Article de méthode

Préparation et maintenance d’une expérience de cage bio-exclusion isopositive pour la transplantation fécale humaine chez des souris exemptes de germes

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DOI :

10.3791/68029

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28 février 2025

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1Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, 2Department of Infectious Diseases and Immunology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit les meilleures pratiques pour le transfert et l’hébergement de souris sans germes dans des isolateurs expérimentaux à cage unique (isocages) tout en maintenant des conditions stériles. Les méthodes de transplantation fécale chez des souris exemptes de germes et la collecte de bactéries viables à partir de ces souris intestinales « humanisées » pour d’autres applications sont discutées.

Résumé

Les souris exemptes de germes constituent un outil d’investigation important pour comprendre la contribution des micro-organismes à la santé et à la maladie de l’hôte, car elle permet d’évaluer le rôle spécifique des individus, des groupes définis ou complexes de micro-organismes dans la réponse de l’hôte. Traditionnellement élevées dans des isolateurs à film souple ou semi-rigides, l’élevage de souris exemptes de germes et la manipulation expérimentale sont coûteux et nécessitent de nombreux employés formés et une grande empreinte spatiale dans les installations d’hébergement des animaux. Le système de mise en cage IsoPositive permet de manipuler expérimentalement des souris exemptes de germes dans des cages d’isolement à pression positive (isocages) individuelles hermétiquement fermées, ce qui réduit les coûts et permet une plus grande flexibilité dans les manipulations expérimentales.

Ici, un protocole est décrit pour le transfert de souris exemptes de germes d’isolateurs reproducteurs vers des isocages et le transfert fécal ultérieur des selles d’un donneur humain vers des souris afin de créer des souris intestinales « humanisées » stables à long terme pour des études futures. Les matériaux et la préparation nécessaires à l’utilisation du système d’isocage sont décrits, y compris l’utilisation d’un stérilisant au dioxyde de chlore, d’un stérilisant chimique pour nettoyer les cages, les fournitures, l’équipement et l’équipement de protection individuelle. Les méthodes de confirmation de l’absence de germes des souris transférées et la façon de déterminer la contamination dans le système de cage sont discutées. La procédure d’élevage, y compris la litière, la nourriture et l’approvisionnement en eau, est examinée plus en détail. Le protocole de préparation de la suspension fécale humaine et de gavage chez des souris exemptes de germes pour créer des souris « humanisées » intestinales, ainsi que la collecte de selles pour surveiller la composition de la communauté microbienne de ces souris, sont décrits. Une expérience montre que deux semaines après la transplantation fécale humaine permet une colonisation stable du microbiote du donneur chez les hôtes murins, ce qui permet une utilisation expérimentale ultérieure. De plus, la collecte d’excréments de souris humanisés dans des milieux de préservation de la viabilité, permettant une utilisation dans d’autres expériences fonctionnelles, est décrite. Dans l’ensemble, ces méthodes permettent d’établir de manière sûre et efficace des communautés de souris humanisées dans des cages gnotobiotiques expérimentales pour une manipulation ultérieure.

Introduction

Les souris exemptes de germes sont un outil essentiel dans le répertoire des chercheurs sur le microbiome, car elles permettent de disséquer la contribution du microbiote dans la santé de l’hôte et les états pathologiques. Les souris exemptes de germes naissent complètement stériles et restent axéniques toute leur vie1. La colonisation de souris exemptes de germes par des souches bactériennes spécifiques permet d’étudier les causes à effet entre ces taxons et les fonctions métaboliques, immunitaires ou autres fonctions de l’hôte 2,3,4,5. La capacité d'« humaniser » les souris exemptes de germes au niveau du microbiote en transplantant des matières fécales obtenues de donneurs humains et, lorsqu’elles sont hébergées dans des conditions barrières, d’empêcher la contamination par des micro-organismes dérivés de murins est particulièrement avantageuse1. Cette approche a permis de nombreuses découvertes importantes dans le domaine du microbiome, par exemple, l’effet du microbiome intestinal humain sur la réponse à l’immunothérapie du cancer 6,7,8.

Cependant, bien que les souris humanisées sans germes soient inestimables pour les efforts de recherche dans le domaine du microbiome, de nombreuses limites ont inhibé l’adaptation plus large de cette approche. Les souris exemptes de germes sont élevées et maintenues dans de grands isolateurs semi-rigides ou à film flexible, mais les expériences fonctionnelles nécessitent la mise en place de mini-isolateurs séparés, avec un mini-isolateur abritant plusieurs cages mais seulement dans une seule condition expérimentale. Cette approche de mini-isolant augmente l’empreinte spatiale et le coût tout en limitant considérablement le nombre de conditions expérimentales pouvant être étudiées dans une expérience et le nombre d’expériences pouvant être menées en parallèle. Une solution prometteuse consiste à utiliser un système de cage individuel et modulaire appelé système de bioexclusion ISOcage P (ici appelé système d’isocage)9,10. Le système d’isocage permet de manipuler expérimentalement des souris exemptes de germes dans des cages d’isolement à pression positive individuelles hermétiquement fermées, ce qui permet des conditions expérimentales distinctes entre chaque cage plutôt qu’entre chaque mini-isolateur. Avec la technique d’asepsie appropriée, les animaux peuvent être logés dans des isocages jusqu’à 12 semaines dans des conditions exemptes de germes ou humanisés par transplantation fécale humaine pour être utilisés dans toute approche expérimentale compatible (c’est-à-dire qu’ils peuvent être réalisés dans des conditions aseptiques). Plusieurs expériences indépendantes peuvent être menées en parallèle à l’aide du système d’isocage, et l’encombrement et le coût sont considérablement inférieurs à ceux de plusieurs expériences sur des mini-isolateurs.

Le but de l’élevage de souris sans germes dans des isolateurs de reproduction à film flexible est de préserver soigneusement le statut axénique11. Les techniques utilisées pour surveiller l’état d’absence de germes comprennent des écouvillonnages réguliers des surfaces corporelles et des cavités buccales de souris, ainsi que la collecte aseptique d’échantillons fécaux, qui sont à la fois cultivés et analysés par des tests commerciaux basés sur la PCR. Des tests bactériens, sérologiques et fongiques de ces échantillons sont tous nécessaires pour déterminer l’état d’absence de germes11. Lorsque des souris exemptes de germes sont transférées d’isolateurs de reproduction à des isocages à des fins expérimentales, les souris sont prélevées et testées pour valider leur statut d’absence de germes lors du transfert. Les contrôles de stérilité en isocage sont effectués par le biais d’une collecte aseptique d’échantillons fécaux, qui sont ensuite mis en culture pour détecter les contaminants bactériens, viraux et fongiques. Il est nécessaire de collecter et d’enregistrer soigneusement les résultats de ces contrôles de stérilité de la naissance à la fin d’un protocole expérimental pour valider le statut d’absence de germes de ces souris.

Le système d’isocage est composé de cages individuelles (figure 1), de disques de transfert pour le transport hors des isolateurs d’élevage (figure 1) et du support isocage, qui abrite les cages (figure 2). Chaque isocage contient un filtre HEPA (High Efficiency Particulate Air) au niveau de la cage installé sur l’entrée d’air soufflé et un joint d’étanchéité en silicone qui assure un joint étanche à l’air lorsqu’il est fermé, garantissant qu’aucun contaminant ne peut pénétrer dans la cage par l’air (Figure 1A). Ce couvercle de cage peut être utilisé comme surface de travail stérile lorsqu’il est placé à l’envers dans une enceinte de biosécurité stérilisée (figure 1A). Une grille à l’intérieur de la cage contient la bouteille de nourriture et d’eau (figure 1B). Les pinces autoclavées à l’intérieur de la cage sont utilisées pour toutes les manipulations qui nécessitent un contact avec les surfaces intérieures de la cage. La cage elle-même est munie d’encoches pour un porte-carte de cage amovible permettant d’identifier les animaux à l’extérieur et de buses d’admission et d’exportation d’air qui s’amarrent dans le support isocage (figure 1C-E). Des pinces de fermeture sûres et un verrou à languette sur le couvercle scellent la cage lorsqu’elle est prête à être réamarrée sur le système de rack (Figure 1F). La litière suggérée est de l’Alpha-dri, et une hutte d’enrichissement autoclavable est également recommandée (figure 1F). Les disques de transfert sont utilisés pour déplacer les souris exemptes de germes des isolateurs reproducteurs aux isocages et contiennent un couvercle à compartiment rotatif avec une ouverture triangulaire pour permettre la manipulation des animaux (figure 1G-H). Les disques sont de petite taille (21,6 cm de diamètre) et de grande taille (28 cm de diamètre), qui ont toutes deux une capacité de huit souris. Le ruban autoclave est utilisé pour créer des joints étanches à l’air sur la circonférence et les trous d’aération du disque, ce qui est effectué avant le trempage avec un stérilisant et le transport dans un sac imbibé de stérilisant (figure 1I). Le système de rack lui-même dispose d’un écran pour surveiller les ventilateurs, de l’état du filtre HEPA au niveau du rack et de l’alimentation de la batterie de secours du rack, qui sont toutes des fonctionnalités incluses dans le système (Figure 2A). Une jauge Magnehelic fermée indique la pression positive maintenue par le système de cage, et un indicateur visuel d’amarrage automatique indique l’état d’amarrage des cages (languette jaune sortie signifie qu’aucune cage n’est amarrée ou que le quai n’a pas réussi) (Figure 2B-D). Une enceinte de biosécurité certifiée standard est également nécessaire pour la manipulation des isocages.

Le protocole présenté ici décrit les méthodes appropriées pour réussir le transfert de souris exemptes de germes des isolateurs de reproduction dans des conditions aseptiques aux isocages tout en maintenant le statut exempt de germes, l’humanisation des souris exemptes de germes avec de la boue fécale de donneur humain et la collecte de matières fécales de souris hébergées dans l’isocage pour la confirmation du statut exempt de germes ou la préservation de la viabilité pour des études fonctionnelles ultérieures. Dans cet exemple, des souris exemptes de germes sont humanisées avec des échantillons fécaux groupés de sujets humains traités par immunothérapie pour le cancer du poumon et dichotomisées en tant que répondeurs ou non-répondeurs au traitement. Dans ce cas, le phénotype de la réponse à la réponse d’immunothérapie a été transféré par l’humanisation du microbiote intestinal aux souris receveuses, qui ont ensuite pu être inoculées avec des cellules tumorales et traitées par immunothérapie. Le protocole de suspension fécale humaine peut être facilement adapté à n’importe quel modèle préclinique de donneur humain ou à tout modèle préclinique de maladie souhaité par l’investigateur. À l’aide de ce protocole, il est possible de transférer n’importe quel microbiote fécal humain dans l’hôte exempt de germes, ce qui permet d’approfondir les recherches sur le rôle du microbiote dans la santé et la maladie.

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Figure 1 : Schéma de principe de l’isocage et des disques de transfert. (A) Vue de haut en bas de la face inférieure du couvercle de la cage, avec des étiquettes indiquant l’emplacement du filtre HEPA interne au niveau de la cage et du joint d’étanchéité en silicone. (B) Vue de haut en bas de l’intérieur de la cage, avec des étiquettes indiquant le couvercle de la barre métallique, la bouteille d’eau interne et le bec, ainsi que l’emplacement dans la grille pour contenir la nourriture autoclavable. (C) Vue de face de la cage montrant les encoches du porte-carte de la cage. (D) Vue de haut en bas d’une cage pleine avec le couvercle sur le dessus, montrant comment le filtre HEPA est installé sur la buse d’admission d’air. (E). Vue arrière de la cage montrant les buses d’admission et d’exportation d’air qui s’amarrent au système de rack isocage. (F) Vue latérale d’une cage pleine avec le couvercle sur le dessus, avec des étiquettes indiquant les pinces de fermeture sûres en position ouverte, avec des languettes blanches sur chaque pince qui les verrouillent en place. L’intérieur de la cage montre une litière d’Alpha-dri superposée au fond et une cabane d’enrichissement suggérée placée dans la litière. (G) Vue de haut en bas des disques de transfert avec le couvercle sur le dessus. (H) Vue de haut en bas de l’intérieur du disque de transfert, montrant le couvercle du compartiment rotatif avec une ouverture triangulaire pour permettre la manipulation des animaux. (I) Vue latérale du disque de transfert entièrement assemblé montrant l’emplacement du ruban autoclave, qui crée un joint étanche à l’air pendant le transfert de l’isolateur d’élevage à l’isocage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Schéma de principe du système de rack isocage. (A) Support isocage complet avec cages amarrées et une étiquette indiquant l’écran de surveillance de l’état du ventilateur d’air, du filtre HEPA et de la batterie de secours. Sur le côté inférieur gauche du rack se trouve l’emplacement pour le filtre HEPA au niveau du rack. (B) Manomètre magnéhélique fermé indiquant la pression positive maintenue par le rack. (C) Une isocage amarrée sans indicateur d’amarrage jaune visible, démontrant une connexion réussie entre le rack et les buses d’air. (D) Une fente vide dans le rack, avec un indicateur visuel visuel visible d’amarrage automatique indiquant qu’aucun rack n’est en place et qu’il n’y a pas de connexion des buses d’air avec une isocage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Floride (UF) et réalisées dans les installations de soins aux animaux de l’UF (IACUC Protocol #IACUC202300000005). Les colonies de plantes de type sauvage exemptes de germes (GF WT ; C57BL/6) ont été élevées et maintenues en isolateurs par la division exempte de germes des services de soins aux animaux de l’UF. Des souris GF WT mixtes ont été transférées des isolateurs d’élevage et placées dans le système de bioexclusion ISOcage P pour permettre la manipulation microbienne.

Des échantillons de matières fécales humaines ont été obtenus à partir d’une étude observationnelle prospective qui a recueilli des échantillons de selles longitudinales de patients ayant reçu un traitement par inhibiteur de point de contrôle immunitaire (ICI)12. Le consentement éclairé a été obtenu des patients après l’approbation de l’étude par Advarra IRB (MCC # 18611, Pro00017235). Les sujets ont reçu et rempli un kit de prélèvement de selles en milieu de transport dentaire liquide (LDTM) destiné à préserver la viabilité bactérienne pour les études fonctionnelles. L’évaluation de la réponse a caractérisé n=4 échantillons comme répondeurs (R) et n=6 comme non-répondeurs (NR). Les échantillons de patients homogénéisés conservés par LDTM ont été décongelés individuellement, chacun placé dans une chambre anaérobie pendant pas plus de 90 s et regroupé par phénotype de réponse (R : n = 4, NR : n = 6). Les échantillons groupés ont ensuite été aliquotes et congelés à -80 °C pour être utilisés dans ce protocole. Pour déterminer le nombre d’unités anaérobies formant des colonies (UFC) des matières fécales du donneur, les matières fécales de chaque sujet ont été diluées en série à 1 × 10-5, et 10 μL de chaque dilution ont été conditionnés en double sur des plaques de gélose anaérobie cerveau et de gélose Luria Bertani (LB) et le nombre d’UFC par gramme de selles estimé. Des UFC égales de chaque sujet ont été regroupées dans des échantillons d’inoculum fécal pour être injectées dans des souris.

1. Préparation des cages et autoclave

  1. Préparation de l’isocage
    1. Préremplissez les cages avec ~500 ml de régime 2018SX ou tout régime autoclavable enrichi souhaité et superposez le fond avec de la litière ALPHA-dri. Placez une hutte d’enrichissement autoclavable dans le lit de la cage. Placez une bouteille d’eau vide et non scellée, ainsi qu’une buse et une longue pince à pointe large sur la grille.
    2. Placez un indicateur biologique bi-espèce dans la nourriture dans une cage par cycle d’autoclave. Placez une bande d’intégrateur chimique à l’extérieur de chaque cage.
    3. Autoclavez les cages sur un cycle de vide pendant 45 min à 121 °C et un minimum de 15 PSI suivi d’un temps de séchage de 30 min. Stérilisez les cages à l’aide d’un support de décontamination de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) qui permet aux cages de rester scellées et à la vapeur de passer à travers le filtre HEPA interne, qui maintient l’environnement stérile jusqu’à ce que la cage soit ouverte.
    4. Remplissez les bouteilles de 1 L d’eau potable, fermez-les avec des bouchons en caoutchouc et placez une bande d’intégration chimique sur la surface de la bouteille. Autoclave à 121 °C et un minimum de 15 PSI pendant 45 min, en utilisant le programme d’échappement lent pour les liquides.
    5. Vérifiez visuellement les intégrateurs chimiques apposés sur chaque cage pour une vérification immédiate des paramètres appropriés de l’autoclave.
      REMARQUE : L’indicateur biologique doit être retiré lors de la première ouverture de l’isocage dans des conditions stériles. Incuber l’indicateur biologique pendant 24 h à 37 °C et observer tout changement de couleur. Un changement de couleur vif entre la solution claire bleue / violette d’origine et un liquide jaune ou trouble indique la présence d’une croissance microbienne. Si l’indicateur reste clair et de couleur bleue/violette, c’est la confirmation de la stérilité complète de l’intérieur des cages dans ce cycle d’autoclave.

2. Préparation d’un stérilisant au dioxyde de chlore

ATTENTION : Le stérilisant au dioxyde de chlore est extrêmement corrosif une fois activé. Le stérilisant au dioxyde de chlore actif expire 24 h après le mélange de l’activateur avec la base. Le stérilisant au dioxyde de chlore produit des fumées qui peuvent irriter les surfaces muqueuses et provoquer une irritation au contact de la peau. Assurez-vous que la salle de préparation du stérilisant a accès à un évier et à une ventilation adéquate. Enfilez des lunettes de sécurité, un respirateur et des gants résistant aux produits chimiques lorsque vous travaillez avec un stérilisant au dioxyde de chlore, en plus de l’équipement de protection individuelle (EPI) requis pour l’animalerie.

  1. Base de mélange et activateur
    1. Pour fabriquer un volume standard de 6 L de stérilisant au dioxyde de chlore, mesurez d’abord 1 L de base de stérilisant au dioxyde de chlore dans un cylindre gradué de 1 L et versez-le dans un réservoir de trempage d’un volume de 20 L.
    2. À l’aide du même cylindre gradué, mesurez et versez 4 L d’eau du robinet dans le réservoir de trempage.
    3. Mettez de côté le cylindre gradué utilisé pour la base et l’eau. À l’aide d’un cylindre gradué neuf, mesurez 1 L d’activateur stérilisant au dioxyde de chlore et versez-le dans le réservoir d’immersion.
    4. Une fois l’activateur ajouté au réservoir, utilisez le cylindre gradué pour mélanger le contenu du réservoir.
  2. Activation
    1. Placez le couvercle sur le réservoir de trempage et étiquetez-le comme stérilisant au dioxyde de chlore avec la date et l’heure auxquelles l’activateur a été ajouté et le nom du personnel qui l’a préparé. Si vous le souhaitez, le cylindre gradué utilisé pour mélanger le stérilisant peut être utilisé pour transférer 1 L dans un flacon pulvérisateur.
    2. Déplacez le réservoir de trempage et les vaporisateurs dans la salle d’hébergement des animaux, où se trouvent le support et les cages de l’isocage. Le stérilisant au dioxyde de chlore activé doit reposer pendant au moins 20 minutes avant d’être utilisé afin d’assurer une activation complète.
      REMARQUE : Pour manipuler de grandes quantités de cages (>9), jusqu’à 12 L peuvent être préparés à la fois dans le réservoir d’immersion. Pour manipuler 1 cage ou en cas d’urgence, 1,2 L de stérilisant au dioxyde de chlore peut être préparé dans un récipient plus petit, puis transféré dans 2 flacons pulvérisateurs de 1 L. Il est recommandé de préparer le stérilisant au moins 1 h avant le transfert prévu des souris exemptes de germes.

3. Stérilisation

  1. Enfilez l’EPI
    1. En tant que manipulateur principal de la cage, enfilez des lunettes de sécurité, un respirateur, des gants résistant aux produits chimiques, une blouse chirurgicale stérile, un bouffant, des couvre-manches et des couvre-chaussures. Portez des blouses sous l’EPI, car tout contact du tissu avec un stérilisant au dioxyde de chlore entraînera des taches étendues.
    2. Il est recommandé d’avoir un assistant au manipulateur de cage principal. Demandez à l’assistant de porter le même EPI que le manipulateur de cage principal, bien qu’il puisse porter une blouse chirurgicale non stérile.
  2. Préparation de l’enceinte de biosécurité
    1. Placez 10 lingettes dans le réservoir de trempage stérilisant au dioxyde de chlore et assurez-vous qu’elles sont complètement imbibées.
    2. Déplacez les lingettes imbibées dans l’enceinte de biosécurité et trempez toutes les surfaces de l’armoire dans l’ordre suivant, de l’arrière vers l’avant : surface de travail plane, côté gauche, arrière de la hotte, côté droit et vitre intérieure avant. Effectuez un trempage sans contact des surfaces non protégées de l’enceinte de sécurité biologique en pressant les lingettes sur ces surfaces sans les toucher.
    3. Après une série de nettoyage, remettez les lingettes dans le réservoir de trempage du stérilisant au dioxyde de chlore pour les faire tremper.
  3. Préparation des isocages
    1. Préparez un grand sac en plastique en le remplissant d’au moins 100 ml de stérilisant au dioxyde de chlore à l’aide d’un cylindre gradué et secouez le sac pour vous assurer que toutes les surfaces intérieures sont trempées. Placez le sac sur n’importe quelle surface plane.
    2. Retirez une seule isocage du rack et placez-la dans le réservoir de trempage stérilisant au dioxyde de chlore de sorte que chaque surface de la cage entre en contact avec le liquide. Utilisez les lingettes imbibées dans le réservoir pour frotter davantage les surfaces de la cage afin d’assurer un contact complet avec le liquide.
    3. Après avoir trempé la cage, demandez à l’assistant d’ouvrir le sac en plastique trempé. Placez la cage dans le sac et demandez à l’assistant de fermer immédiatement l’ouverture. Vaporisez l’ouverture du sac avec un stérilisant au dioxyde de chlore à l’aide du flacon pulvérisateur. Suivez cette procédure pour chaque cage à utiliser ; Jusqu’à quatre cages peuvent tenir dans un seul sac de 36 po, 32 po, 48 po.
    4. Immergez autant de bouteilles d’eau stérilisées de 1 L que nécessaire (1 L d’eau pour 2 cages) dans le réservoir de trempage stérilisant au dioxyde de chlore, puis placez-les dans un autre sac en plastique imbibé. Lorsque toutes les fournitures ont été placées dans le sac, fermez le sac et vaporisez l’ouverture du sac avec un stérilisant au dioxyde de chlore à l’aide du flacon pulvérisateur.
    5. Une fois que toutes les cages et fournitures sont emballées, immergez les gants résistants aux produits chimiques dans un stérilisant au dioxyde de chlore (aussi loin que possible dans les gants sans atteindre l’ouverture).
  4. Période de stérilisation de 20 min
    1. La stérilisation complète nécessite un minimum de 20 minutes de temps de contact avec le liquide. Dès que le dernier article a été stérilisé et que le sac de trempage en plastique est fermé, demandez à l’assistant de régler une minuterie de 20 minutes. Assurez-vous qu’après le démarrage de la minuterie, les gants résistants aux produits chimiques ne touchent aucune surface non imbibée de stérilisant au dioxyde de chlore.
    2. Effectuez le processus de stérilisation de l’enceinte de biosécurité (étape 3.2) à plusieurs reprises jusqu’à ce que la minuterie indique que 20 minutes se sont écoulées.
    3. Demandez à l’assistant de secouer fréquemment les surfaces extérieures du sac en plastique trempé pour assurer un contact constant avec le liquide avec les surfaces de la cage et de la bouteille à l’intérieur.
    4. Après la période de 20 minutes, demandez à l’assistant d’ouvrir le sac en plastique trempé pour révéler les cages et les bouteilles d’eau stérilisées, en prenant soin de ne toucher que les surfaces extérieures du sac.
    5. À l’aide des gants stérilisés résistant aux produits chimiques, déplacez chaque cage et bouteille dans l’enceinte de biosécurité stérilisée. S’il y a trop de cages pour entrer dans l’enceinte de biosécurité, laissez les cages restantes dans les sacs en plastique, car elles resteront stériles tant que l’ouverture du sac en plastique est fermée et imbibée de stérilisant au dioxyde de chlore entre chaque ouverture.

4. Transfert de souris sans germes

  1. Préparation des isocages
    1. Pour ouvrir l’isocage hermétiquement fermé, soulevez les languettes blanches sur les deux pinces sur les côtés du couvercle, puis tirez chaque pince sur le côté. Le couvercle doit être dégagé de la partie inférieure de la cage afin de soulever le couvercle de la cage. Placez le couvercle à l’envers à gauche de la cage et utilisez-le comme poste de travail stérile.
      REMARQUE : Une alternative à l’utilisation de couvercles de cage ou de l’intérieur des sacs d’instruments autoclavés comme surface de travail stérile est d’utiliser des champs autoclavés, qui offrent une plus grande surface et empêchent la contamination involontaire du couvercle de la cage si une erreur est commise.
    2. À l’aide de la pince stérile qui se trouve à l’intérieur de la cage sur le dessus de la grille, retirez la bouteille d’eau vide et placez-la à l’intérieur du couvercle. Ouvrez la bouteille d’eau de 1 L en retirant le joint en caoutchouc et versez l’eau dans la bouteille d’eau pour la remplir. Placez la buse sur la bouteille d’eau à l’aide de la pince et appuyez fermement pour sceller.
    3. À l’aide d’une pince stérile, soulevez la grille et reculez-la de plusieurs pouces pour permettre une ouverture vers le fond de la cage. Posez la pince stérile sur la grille, en veillant à ce que les poignées n’entrent pas en contact avec les surfaces de la cage.
  2. Utilisation du disque de transfert
    REMARQUE : Du personnel formé exempt de germes est responsable de l’entretien et de l’entretien des isolateurs de reproduction. Compte tenu des risques associés à l’ouverture des isolateurs de reproduction, ce personnel effectue la stérilisation par disque de transfert, la préparation et le transfert des souris exemptes de germes des isolateurs aux isocages. Pour décrire brièvement le processus, les disques de transfert sont préparés dans un cylindre autoclavable pour permettre la stérilisation. Des indicateurs biologiques sont utilisés pour vérifier leur stérilité. Le ruban adhésif pour sceller les disques de transfert est également autoclavé à l’intérieur du cylindre. Le cylindre stérilisé renfermant ces matériaux est fixé à l’isolateur par l’intermédiaire d’un manchon de transfert, et les souris sont déplacées des cages au disque. Le couvercle est ensuite placé sur le disque, et du ruban adhésif autoclavé est utilisé pour créer un joint étanche à l’air sur la circonférence du disque et les trous d’air. Le disque scellé est immédiatement placé dans l’orifice de sortie de l’isolateur. Le capuchon de l’orifice de l’isolateur domestique est ensuite fermé, et l’extérieur du disque est soigneusement nettoyé avec un stérilisant et placé dans un sac imbibé de stérilisant, surveillé pendant 20 minutes pour assurer une décontamination complète. Le personnel d’élevage exempt de germes livre ensuite ces disques au personnel d’étude. Les souris ne peuvent pas être conservées dans le disque scellé plus de 30 minutes à partir du moment où le disque de transfert est scellé, il est donc essentiel que toutes les étapes précédentes de ce protocole aient été effectuées suffisamment à l’avance avant l’arrivée du disque de transfert.
    1. À la réception du disque de transfert, demandez à l’assistant de tenir et de déballer partiellement le couvercle en plastique de sorte que la surface trempée du disque de transfert soit exposée mais pas touchée par l’assistant.
    2. À la réception du disque de transfert, demandez à l’assistant de tenir et de déballer partiellement le couvercle en plastique de sorte que la surface trempée du disque de transfert soit exposée mais pas touchée par l’assistant.
    3. En portant les gants résistants aux produits chimiques imbibés de stérilisant au dioxyde de chlore, retirez le disque de transfert de l’emballage plastique, en prenant soin de ne pas toucher une surface non imbibée de stérilisant. Ensuite, placez le disque de transfert sur la surface plane de l’enceinte de biosécurité stérilisée.
    4. Pour ouvrir le disque de transfert, décollez le ruban, scellez la circonférence du disque et jetez-le à l’extérieur de l’enceinte de sécurité biologique. Retirez le couvercle du disque de transfert et jetez-le à l’extérieur de l’enceinte de sécurité biologique.
    5. À l’intérieur du disque de transfert se trouve un couvercle à compartiment rotatif avec une seule ouverture. Utilisez la pince stérile préalablement posée sur la grille de la cage pour manipuler le couvercle de ce compartiment afin de déplacer l’ouverture vers la souris nécessaire au transfert.
  3. Transfert de souris du disque à l’isocage
    1. À l’aide de la pince, saisissez la base de la queue de la souris par l’ouverture du couvercle du disque en plastique, puis soulevez et transférez la souris dans l’isocage par l’espace ouvert précédemment entre la grille et la cage. Répétez l’opération pour toutes les souris destinées à cette cage.
    2. Une fois que toutes les souris ont été transférées dans cet isocage, remplacez la grille à l’aide de la pince. Ensuite, soulevez le couvercle de la cage et replacez-le sur le dessus de la cage à l’aide de la pince.
    3. Soulevez chaque pince du couvercle de la cage et abaissez-la soigneusement sur les côtés de la cage, puis appuyez sur les languettes blanches pour sceller le couvercle de la cage.
    4. Une fois la cage scellée, demandez à l’assistant de vaporiser chaque buse du site d’amarrage sur le support de la cage avec un stérilisant au dioxyde de chlore. Ensuite, retirez la cage de la hotte et passez-la à l’assistant, qui peut ensuite ancrer la cage sur le support.
    5. Répétez ces étapes pour chaque souris du disque de transfert.
  4. Nettoyage de l’enceinte de sécurité biologique
    1. Une fois tous les transferts de souris terminés dans l’isocage, videz le capot de tous les débris et essuyez complètement avec des lingettes stérilisantes imbibées de dioxyde de chlore.
    2. Essuyez la hotte avec de l’alcool isopropylique pour éliminer les résidus de dioxyde de chlore stérilisant. L’espace sous la surface de travail de la hotte recueille un grand volume de stérilisant issu du processus de stérilisation. Éliminez-le par absorption avec des lingettes sèches et essuyez avec de l’alcool isopropylique.
    3. Jeter le stérilisant liquide au dioxyde de chlore dans le drain de l’évier 24 heures après l’activation. Éliminer les matières solides contaminées par un agent stérilisant comme déchets ordinaires.
      REMARQUE : Les souris exemptes de germes transférées dans des conditions d’isocage sont laissées pendant 1 semaine pour s’acclimater à leur nouvel environnement avant toute intervention. Cela réduit le stress subi par les animaux, ce qui pourrait interférer avec les résultats de l’étude. À la fin de cette période d’acclimatation d’une semaine, prélevez les matières fécales comme décrit à l’étape 6 pour confirmer l’absence de germes avant toute intervention.

5. Gavage oral de boue fécale humaine chez des souris exemptes de germes

  1. Préparation des fournitures de gavage autoclavé
    1. Placez les aiguilles de gavage oral dans des poches de stérilisation auto-obturantes (1 par souris) et les seringues stériles de 1 mL dans des poches de stérilisation auto-obturantes (1 par souris) 1 jour avant la procédure de gavage oral. Placez-les ainsi que des béchers en polypropylène de 600 ml (1 par souris) et une paire de longues pinces dans un sac sans danger pour l’autoclave et stérilisez par autoclave.
    2. Immédiatement après avoir retiré le sac de l’autoclave, scellez-le avec du ruban adhésif d’emballage et conservez-le jusqu’au lendemain.
  2. Préparation du lisier fécal humain
    1. Le jour du gavage, transférez les matières fécales humaines homogénéisées et entreposées dans des milieux de conservation anaérobies (dans ce cas, des milieux de transport dentaire liquides) du congélateur à -80 °C vers la chambre anaérobie. Diluer des matières fécales homogénéisées à environ 1:10 dans une solution saline anaérobie stérile dans un tube conique de 10 ml.
    2. Sceller le tube contenant la boue fécale humaine avec du parafilm, homogénéiser par vortex, puis centrifuger à 200 g pendant 5 min pour décanter les particules.
    3. Remettez le tube dans la chambre anaérobie et transférez le surnageant dans un autre tube conique de 10 ml. Scellez le tube contenant le surnageant fécal humain avec du parafilm, retirez-le de la chambre anaérobie et placez-le dans un récipient secondaire étanche. Transportez le conteneur avec le sac autoclavé de fournitures de gavage jusqu’au lieu d’hébergement des animaux.
      REMARQUE : Il est essentiel d’estimer la quantité totale d’UFC/mL de matières fécales humaines destinées au gavage à des fins de déclaration. On ne sait pas exactement quelle est la charge minimale d’UFC pour assurer une colonisation adéquate, mais des UFC plus élevées entraînent une meilleure greffe des selles du donneur13. Si la charge UFC de matières fécales humaines entraîne de faibles taux de greffe, prélevez des échantillons de matières fécales humaines. L’utilisation d’un milieu de préservation de la viabilité améliorera la récupération des UFC à partir des échantillons fécaux recueillis. Pour déterminer le nombre d’UFC anaérobies/aérobies des matières fécales du donneur, diluer en série l’échantillon à 1 x 10-5 et la plaque de 10 μL de chaque dilution en double sur des plaques de gélose BHI et LB aérobie et anaérobie. Après 24 h (aérobie) et 48 h (anaérobie), comptez l’UFC par gramme de selles.
  3. Préparation des isocages
    1. Répétez les étapes 2 et 3, la seule différence étant qu’il y a des souris logées dans ces cages, et il faut veiller à ce que, dans les 30 minutes suivant le retrait du support, chaque isocage soit placée dans le capot stérilisé et que le couvercle soit ventilé pour permettre la circulation de l’air vers les souris.
    2. Stérilisez le sac de gavage autoclavé et le tube de boue fécale humaine des étapes 5.1 et 5.2 par saturation en chlore et au dioxyde de chlore de la même manière que les bouteilles d’eau (c.-à-d. immergez-les dans un produit stérilisant, puis placez-les dans un sac imbibé de stérilisant).
    3. Transférer les isocages et les fournitures de gavage oral dans l’enceinte de biosécurité après la fin de la période de stérilisation de 20 minutes. Perforez le sac de ravitaillement autoclavé en poussant le sac contre la longue pince qu’il contient, puis retirez les fournitures et jetez le sac à l’extérieur de la cagoule.
  4. Gavage
    1. Enfilez une nouvelle blouse chirurgicale stérile et des gants chirurgicaux stériles à la place des gants résistants aux produits chimiques afin d’éviter que le stérilisant résiduel au dioxyde de chlore n’entre en contact avec les souris. Demandez à l’assistant de vous aider dans ce processus si nécessaire.
    2. Préparez les aiguilles de gavage en déballant chaque sachet de stérilisation et utilisez l’intérieur du sachet comme surface de repos sèche et stérile. Connectez l’aiguille de gavage à chaque seringue, ouvrez le tube de lisier fécal et tirez 200 μL de boue fécale dans chaque seringue.
    3. À l’aide d’une pince, saisissez la base de la queue d’une souris dans la cage et placez-la sur la grille. Retenez doucement la souris en l’éraflant et, tout en tenant la souris en position verticale verticale, insérez l’aiguille et injectez doucement la boue fécale, puis retirez immédiatement l’aiguille.
    4. Placez la souris directement dans l’un des gobelets stérilisés pour l’observation. Répétez le processus pour chaque souris dans la cage. Une fois que toutes les souris ont reçu le gavage, utilisez la pince pour ramener chaque souris dans le lit de la cage et scellez la cage comme décrit aux étapes 4.3.2 à 4.3.4.
      REMARQUE : Dans les cas où deux ou plusieurs boues fécales distinctes sont utilisées, une nouvelle stérilisation complète de l’enceinte de biosécurité ainsi que des cages et des matériaux requis est requise. Dans les cas où un groupe de souris reste exempt de germes, il est recommandé que ces souris reçoivent leurs gavages de contrôle avant que tout autre groupe ne soit traité.
    5. Suivez la procédure de l’étape 4.4 pour éliminer les produits stérilisants au dioxyde de chlore et les matériaux imbibés de stérilisant. Traiter toutes les matières contaminées par des boues fécales humaines comme des déchets biomédicaux et les éliminer conformément aux procédures de santé et de sécurité environnementales.

6. Collecte de selles sur des souris humanisées pour la préservation de la viabilité

  1. Préparer les fournitures autoclavées
    1. Placez des pinces courtes à pointe large dans des poches de stérilisation auto-obturantes (1 par souris), des béchers en polypropylène de 600 ml (1 par souris) et une paire de pinces longues dans un sac sans danger pour l’autoclave et stérilisez en autoclave 1 jour avant la procédure de prélèvement des selles.
    2. Immédiatement après avoir retiré le sac de l’autoclave, scellez-le avec du ruban adhésif d’emballage et conservez-le jusqu’au lendemain.
  2. Préparation du tube de support de conservation
    1. Choisissez un milieu de préservation de la viabilité anaérobie (ici, Cary Blair a été utilisé). Aliquote 1 mL de milieu de conservation dans des tubes stériles de 2 mL à bouchon à vis dans une enceinte de biosécurité. Un rapport fèces/milieu de 1:10 est recommandé pour une conservation optimale.
    2. Pré-étiquetez chaque tube avec un marqueur permanent, mais sachez que l’exposition à un stérilisant au dioxyde de chlore peut enlever les étiquettes permanentes des surfaces en plastique. Une autre méthode consiste à laisser les tubes non étiquetés et à demander à l’assistant d’étiqueter les tubes immédiatement après la collecte avant la congélation.
    3. Placez ces tubes dans un support standard en polypropylène pour permettre de stocker les tubes à la verticale tout en permettant la stérilisation par contact avec un stérilisant au dioxyde de chlore.
  3. Cages de stérilisation et enceinte de biosécurité
    1. Répétez les étapes 2 et 3 pour stériliser les isocages et l’enceinte de biosécurité. Encore une fois, assurez-vous que dans les 30 minutes suivant le retrait du support, chaque isocage est placée dans le capot stérilisé et que le couvercle est ventilé pour permettre la circulation de l’air vers les souris.
    2. De plus, stérilisez le sac d’approvisionnement autoclavé et le support contenant les tubes préparés par saturation en chlore et au dioxyde de chlore et placez-les dans le sac en plastique trempé contenant les cages. L’objectif est un contact liquide complet avec toutes les surfaces de chaque tube et le support lui-même.
  4. Prélèvement et stockage d’échantillons fécaux
    1. Transférer les isocages, les fournitures autoclavées et le support de tubes dans l’enceinte de biosécurité après la fin de la période de stérilisation de 20 minutes. Percez le sac de ravitaillement autoclavé en poussant le sac contre la longue pince qu’il contient, retirez les fournitures et jetez le sac à l’extérieur de la cagoule.
    2. Enfilez une nouvelle blouse chirurgicale stérile et des gants chirurgicaux stériles à la place des gants résistants aux produits chimiques afin d’éviter que le stérilisant résiduel au dioxyde de chlore n’entre en contact avec les souris. Demandez à l’assistant de vous aider dans ce processus si vous le souhaitez.
    3. Préparez la pince à pointe émoussée en déballant les sachets et en utilisant la surface intérieure du sac comme zone stérile. Placez le support de tube sur la surface de la hotte de biosécurité.
    4. À l’aide de longues pinces, saisissez la base de la queue d’une seule souris dans la cage et placez-la directement dans l’une des coupes stérilisées pour l’observation. Répétez ce processus pour chaque souris dans la cage.
    5. Observez les souris jusqu’à ce qu’au moins deux boulettes fécales fraîchement passées aient été produites.
      1. À l’aide de la pince à pointe émoussée, prélevez les granules fécales et placez-les directement dans le tube. Fermez immédiatement le couvercle à vis et passez-le à l’assistant.
      2. Demandez à l’assistant d’étiqueter le tube et d’homogénéiser immédiatement les selles par vortex. Une fois homogène, congelez le tube dans de l’azote liquide et conservez-le à long terme à -80 °C.
    6. Répétez le processus de collecte des selles pour chaque souris dans la cage. Replacez chaque souris dans la cage de la maison après la collecte des matières fécales et réinstallez les cages sur leur support. Répétez l’étape 4.4 pour nettoyer la hotte et éliminer les déchets.

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Résultats

Des échantillons de matières fécales humaines, regroupés selon le phénotype ICI répondeur et non-répondeur (précédemment décrit dans le protocole), ont été gavés chez des souris GF-WT mixtes logées dans 3 isocages par groupe (n = 1-2 souris/cage, n = 6 pour le répondeur et n = 5 pour le non-répondeur). Les souris ont été autorisées à s’acclimater pendant 1 semaine après le transfert. Des échantillons de matières fécales ont ensuite été prélevés sur ces souris (conditions exemptes de germes). Les souris ont ensuite été ga...

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Discussion

Le protocole décrit ici fournit une méthode reproductible et très détaillée pour l’humanisation de souris exemptes de germes hébergées dans des isocages expérimentaux. La capacité de transplanter exclusivement des communautés fécales de sujets humains dans des hôtes murins est inestimable pour la recherche sur le microbiome. Sans contamination par le microbiote commensale spécifique à la souris, on peut étudier l’impact des bactéries résidentes chez l’homme sur une variété d’états de san...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants à la division des services sans germes des services de soins aux animaux de l’UF pour l’aide qu’ils ont apportée à l’élevage de gnotobiotiques, à la Dre Brooke Bloomberg et à la Dre Laura Eurell pour l’aide vétérinaire et à l’IACUC, ainsi qu’à Josée Gauthier pour l’aide au séquençage du gène de l’ARNr 16S. Cette recherche a été soutenue, en partie, par le UF Health Cancer Center Funds (C.J.) et le UF Department of Medicine Gatorade Fund (C.J.). R.Z.G. a été soutenu par les fonds du UF Health Cancer Center. R.C.N. a été soutenu par la subvention de formation TL1 des National Institutes of Health de l’Université de Floride (TL1TR001428, UL1TR001427), le prix du programme de formation interdisciplinaire en recherche sur le cancer basé sur l’équipe du National Institutes of Health du National Institutes of Health T32CA257923 et le UF Health Cancer Center. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le UF Health Cancer Center, soutenue en partie par les crédits de l’État fournis dans Fla. Stat. § 381.915 et l’Institut national du cancer des National Institutes of Health sous le numéro de prix P30CA247796. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health ou de l’État de Floride. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 mL de seringue à embout coulissant BD stérile, à usage uniqueFisher Scientific309659
Tube à bouchon à vis de 2,0 ml, sans molette, jupe, naturel, tube stérile à faisceau d’E avec capuchon attachéFisher Scientific14-755-228
36 x 32 x 48" 3 Mil Sacs en polyéthylène à souffletUlineS-13455
Réservoir de 5 gallons d’activateur de stérilisant au dioxyde de chlore Exspor  ;Ecolab6301680
réservoir de 5 gallons de base stérilisante au dioxyde de chlore ExsporEcolab6301194
béchers en polypropylène de 600 mlFisher ScientificS01914
ALPHA-dri literieShepherd Specialty Papers
Chambre anaérobieCoy Lab ProductsType B
Enceinte de biosécurité classe 2Nuaire
Certifié IsoCage filtre HEPA autoclavable XT Extreme TemperatureTecniplast1245ISOFHXT
Verres Transparents LPX IQuity Lunettes de Sécurité  ;Fastenal922205455
DuPont  ; Tyvek  ; Manchon - 18"UlineS-13893E
DWK Life Sciences DURAN 45 mm Push-on Natural Rubber CapFisher Scientific01-258-107Capuchon en caoutchouc pour bouteilles autclave de 1 L
Dynalon Quick Mist HDPE SprayerBottles Fisher Scientific03-438-12B
Fisherbran Cylindres gradués en polypropylèneFisher Scientific03-007-44
Fisherbran  ; Dissection Pince à pointe arrondieFisher Scientific08-887
Fisherbrand Sachets de stérilisation à scellage instantanéFisher Scientific01-812-51
Fisherbrand Straight Broad Strong Tip Pince d’application générale  ;Fisher Scientific16-100-107
Fisherbrand  ; Ruban autoclave sans plombFisher Scientific15-901-110
Aiguille de gavage, acier inoxydable réutilisable. Droit. Aiguille de calibre 22, diamètre de la pointe 1,25 mm, longueur 38 mm ou 1,5 pouces (doz)Braintree ScientificN-PK 020
H-B Instrument Durac TimerFisher Scientific13-202-015
Cages et crémaillère IsoPositive (c’est-à-dire isocages)Tecniplast  ;   ;ISO30P30 cages (6 l x 5 h), gants en
nitrile résistant aux produits chimiques à une face Taille S (7), M (8) ou L (9) 18" de long, 22 mil, AnsellGrainger4T426
Gants d’examen en nitrile, moyens, non stériles, non poudrésMedSupply PartnersKG-1101M
Gaz à baïonnette olive / magenta et Cartouches vapeur / Filtre à particules 2Ct  ;  ; 3M/Fastenal50051138541878
Polycarbonate RadDisk Mini pour souris 8-75 x 4Braintree ScientificIRD-P M
Capuchons bouffants en polypropylène - 24", bleuUlineS-10480BLU
Puritan Cary-Blair moyen, 5 mLFisher Scientific22-029-646
S, M et L Harnais de tête bimode en silicone bleu demi-masque Respirateur  ;  ; Gants
SGPF, CT International, Épaisseur = 6,5 mm, Longueur = 30,5 cm (12), Taille du gant = 8,5, Couleur du gant = BlancFisher Scientific18-999-102F
Couvre-chaussures antidérapantsUline  ; S-25639
Blouse chirurgicale, serviette, stérile, grande, 32/csThomas ScientificKIM 95111
Teklad Global 18 % de protéines extrudées pour rongeurs (stérilisable)  ;Inotiv2018SX
Thermo Scientific Nalgene Réservoir LLDPE rectangulaire à usage intensif avec couvercle (volume de 20 L)Thermo Scientific14-831-330J
VERIFY Dual Species Indicateurs biologiques autonomesSteris HealthcareS3061
WypAll L40 1&frasl ; Essuie-glaces 4 plisUlineS-8490
stériles en latex non poudrés série 3M/Fastenal 50051131370826

Références

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