de biosécurité et correctement stérilisé (lames de rasoir, pointes de pipette sérologiques, pistolet à pipette sérologique, passoires à cellules de 100 μm, pointes p1000, micropipette de 1000 μL, boîtes de culture circulaires de 15 cm et tubes coniques).

2. Préparation du prétraitement des reins

  1. Préparez la solution de digestion rénale en ajoutant 0,75 mg/mL de collagénase IV + 0,75 mg/mL de dispase II dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) avec du calcium et du magnésium. Filtrez la solution à travers un filtre à membrane stérile de 0,2 μm.
    REMARQUE : Pour un rein adulte humain entier, environ 14 tubes coniques de 50 mL, contenant chacun ~35 mL de solution de digestion (totalisant 500 mL), sont nécessaires.
  2. Préparez le milieu PTEC en ajoutant 4,425 g de poudre de Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 sans glucose, 0,5 g de poudre de D-glucose, 0,6 g de poudre de bicarbonate de sodium, 5 mL de supplément 100x insuline-transferrine-sélénium (contenant 1000 mg/L d’insuline, 550 mg/L de transferrine et 0,67 mg/L de sélénite de sodium), 0,5 mL d’hydrocortisone 50 μM et 5 mL de solution antibiotique-antimycosique 100x (contenant 10000 unités/mL de pénicilline G sodique, 10000 μg/mL de sulfate de streptomycine et 25 μg/mL d’amphotéricine B dans une solution saline à 0,85 %) dans 500 mL d’eau ultrapure (type 1) stérile autoclave. Filtrez le média à travers un filtre à membrane stérile de 0,2 μm. Décongeler le sérum fœtal bovin (FBS) et faire des aliquotes de 10 mL dans 14 tubes coniques de 50 mL.
  3. Rassemblez et étiquetez un ensemble supplémentaire de tubes coniques de 50 ml. À cette étape, assurez-vous qu’il y a 3 ensembles de 14 tubes de 50 ml.
  4. Préchauffez l’agitateur orbital à 37 °C.

3. Isolement des PTEC dans l’ensemble du rein

  1. À l’aide d’une technique stérile, placez le contenant d’expédition contenant l’échantillon de tissu dans la cagoule de biosécurité. Retirez le sac de la boîte et vaporisez l’extérieur avec de l’éthanol à 70 % avant de le mettre dans le capot.
  2. Placez le rein sur un plat de culture rond de 15 cm. Aspirer/jeter les supports restants.
  3. Retirez la graisse environnante et la capsule rénale à l’aide de lames de rasoir stériles. Entaillez doucement la capsule rénale pour créer une fente au centre.
  4. À l’aide d’une pince à épiler, retirez la capsule et utilisez des lames de rasoir pour couper toute graisse attachée au rein. Jetez la capsule et la graisse dans un autre plat de culture de 15 cm.
  5. Séparez le cortex (~1 cm d’épaisseur) de la moelle. Jetez la moelle.
    REMARQUE : Le cortex a une couleur jaune brunâtre plus clair par rapport à la moelle.
  6. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez le tissu enmorceaux de < 1 cm jusqu’à ce qu’il ressemble à une bouillie.
  7. Ajoutez une petite quantité de tampon de digestion rénale dans la coupelle et transférez la bouillie dans la première série de tubes de 50 ml contenant 35 ml de solution de digestion rénale. Répartir uniformément et ne pas dépasser un volume total de 45 mL pour chaque tube.
  8. Transférez tous les tubes sur l’agitateur orbital à 37 °C et incubez pendant 30 min à la vitesse la plus élevée qui ne provoque pas la chute des tubes. Transférez les tubes dans l’enceinte de biosécurité après les avoir pulvérisés avec de l’éthanol à 70 %.
  9. Retournez les tubes pour qu’ils se mélangent et laissez les plus gros morceaux de tissu se déposer au fond. Transférez la plus grande quantité possible de solution dans les tubes coniques de 50 mL contenant 10 mL de sérum fœtal bovin (FBS) sans transférer de tissu intact. Répartir uniformément et ne pas dépasser un volume total de 45 mL pour chaque tube.
  10. Centrifuger les tubes à 200 g pendant 7 min. Remettez les tubes dans l’enceinte de biosécurité après les avoir pulvérisés avec de l’éthanol à 70 %.
  11. Aspirez soigneusement le surnageant. Ajoutez 10 ml de média PTEC dans chaque tube et remettez les granulés en suspension.
  12. Filtrez les suspensions cellulaires résultantes à travers des crépines de cellules de 100 μm dans de nouveaux tubes coniques de 50 mL.
  13. Centrifuger les filtrats de cellules résultants à 400 g pendant 5 min. Remettez les tubes dans l’enceinte de biosécurité après les avoir pulvérisés avec de l’éthanol à 70 %.
  14. Lavez les granulés avec 5 mL de DPBS. Remettez les granulés en suspension à l’aide d’une pointe p1000.
  15. Centrifuger les tubes à 400 g pendant 5 min. Remettez les tubes dans l’enceinte de biosécurité après les avoir pulvérisés avec de l’éthanol à 70 %, puis aspirez les surnageants.
  16. Répétez l’étape 3.15 deux fois de plus pour un total de trois lavages. Ensuite, mettez en suspension les pastilles cellulaires avec 15 mL de milieu PTEC et plaquez les cellules sur des flacons stériles de culture cellulaire T-75.
  17. Étiquetez les flacons de manière appropriée et laissez les cellules se développer dans un incubateur stérile à 37 °C et 5 % de CO2. Laisser les PTEC croître sans être dérangés dans l’incubateur pendant 48 h avant le premier changement de milieu.

4. Changements de médias

  1. Aspirer le milieu des flacons.
  2. Lavez les cellules avec 5 ml de DPBS préchauffé.
  3. Ajouter 5 ml de média PTEC préchauffé dans les flacons T-25.
  4. Remettez la fiole dans l’incubateur.
  5. Changer de milieu toutes les 48 h jusqu’à ce que le ballon atteigne au moins 70 % de confluence pour le passage ou l’utilisation dans des expériences.

5. Passage des PTEC

  1. Aspirer le milieu de la fiole. Ajouter 5 mL de trypsine-EDTA préchauffée à 0,05 % dans chaque fiole T-25 et incuber à 37 °C pendant 1 à 2 minutes pour permettre la digestion de la trypsine.
  2. Une fois les cellules détachées, neutralisez la trypsine avec 5 ml de solution d’inhibiteur de trypsine préchauffée.
  3. Remettre en suspension 5 fois pour déloger les cellules encore attachées au ballon. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans des tubes coniques de 15 mL et centrifugez à 400 g pendant 5 min.
  4. Aspirez le surnageant.
    REMARQUE : Arrêtez-vous ici pour cryoconserver les PTEC et passez à ce protocole.
  5. Remettre en suspension les granulés de cellules avec 14 ml de média PTEC par tube. Transvaser les suspensions cellulaires dans des flacons T-75 (1 tube par ballon).
  6. Effectuez une agitation en T pour répartir uniformément les cellules dans le ballon. Surveillez les cellules et changez de support toutes les 48 h.

6. Cryoconservation des PTEC

  1. Après l’étape 5.6, remettre les pastilles de cellules en suspension dans 2 ml de milieu PTEC à 10 % de DMSO et à 90 % de glucose pour chaque tube conique de 15 mL, et transférer 1 mL dans un flacon cryogénique.
  2. Transférez les cryoflacons dans un récipient de congélation cellulaire qui permet une congélation à température contrôlée et placez le récipient dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h. Après 24 h à -80 °C, transférez les cryoflacons dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme.

7. Décongélation des PTEC

  1. Décongeler le flacon à partir de -80 °C dans le bain-marie à 37 °C. Ne pas décongeler à température ambiante (RT). Une fois que le flacon a été partiellement décongelé (il doit y avoir un petit morceau de glace visible), ajoutez 1 mL de suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL avec 10 mL de milieu PTEC préchauffé.
  2. Faites tourner la suspension cellulaire à 400 g pendant 5 min. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 5 mL de milieu PTEC préchauffé à faible teneur en glucose.
  3. Transférez la suspension cellulaire de 5 mL dans une fiole T-25 et effectuez une agitation en T pour répartir uniformément les cellules dans le ballon. À partir de là, suivez la section 4 pour les modifications de support.

8. Revêtement de l’appareil MPS avec une matrice de collagène de type I

  1. Aspirez le PBS du périphérique MPS et retirez le périphérique du package. Essuyez l’appareil avec des lingettes médicales et étiquetez-le comme vous le souhaitez.
  2. Placez l’appareil MPS dans une boîte de culture circulaire de 15 cm et placez-le à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Gardez les lingettes médicales au fond du plat pour éviter l’humidité sur l’appareil MPS.
  3. Conservez les seringues de 1 ml avec des aiguilles Luer-Lok de 22 g fixées à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour l’injection de collagène I.
  4. Pour quatre appareils MPS à remplir, gardez un tube conique de 15 ml sur de la glace. Utilisez une seringue de 1 mL avec l’aiguille émoussée pour chaque tube conique de 15 mL.
  5. À l’aide d’une technique stérile dans une enceinte de biosécurité, ouvrez tous les ports de l’appareil MPS. Assurez-vous que les fentes en haut de chaque vanne à vis s’alignent verticalement avec l’orifice.
  6. À l’aide d’une seringue ou d’une aiguille de 1 ml, rincez la chambre ECM avec 1 ml d’éthanol dans les orifices #1, #3 et #6. Aspirez l’éthanol et laissez-le s’évaporer complètement (au moins 30 s) afin qu’il ne pénètre pas dans le dispositif MPS à partir des ports #2, #4 et #5.
  7. Remettez le périphérique MPS à 4 °C et maintenez le support PTEC, le M199 et le NaOH 1 N sur la glace.
  8. Calculer la composition matricielle pour 1 mL du mélange de collagène de type I pour environ quatre dispositifs MPS conformément au Tableau 1 (échelle au besoin). Dans l’enceinte de biosécurité, mélangez le milieu PTEC, le M199 et le 1 N NaOH dans cet ordre, selon les calculs ci-dessus, et gardez tous les tubes sur de la glace.
  9. Ajoutez délicatement le stock de collagène de type I à l’aide d’une seringue de 1 ml au mélange préfabriqué. Mélangez le mélange de collagène en pipetant de haut en bas jusqu’à ce que le mélange ait une couleur rose orangé saumon stable.
  10. Centrifugez brièvement le tube pour recueillir la solution au fond. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans la solution.
  11. Placez les seringues pré-réfrigérées de 1 mL avec des émoussures d’aiguille Luer-Lok de 22 g et le dispositif MPS dans l’enceinte de sécurité biologique et sur de la glace. Remplissez la seringue pré-réfrigérée de 1 ml avec le mélange de collagène et évitez complètement les bulles.
  12. Injectez très lentement et doucement la solution de collagène dans les ports #1, #3 et #6 des chambres de l’appareil réfrigéré. Tenez l’appareil verticalement avec les ports vers le bas pour permettre aux bulles d’air de monter et de sortir des ports #2, #4 et #5.
    REMARQUE : Il devrait y avoir une gouttelette du mélange de collagène aux ports #2, #4 et #5, ce qui indique que les chambres sont entièrement revêtues.
  13. Retirez la seringue et remettez-la dans le tube de 15 ml sur de la glace. Tournez le robinet à vis des orifices #2, #4 et #5 pour sceller la puce remplie et placez la puce sur la boîte de culture à 4 °C pendant 30 min.
  14. Après 30 min, transférez les copeaux avec le plat dans l’armoire de biosécurité de manière stérile et étalez les copeaux uniformément et individuellement afin qu’ils se réchauffent uniformément.
  15. Mettez une lingette médicale humidifiée dans chaque boîte (pour éviter que la matrice de collagène I ne se dessèche et ne se décolle des parois de l’appareil MPS) et scellez les boîtes avec un film d’étanchéité flexible semi-transparent. Laissez le collagène polymériser pendant la nuit à RT.

9. Création d’une lumière tubulaire avec du collagène de type IV comme ECM dans un appareil MPS

  1. Stérilisez les tubes C-flex en les rinçant avec de l’eau ultrapure (type 1) et de l’éthanol pur, puis autoclavez toute la gamme de tubes.
  2. Dans l’enceinte de biosécurité, ouvrez tous les ports du dispositif MPS rempli de collagène de type I (la valve à vis sera verticale avec les ports) et retirez le fil dépassant des ports #1, #3 et #6 pour former les lumières tubulaires.
  3. Insérez les coupleurs métalliques dans les ports #1, #3 et #6.
  4. Préparez une solution de 10 mL de collagène de type IV à 5 μg/mL dans un milieu PTEC.
  5. Insérez 24 pouces de tube C-flex stérile sur les émoussés métalliques dépassant des ports #1, #3 et #6.
  6. Remplissez des seringues de 1 ml munies d’une aiguille Luer-Lok émoussée de 22 g avec 0,5 mL de solution de collagène de type IV.
  7. Placez la seringue remplie sur une pompe à perfusion et connectez la tubulure de l’orifice #1 à la seringue. Répétez cette étape pour les ports #3 et #6.
  8. À l’aide du pousse-seringue, administrer la solution de collagène de type IV dans les ports MPS à un débit de 10 μL/min pendant 30 min. Une fois que les ports ont été infusés, laissez le collagène se solidifier dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit avant de les utiliser le lendemain.
    REMARQUE : Les appareils MPS recouverts de collagène de type IV peuvent être stockés jusqu’à 1 semaine à 4 °C.

10. Amorçage de PTEC primaires dans un dispositif MPS

  1. Inspectez l’appareil MPS au microscope pour vous assurer que la lumière s’est correctement formée.
  2. Placez une seringue préstérilisée de 5 ml avec une aiguille de 22 g dans un tube de 15 ml contenant 5 ml d’éthanol.
  3. Procurez-vous une pastille de cellule PTEC dans un tube conique de 15 mL à partir d’une fiole T-25 en suivant les étapes 5.1. à 5.3. Ajoutez 80 μL de média PTEC à la pastille cellulaire et remettez doucement en suspension.
  4. Transférez la suspension cellulaire dans un microtube de 1,5 ml.
  5. Retirez la parabole contenant le dispositif MPS de l’incubateur et placez-la dans l’enceinte de biosécurité. Fermez les ports #2, #4 et #5 et tournez la vanne à vis horizontalement vers les ports.
  6. Agitez doucement le tube contenant du PTEC pour remettre les cellules en suspension. Remplissez la seringue de cellules et insérez l’aiguille dans l’orifice d’injection le plus éloigné des orifices des vannes à vis.
  7. Appuyez doucement sur le piston de la seringue pour injecter les cellules. Visualisez les cellules après l’injection au microscope.
    REMARQUE : Les cellules doivent se déplacer à travers la lumière. Si aucune cellule n’est observée dans la lumière, vérifiez si l’aiguille a été correctement insérée dans l’orifice d’injection et réinsérez l’aiguille si nécessaire. Une seringue pleine de cellules peut remplir les trois lumens de l’appareil.
  8. Continuez les injections de cellules avec les deux autres ports. Après les injections, fermez les ports #2, #4 et #5 et remettez le dispositif MPS dans l’incubateur à 37 °C. Gardez la plaque à niveau afin que les cellules ne se déplacent pas hors de la lumière par gravité.
  9. Pour les dispositifs MPS supplémentaires, laver la seringue à l’éthanol après l’avoir vidée et laver avec du DPBS avant de prélever les cellules.
  10. Laissez les appareils MPS reposer toute la nuit sans être dérangés.
  11. Le lendemain, connectez les appareils MPS aux pousse-seringues.
  12. Dans l’enceinte de biosécurité, remplissez des seringues de 5 ml avec un milieu PTEC. Ensuite, ajustez les embouts Luer-Lok de 22 G avec la section de 24 pouces de tube C-flex fixée aux seringues.
  13. Placez les seringues chargées de fluide PTEC dans le pousse-seringue. Amorcez les lignes pour éliminer les bulles d’air.
  14. Fixez les conduites de tubes amorcées aux orifices #1, #3 et #6 et tournez les vannes à vis en position verticale pour introduire un écoulement de fluide.
  15. Réglez le débit de la pompe à seringue à 0,5 μL/min. Remettez la parabole avec le dispositif MPS dans l’incubateur à 37 °C et laissez les cellules former des tubules (dans les 5 à 7 jours) sous perfusion continue avant de commencer une expérience.

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Résultats

Morphologie et confluence de PTEC primaires isolés dans le temps en culture 2D
Après isolement du cortex rénal, les PTEC ont été laissés se développer sans être dérangés pendant au moins 48 heures avant le premier changement de milieu. Environ une semaine après la culture des cellules, de petits lots de PTEC doivent apparaître dans tout le flacon de culture avec une morphologie épithéliale uniforme semblable à celle d’un pavé (figures 1A,...

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Discussion

Les MPS, ou technologies d’organe sur puce, offrent une plate-forme in vitro très pertinente pour récapituler les aspects clés de la physiologie humaine, réduisant ainsi la dépendance à l’égard des modèles animaux dans le développement de médicaments et les évaluations toxicologiques. Récemment, le FDA Modernization Act 2.0 (2022) a permis l’inclusion du MPS, entre autres alternatives, dans les demandes de nouveaux médicaments expérimentaux29. Ce protocol...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflits d’intérêts ou de divulgations financières pertinents pour cette étude.

Remerciements

Certaines parties de ce travail ont été financées par le contrat 80ARC023CA001 de la NASA, le National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), conjointement par le NCATS et le Center for the Advancement of Science in Space (CASIS) (UG3TR002178), le National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (P30ES00703), le National Institute of General Medical Sciences (T32GM007750), un don sans restriction des Northwest Kidney Centers à la recherche sur le rein et l’École de pharmacie de l’Université de Washington (prix Ji-Ping Wang et bourse Bradley).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 mL de seringues Luer-Lok TipBecton, Dickinson309628
Tubes microcentrifugeuses de 1,5 mLProduits scientifiques CELLTREAT229442
Tube stérile en polypropylène conique de 15 mLFisher Scientific14-959-53A
Dispositif microphysiologique 3DNortisTCC-001
Seringues Luer-Lok Tip de 5 mLBecton, Dickinson309646
Tube stérile en polypropylène conique de 50 mLFisher Scientific12-565-271
Antibiotique-Antimycotique (100x)ThermoFisher Scientific15240062
Collagénase, type IV, poudreThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-glucoseMilliporeSigmaG8270
Inhibiteur de la trypsine définiThermoFisher ScientificR007100
Diméthylsulfoxyde, bioréagent, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II, poudreThermoFisher Scientific17105041
Dulbecco » s MEM (DMEM)/F-12 sans glucoseSciences biologiques de la vie américainesD9807-02
Solution séline tamponnée phosphate (DPBS) de Dulbecco, calcium, magnésiumThermoFisher Scientific14040117
Sérum fœtal bovin (FBS), PremiumThermoFisher ScientificA5670701
Finnpipette F2 Good Laboratory Pipetting (GLP) KitsThermoFisher Scientific05-719-511Micropipettes
Pointes de pipette Fisherbrand SureOne Micropoint, ajustement universel, non filtréFisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
Rein humain entier fraisNovabiosehttps://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/Les reins humains ont été obtenus via Novabiosis, une OPO approuvée par l’UNOS
Incubateur humidifié (37 & degrés ; C et 5 % CO< font class="font6">2)Fisher Scientific51033556
HydrocortisoneMilliporeSigmaH0888
Shaker orbital incubateurAvantor12620-946
Insuline-Transferrine-Sélénium (100X) (ITS -G)ThermoFisher Scientific41400045
Fioles cryogéniques à fil interneCorning430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professionnel34120
Luer Stubs (aiguille émoussée), 22 G x 0,5 pouceInstech Laboratories, Inc.LS22
Moyen 199, Earle’s Salts (10x)ThermoFisher Scientific21180021
Megafuge 8 Petite centrifugeuse de laboratoireThermoFisher Scientific75007210
Coupleur métallique (émoussant)Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Monsieur Frosty Récipient GlacialThermoFisher Scientific5100-0036
Nikon Eclipse Ti-S MicroscopeNikon Instrumentshttps://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/Modèle original arrêté   ;
Gonfles non traitées Nunc : T-25ThermoFisher Scientific169900
Fioles Non traitées Nunc : T-75ThermoFisher Scientific156800
Pipette, 10 mL, graduée, 1/10 mL, stérileGreiner Bio-One607180
Tubulure en silicium, tube C-flex, (DI : 0,020 », diamètre extérieur : 0,083 »)Cole-Parmer06422-00
Lame de rasoir à un seul tranchant (stérile)BiosceauKI-205/50
Sodium BicarbonateMilliporeSigmaS6297
Hydroxyde de sodiumMilliporeSigmaS8045
Unités de filtration jetables stériles avec membranes PESThermoFisher Scientific567-0020
Plats traités en culture tissulaire, 150 mm & nbsp ; x 20 mm VentiléGenesee Scientific25-203
Trypsine-EDTA (0,05 %), phénol rougeThermoFisher Scientific25300054
Collagène de type I, queue de ratCorning354236
Collagène de type IV, sourisCorning354233

Références

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