Protocole de cytométrie par électroporation pour la microscopie à fluorescence de cellules vivantes à l’aide de la culture de cellules U2 OS

Résumé

L’électroporation est l’utilisation de champs électriques pulsés (PEF) pour créer des pores transitoires dans les cultures cellulaires afin d’introduire une cargaison moléculaire. Cette technique est récemment devenue largement utilisée dans la recherche et les milieux cliniques. Nous décrivons ici les techniques d’électroporation utilisant le « système de cytométrie par électroporation » récemment développé pour effectuer la microscopie à fluorescence sur cellules vivantes.

Résumé

Les champs électriques pulsés (PEF) ont un large éventail d’applications dans la recherche médicale et les applications cliniques. Un axe de recherche clé porte sur l’électroporation (réversible ou irréversible). L’électroporation réversible est utilisée depuis plusieurs décennies pour transférer des molécules à travers les membranes cellulaires telles que l’ADN plasmidique, généralement appelé électrotransfert de gènes (GET). À l’inverse, l’électroporation irréversible est devenue une technique populaire dans le traitement du cancer, offrant une alternative non toxique en rompant définitivement les cellules à l’aide de PEF. Cela peut être combiné avec divers types de médicaments ou de réactifs pour renforcer l’effet, ce qui est devenu connu sous le nom d’électrochimiothérapie (ECT). Cependant, malgré le large succès des applications pratiques, il est nécessaire de soutenir davantage la technologie et la recherche pour améliorer les techniques actuelles. Pour résoudre ce problème, un système de cytométrie par électroporation a été développé pour soutenir l’expérimentation de PEF sur cellules vivantes avec la capacité d’effectuer une microscopie à fluorescence à long terme. Cette combinaison a été associée à une lignée cellulaire FUCCI(CA)5 U2-OS exprimant de manière stable pour évaluer les changements dans le cycle cellulaire en réponse à l’exposition au PEF. Ce faisant, une microscopie timelapse allant jusqu’à 30 h a été réalisée, fournissant des changements en temps réel de l’activité cellulaire sur la base du rapporteur FUCCI(CA)5. Par conséquent, les changements spécifiques à la phase ont été quantifiables pour l’analyse en aval.

Introduction

Les champs électriques pulsés (PEF) sont devenus un outil courant pour une variété d’applications en biologie et en applications cliniques¹. Ceux-ci peuvent être classés en deux grandes catégories : l’électroporation (EP) et l’électrostimulation (ES). L’électroporation comporte deux sous-domaines connus sous le nom d’électroporation réversible et irréversible. L’électroporation réversible (ER) est utilisée depuis des décennies comme un outil efficace pour transférer des cargaisons moléculaires telles que l’ADN plasmidique dans des cellules de divers types tels que les mammifères, les bactéries et les levures². Plus récemment, l’électroporation irréversible (IRE) a pris de l’importance en tant qu’alternative non toxique aux traitements actuels du cancer³. Un sous-domaine émergent est celui de l’ablation en champ pulsé (PFA), qui se concentre sur l’ablation non thermique des tissus, en particulier pour traiter certains dysfonctionnements cardiaques⁴. En combinaison avec des médicaments et d’autres réactifs, cela a conduit au développement de l’électrochimiothérapie (ECT). Cependant, la compréhension actuelle des traitements du DEP est dépassée par les applications cliniques⁵. Nous présentons ici un système de cytométrie par électroporation pour l’étude des électrochimiothérapies. Le cycle cellulaire représente un indicateur clé de la viabilité cellulaire, et les changements peuvent identifier des effets spécifiques à une phase. En développant ces outils, les protocoles peuvent être adaptés plus rapidement, ce qui permet d’offrir des traitements plus efficaces pour un plus large éventail de cancers.

Notre système d’électrocytométrie sur mesure (Figure 1) comprend une chambre avec des électrodes à plaque parallèle en aluminium et un fond en verre de protection, ainsi qu’un simple générateur d’impulsions de décroissance exponentielle. La chambre est construite à partir d’une chambre imprimée en 3D et un fond en verre de couverture #1.5 est fixé par un adhésif sensible à la pression de qualité médicale. Les électrodes sont formées d’un film d’aluminium adhésif placé sur des supports intégrés dans la chambre, fournissant deux électrodes parallèles espacées de 0,4 cm. Il s’agit d’une configuration courante pour les électrodes commerciales et fournit une conception robuste qui pourrait rapidement s’adapter aux protocoles actuels. La chambre peut s’adapter à des enceintes environnementales conçues pour des lames de 25 mm x 55 mm, ce qui est également un format de lame courant pris en charge par les fournisseurs de microscopes commerciaux. Le générateur d’impulsions fournit des impulsions de décroissance exponentielle allant jusqu’à 330 V, ce qui permet de réaliser un large éventail d’expériences, y compris l’électroporation réversible et irréversible.

Pour étudier les effets des PEF sur le cycle cellulaire, nous avons utilisé une lignée cellulaire d’ostéosarcome humain transgénique (U2 OS) exprimant l’indicateur de cycle cellulaire d’ubiquitination fluorescente (CA)5 (FUCCI(CA)5), une construction de rapporteur de cycle cellulaire vivant fluorescent. Le système introduit deux formes fluorescentes et tronquées de géminine et de Cdt1, qui sont produites et recyclées à des taux spécifiques au cours du cycle cellulaire. De plus, l’apoptose peut être surveillée directement pendant l’expérience à l’aide d’une lignée FUCCI(CA)5 exprimant de manière stable des cellules U2-OS. Au cours du cycle cellulaire, le rapporteur fonctionne de manière prévisible avec chaque phase, car celles-ci sont produites et dégradées aux mêmes rythmes que les versions fonctionnelles naturellement exprimées dans la cellule. Lorsque l’apoptose se produit, ce cycle est perturbé et le cycle cellulaire s’arrête rapidement. Typiquement, cela se manifestera visuellement par l’arrêt de la fluorescence dans le cycle cellulaire, suivi de changements morphologiques spectaculaires du noyau, qui est clairement visible en raison de la localisation des rapporteurs dans le noyau⁶. Cela permet d’identifier visuellement chaque phase dans des cellules uniques au fil du temps (Figure 2). L’électroporation réversible provoque des changements dans les conditions intracellulaires et une impulsion de décroissance exponentielle de 180 V a été sélectionnée pour l’étude. Cette impulsion a été sélectionnée pour limiter au maximum la mort cellulaire, tout en assurant l’électroporation dans la majorité de la population. Cela a été déterminé sur la base de recherches antérieures portant sur les paramètres optimaux d’impulsion d’électroporation pour six lignées cellulaires de mammifères. La densité d’énergie d’une impulsion de 180 V était légèrement inférieure aux paramètres de transfection optimaux, ce qui permettait une meilleure viabilité cellulaire avec une poration élevée⁷. L’effet de l’impulsion a été étudié dans des cellules non synchronisées et des cellules synchronisées en phase S en utilisant un double bloc de thymidine avec et sans application de PEF (Figure 3). Les résultats ont indiqué une diminution de la longueur moyenne pour S et G2 par rapport au contrôle. Cela indiquait que la phase S était sensible à l’exposition au PEF, ce qui entraînait un cycle cellulaire plus rapide. Cela a démontré que le système de cytométrie par électroporation était capable de combiner l’administration de PEF avec l’imagerie à long terme de cellules vivantes pour l’étude du cycle cellulaire. Bien que nous ayons utilisé cette plateforme pour observer la progression cellulaire à travers le cycle cellulaire en réponse aux PEF, il s’agit d’un outil utile pour étudier une variété d’applications et de conditions pour les PEF et la culture cellulaire.

Protocole

1. Préparation de la culture cellulaire

1. Préparez la ligne stable à l’aide d’une électroporation réversible avec les paramètres suivants : 100 μL de cellules U2 OS remises en suspension (6 × 10⁶ cellules/mL) avec 5 μg d’ADN plasmidique dans une cuvette de 0,4 cm et une impulsion à ondes carrées de 180 V pendant 10 ms.
2. Imprimez D la conception de la chambre personnalisée à l’aide de n’importe quelle imprimante 3D appropriée et d’un plastique biocompatible tel que l’acide polylactique (PLA) (voir le fichier supplémentaire 1). Désinfectez la chambre terminée à l’aide d’éthanol (70 %) et stockez-la dans un récipient stérile avant utilisation.
3. Cultivez des cellules U2-OS FUCCI(CA)5 dans une plaque de 10 cm avec 10 mL de milieu modifié Eagle Media (DMEM)-High Glucose de Dulbecco contenant 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de PenStrep et incubez à 37 °C et 5 % de CO₂.
4. Lorsque la culture atteint 80 % de confluence, aspirez le milieu, lavez la culture cellulaire avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et dissociez les cellules à l’aide de 1 mL de trypsine à 0,25 % pendant 1,5 min.
5. Neutraliser la trypsine en remettant en suspension la culture cellulaire dans 5 mL de DMEM-High Glucose (contenant 10 % de FBS et 1 % de PenStrep).
6. À partir de la culture cellulaire remise en suspension, prélevez un échantillon de 100 μL et placez-le dans la chambre du système de cytométrie par électroporation sur la lamelle de verre inférieure. Assurez-vous que la chambre est confluente à 30 % après l’introduction de l’échantillon. Si l’échantillon semble être trop confluent avant l’incubation, aspirez l’échantillon et réduisez le volume de l’échantillon.
7. Lentement, ajoutez 4 ml de DMEM-High Glucose (contenant 10 % de FBS et 1 % de PenStrep) à l’extrémité de la chambre, empêchant le liquide de rincer l’échantillon.
8. Placez une lame de microscope standard sur le dessus de la chambre et incubez la chambre à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h, en vous assurant que la culture a bien adhéré au fond de la chambre. En option, utilisez Hoechst 33342 (1 μg/mL) pour colorer les noyaux cellulaires afin de faciliter la quantification des cellules en aval ainsi que l’apoptose. Effectuez la coloration 30 minutes avant la microscopie time-lapse.

2. Préparation du microscope

1. Tout d’abord, allumez un microscope à fluorescence inversée avec des commandes environnementales et une chambre, permettant aux conditions de se stabiliser avant d’effectuer l’électroporation.
   REMARQUE : Tout microscope à fluorescence inversée avec un système environnemental pouvant accepter la lame de chambre de 25 mm x 55 mm x 16 mm. La conception a été conçue à l’origine pour fonctionner sur le microscope inversé référencé (voir le tableau des matériaux) et le système environnemental correspondant.
   L’échauffement de la platine peut provoquer une dérive de l’image en raison de la dilatation du métal.
2. Pendant que le système environnemental atteint la température optimale, connectez un multimètre numérique au condensateur du générateur d’impulsions et à l’interrupteur haute tension à l’aide de câbles électriques appropriés. Pour suivre ce protocole, utilisez des câbles à pince « alligator » pour permettre un montage et un démontage rapides avec la chambre d’électroporation.
3. Ensuite, sélectionnez le grossissement 20x et, à l’aide du logiciel du microscope, assurez-vous que les canaux FITC (GFP) et A594 (TexRed/mCherry) (en option, le canal DAPI pour Hoechst 33342) correspondant aux deux protéines fluorescentes du système FUCCI(CA)5 sont sélectionnés. Utilisez des paramètres d’exposition faibles (généralement <0,05 s) pour éviter d’endommager les photos sur des intervalles de temps à long terme.
4. Optimisez la mise au point et la qualité de l’image en prenant des images de test avant de commencer le time-lapse.
   REMARQUE : La fluorescence ne doit être aussi brillante que nécessaire pour la visualisation des couleurs.
5. Programmez le time-lapse pour capturer 3 à 6 points de vue toutes les 10 min pendant 24 h afin d’obtenir un volume élevé de données de cycle cellulaire par time-lapse tout en atténuant les dommages photo.
   REMARQUE : La durée peut varier en fonction de l’échelle de temps de l’activité cellulaire.
6. Assurez-vous que la mise au point automatique est activée pour le canal A594 afin d’obtenir les meilleurs résultats de suivi de la culture cellulaire pendant le time-lapse.
7. Laissez le logiciel en mode veille jusqu’à ce que l’électroporation soit effectuée. Une fois l’impulsion délivrée, activez immédiatement le time-lapse pour garantir la plus grande précision possible des données.

3. Électroporation

1. Placez la chambre de cytométrie d’électroporation dans le microscope avec une chambre environnementale appropriée. Avant l’électroporation, laissez la chambre fermée avec le système environnemental en marche pour vous assurer que le cycle de la cellule n’est pas affecté.
2. Fixez un multimètre numérique au générateur d’impulsions et connectez le générateur d’impulsions aux électrodes de la chambre à l’aide de câbles à pince crocodile en ouvrant la chambre environnementale.
3. Chargez le condensateur dans le générateur d’impulsions à 180 V et déchargez rapidement l’impulsion dans la chambre jusqu’à ce que le multimètre numérique indique 0 volts.
4. Retirez les connexions électriques de la chambre et replacez le couvercle le plus rapidement possible pour assurer de bonnes conditions d’élevage.
5. Activez immédiatement le time-lapse une fois que le système environnemental du microscope est en place.

4. Acquisition de données en accéléré

1. Une fois le time-lapse terminé, utilisez le logiciel du microscope pour enregistrer le time-lapse sous la forme d’une vidéo unique basée sur les images capturées pendant toute la durée du time-lapse. Améliorez la qualité visuelle à ce stade pour faciliter la quantification manuelle.
   REMARQUE : n’importe quelle fréquence d’images peut être sélectionnée ; Cependant, 6 images/s offre une vitesse de relecture modérée avec 1 seconde vidéo pour 1 h de temps réel.
2. Une fois la vidéo time-lapse préparée, suivez les phases de la cellule au fil du temps en observant les changements dans les signaux FITC et A594

Résultats

À l’aide du système FUCCI (Figure 2), les données visuelles du cycle cellulaire ont été obtenues en mesurant la durée pendant laquelle chaque couleur a été exprimée par la cellule à la suite de l’expression et de la débiquitination des protéines. D’après les résultats des expériences non synchronisées et synchronisées (figure 3), il était évident que l’exposition au PEF en phase S régulait à la hausse le cycle cellulaire. Cela a été mis en évidence par la diminu...

Discussion

Lorsqu’elles sont effectuées correctement, les données de phase du cycle cellulaire peuvent être quantifiées pour des volumes élevés de cellules uniques pendant des périodes allant jusqu’à 24 h. Ce protocole a fourni des données comparables sur le cycle cellulaire à d’autres méthodes telles que les FAC. Il s’agit d’une méthode couramment utilisée par laquelle les cellules sont marquées par fluorescence au fur et à mesure de leur progression dans le cycle cellulaire. Après une incubation ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Diapositive de chambre (imprimée en 3D/évaluée)  ;	N/A	N/A
Plaque de culture (10 cm)	Sarstedt	83.3902
Delta Vision	Olympus	N/A	D’autres modèles de microscopes peuvent également être utilisés. S’assurer que la platine et le système environnemental peuvent accueillir la glissière de la chambre d’électroporation (55 mm x  ;
DMEM &ndash ; Sérum		en glucose Gibco
	ThermoFisher	A5256701
Imprimante 3D i3 MK3S	Prusa	N/A	D’autres modèles d’imprimantes peuvent être utilisés qui peuvent utiliser des fichiers STL.  ;
Stylo streptocoque	ThermoFisher	15070063
Phosphate Tamponné Saline	Gibco	10010031
tFUCCI(CA)5	Addgene	153521
Trypsine	Sigma-Aldrich	9002-07-07
U2-OS Lignée cellulaire	ATCC	HTB-96