Ensemble de bioréacteur pour la culture continue de communautés fécales complexes

Résumé

Ce protocole détaille l’assemblage de réseaux de mini-bioréacteurs à utiliser pour la culture en flux continu de communautés fécales complexes dans des conditions anaérobies. Nous discutons également des méthodes d’assemblage, d’inoculation et d’échantillonnage des réacteurs pour une analyse plus approfondie.

Résumé

Le microbiote, en particulier les bactéries, réagit à diverses expositions environnementales telles que les micro et macronutriments, les composés pharmacologiques et les médiateurs inflammatoires, qui modifient dynamiquement la composition de la communauté et la production métabolique microbienne. Comprendre comment les conditions physiologiques de culture affectent les communautés et la diversité microbiennes et leur capacité métabolique permettra de mieux connaître leur impact sur la santé et les maladies. Ici, nous présentons un protocole adapté du modèle publié par Auchtung et al. pour créer des réseaux de mini-bioréacteurs capables de cultiver des communautés fécales complexes, de définir des consortiums bactériens ou des souches uniques dans des conditions précises, notamment la disponibilité des nutriments, la température, le débit, le pH et la teneur en oxygène. Nous décrivons le processus de construction du système de mini-bioréacteur, y compris les adaptations visant à améliorer les limites du protocole publié. Nous discutons également de la configuration du système de mini-bioréacteur dans des conditions anaérobies avec l’utilisation de médias MEGA (adaptés de Han et al.), qui sont des milieux riches favorisant la croissance de diverses bactéries. Nous décrivons l’inoculation d’échantillons de matières fécales de souris humanisées intestinales dans le système du mini-bioréacteur, suivie de l’établissement de cultures communautaires complexes dans le système du mini-bioréacteur, qui peuvent être cultivées en flux continu avec un échantillonnage aseptique pour surveiller la composition de la communauté. Ce système est adaptable aux changements alimentaires et autres modifications culturelles. Les techniques décrites ici permettent de caractériser des communautés fécales diverses et fastidieuses dans des conditions dynamiques ou en réponse à une perturbation isolée de facteurs dérivés de l’hôte.

Introduction

Le microbiote intestinal est un vaste réseau de micro-organismes, notamment des bactéries, des champignons, des archées et des virus, qui contiennent un énorme répertoire génétique et métabolique qui dépasse largement celui d’un hôte humain¹. La riche capacité métabolique du microbiome comprend des métabolites produits par le traitement bactérien des nutriments alimentaires, des métabolites de l’hôte chimiquement modifiés par des bactéries et des métabolites synthétisés uniquement par le microbiote². Le microbiote est impliqué dans presque tous les bioprocessus de l’hôte, mais aussi dans des états pathologiques tels que les maladies inflammatoires de l’intestin, le cancer, les troubles métaboliques et même les troubles^{neurologiques2,3}. Il est essentiel de disséquer la contribution du microbiote de celle de l’hôte pour comprendre le rôle de micro-organismes spécifiques ou de communautés complexes dans la santé et la maladie. L’une des approches qui permet cette dissection est l’utilisation de bioréacteurs microbiens, qui cultivent diverses communautés microbiennes dans des conditions dynamiques. Il existe de nombreux bioréacteurs disponibles dans le commerce qui permettent la croissance de communautés bactériennes fécales à presque toutes les fins, y compris la culture de bioproduits à grande échelle ou le contrôle précis de facteurs nutritifs spécifiques pour l’étude des processus métaboliques. Cependant, ces systèmes sont extrêmement coûteux et nécessitent une préparation approfondie, et ne permettent pas d’examiner en parallèle diverses conditions expérimentales. Pour une approche simplifiée qui soit moins coûteuse, plus adaptable et qui permette de nombreuses conditions parallèles, nous présentons ici le protocole pour la mise en place et l’utilisation d’un réseau de mini-bioréacteurs en flux continu adapté d’Auchtung et ^al.4.

La configuration complète du système de mini-bioréacteur est illustrée à la figure 1A. Ce système de mini-bioréacteur utilise des réseaux de 6 puits de réacteur, qui sont complètement indépendants les uns des autres et sont installés dans une chambre anaérobie sous écoulement péristaltique pour permettre une distribution et une évacuation continues des fluides (Figure 1A). Chaque réseau de réacteurs repose sur une plaque d’agitation magnétique à 60 positions, avec deux pompes péristaltiques à 48 cassettes contenant un tube à 2 arrêts pour le média source et le flux de déchets (figure 1A). La chambre anaérobie est équipée d’un moniteur anaérobie CAM-12 pour la teneur en oxygène, d’un boîtier catalytique pour éliminer l’oxygène avec une capacité de chauffage et d’une colonne d’élimination du sulfure d’hydrogène pour absorber l’excès de gaz du métabolisme bactérien. Chaque puits de réacteur est équipé d’une entrée de média source, d’une sortie de déchets et d’un orifice d’échantillonnage, ce qui permet l’inoculation ou l’échantillonnage de chaque puits de réacteur (figure 1B).

Comme décrit, le système de bioréacteur permet un contrôle dynamique de la température, de la consommation de milieux et de la disponibilité des nutriments pour soutenir la culture et le maintien des communautés fécales. La température est modulée par un boîtier catalytique à capacité de chauffage, ce qui permet de mettre en œuvre rapidement les changements de température dans toute la chambre anaérobie. La consommation de fluide est régulée par les débits de la pompe péristaltique, qui peuvent être modifiés pour modifier le renouvellement du fluide dans les réacteurs. Le renouvellement des milieux peut être adapté aux types de communautés cultivés dans les réacteurs, par exemple, en étant adapté aux souches cibles à croissance lente ou à croissance très rapide. Enfin, la disponibilité des nutriments peut être modifiée de manière dynamique en ajoutant des composants par l’intermédiaire des orifices d’échantillonnage individuels de chaque puits de réacteur. Les conditions statiques qui peuvent être modifiées au début d’une expérience, mais qui n’ont pas de contrôle dynamique dans le système, sont le type de milieu, la teneur en oxygène et le nombre de réacteurs simultanés. Les enquêteurs peuvent choisir d’implémenter n’importe quel média source qu’ils souhaitent, et bien qu’un média soit décrit ici, d’innombrables autres types de médias sources ont été mis en œuvre avec succès. On peut faire fonctionner les réacteurs dans des conditions aérobies ou microaérophiles (selon la disponibilité d’une chambre microaérophile). Enfin, il est possible de mettre en place autant ou aussi peu de réacteurs que nécessaire en fonction des besoins expérimentaux de l’investigateur. Alors que les réacteurs sont en groupes de six au sein d’un réseau, chaque réacteur fonctionne indépendamment des autres, et chacun peut être relié à une source différente si on le souhaite.

Ce système de bioréacteur modulaire peut être entièrement installé pour environ 25 000 $ (sans compter la chambre anaérobie ou les composants spécifiques à la chambre), la seule pièce non réutilisable étant le tube qui peut être remplacé pour moins de 100 $ par cycle du système. Le système est principalement automatisé, mais nécessite une vérification quotidienne des niveaux de fluides, car les bouteilles de sources de médias devront être changées lorsqu’elles sont vides. De plus, tout échantillonnage doit être effectué manuellement, et toute modification conditionnelle dynamique du système devra être initiée manuellement (par exemple, modification de la température). À partir du protocole système original publié par Auchtung et al., quelques modifications ont été mises en œuvre pour améliorer les performances globales et l’utilité⁴. Tout d’abord, le matériau pour l’impression 3D du réseau de bioréacteurs est modifié pour être en plastique transparent translucide de type ABS afin d’améliorer l’intégrité structurelle du système grâce à des cycles répétés d’autoclavage. De plus, à la place du tube en PTFE de 1/8 pouce (3,2 mm) de diamètre extérieur, le tube E-LFL, de 2,06 mm de diamètre intérieur, 100 pieds est utilisé en raison du matériau plus robuste, qui est plus résistant à l’effondrement, ce qui provoquerait des blocages de l’écoulement dans le système. Enfin, un raccord supplémentaire utilisant un filetage de 1/4 à 28 mm sur des adaptateurs mâles cannelés est utilisé pour réduire les changements de glissement des tubes des flacons sources de fluide. D’après Han et al., la recette adaptée du milieu MEGA fournit un milieu indéfini, complexe et très riche qui permet la culture de micro-organismes anaérobies fastidieux⁵. Le support est modifié pour utiliser une autre préparation du composant histidine-hématine, car l’original n’est plus disponible dans le commerce. L’hydroxyde de sodium est également utilisé pour pH du milieu à 7,0 ou au pH souhaité. Dans l’ensemble, ce système est économique et convivial, optimisé et constitue un excellent point d’entrée dans les systèmes de culture en flux continu.

Dans ce protocole, nous décrivons en détail la configuration de ce système de mini-bioréacteur, y compris les matériaux, la stérilisation du système et l’utilisation ultérieure pour la culture d’échantillons de matières fécales murines humanisées dans l’intestin. L’objectif global de cette méthode est de construire un système de bioréacteur adaptable et rentable qui peut être utilisé pour cultiver des communautés microbiennes dans des conditions contrôlées. Un schéma détaillé du déroulement de l’assemblage du système de mini-bioréacteur est fourni à la figure 2 et référencé aux étapes appropriées du protocole. Dans notre exemple, nous inoculons deux réacteurs avec le même échantillon fécal à partir de souris intestinales humanisées et décrivons la structure de la communauté microbienne sous un flux continu de milieux MEGA.

Figure 1 : Schéma de principe de l’installation du réseau de mini-bioréacteurs dans la chambre anaérobie. (A) Vue complète de l’installation complète du réseau de mini-bioréacteurs dans la chambre anaérobie. Le réseau de bioréacteurs à 6 puits est situé sur la plaque d’agitation magnétique à 60 positions. Le réseau de luer té source est relié au média source sur le côté gauche par le bouchon de la bouteille à deux trous. Deux pompes péristaltiques maintiennent la tuyauterie à 2 arrêts de la source et les réseaux de déchets à gauche et à droite, respectivement. Le réseau de tés Luer se déverse dans la bouteille à déchets sur le côté droit. Les équipements essentiels au fonctionnement de la chambre anaérobie, y compris le moniteur CAM-12, le boîtier de catalyseur avec capacité de chauffage et la colonne d’élimination du sulfure d’hydrogène, sont disposés à l’intérieur de la chambre autour du système de réseau. (B) Vue de dessus de la source, de l’échantillon et des orifices de déchets fixés à un puits du réacteur avec le milieu à la hauteur appropriée dans le réacteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Schéma de principe du flux de travail d’assemblage d’un réseau de mini-bioréacteurs. (A) Vue de haut en bas du réseau de mini-bioréacteurs, montrant l’orientation de la source, des déchets et des orifices d’échantillonnage. (B) Vue latérale du réseau de mini-bioréacteurs avec vue illustrant les étapes 2.3 et 2.4 du protocole. Le tube et le raccord en PTFE de 1/8 de pouce (1) sont fixés et insérés dans les orifices de déchets et d’échantillons. Le raccord (1) sans PTFE est inséré dans le port source. (C) Vue latérale d’un réseau de mini-bioréacteurs illustrant les étapes 2.5 et 2.6 du protocole. Le raccord (2) est fixé à la source et aux orifices de déchets. Le raccord (3) est fixé à l’orifice d’échantillonnage, et pour cela, le raccord (4) est inséré sur le dessus. (D) Vue latérale du réseau de mini-bioréacteurs illustrant les étapes 2.9 à 2.11. Le tube E-LFL 2,06 mm est connecté aux orifices source et de décharge, et l’autre extrémité est connectée aux raccords (5) puis (6). Un tube à 2 butées du diamètre approprié est ensuite raccordé au raccord (6). La connexion inverse est ensuite répétée à l’extrémité du tube à 2 butées, le raccord (6) se connectant au tube à 2 arrêts et le raccord (5) se connectant à celui-ci. Enfin, le tube E-LFL de 2,06 mm sera connecté au raccord (5) pour le raccordement au réseau de tés Luer. (E) Vue de haut en bas du réseau de mini-bioréacteurs montrant la configuration du réseau de sources et de déchets décrite aux étapes 2.12 à 2.15. Le tube E-LFL de 2,06 mm se terminant par le raccord (5) est utilisé pour connecter chaque réacteur à plusieurs raccords (7), dont la dernière ouverture est reliée au bouchon de la source ou de la bouteille de déchets. (F) Vue latérale de l’ensemble de bouchon de bouteille à deux trous décrit aux étapes 2.16-2.17. Une ouverture dans le bouchon est reliée à un tube en PTFE qui est placé à l’intérieur de la bouteille. Dans cette ouverture est inséré le raccord (1), suivi du raccord (2) et du tube E-LFL de 2,06 mm relié au raccord (5). Ce raccord est fixé à la source ou au réseau de déchets luer. Dans l’ouverture non connectée au tube en PTFE, le raccord (1) est inséré, suivi du raccord (2), et le tube E-LFL 2,06 mm est connecté à un autre raccord (5). Cette extrémité est recouverte d’une feuille lors de la stérilisation en autoclave pour une fixation future à un filtre à seringue stérile de 0,22 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

Les échantillons fécaux utilisés dans cette étude ont été obtenus à partir d’expériences approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Floride (UF) et réalisées dans les installations de soins aux animaux de l’UF (IACUC Protocol #IACUC202300000005). En bref, les espèces mixtes de type sauvage exempt de germes (GF WT ; C57BL/6) (élevées et maintenues dans des isolateurs par la division exempte de germes des services de soins aux animaux de l’UF) ont été transférées des isolateurs d’élevage et placées dans le système de bioexclusion ISOcage P pour permettre la manipulation microbienne. Des unités égales formant des colonies (UFC) provenant d’excréments de donneurs humains ont été regroupées pour être utilisées par gavage chez la souris. Deux semaines après l’inoculation, des échantillons fécaux ont été prélevés de ces souris de manière aseptique pour être stockés et utilisés ultérieurement dans le cadre de ce protocole.

REMARQUE : Le prélèvement et la préparation d’échantillons fécaux décrits ici ne sont destinés qu’à titre d’exemple d’une procédure appropriée, car selon le type d’échantillons prélevés (humain, souris, autre animal) et l’entreposage de ces échantillons, cette procédure peut varier considérablement. Les personnes doivent se référer à la littérature appropriée pour concevoir un protocole de collecte et de conservation des échantillons fécaux basé sur les besoins de chaque chercheur.

1. Préparation typique d’échantillons fécaux pour un stockage à -80 °C

1. Sélectionnez un milieu de préservation de viabilité anaérobie (ici, nous avons utilisé Cary Blair). Aliquote 1 mL de milieu de conservation dans des tubes stériles de 2 mL à bouchon vissé dans une enceinte de biosécurité, puis transvaser dans la chambre anaérobie.
2. Avant de recevoir des échantillons fécaux, assurez-vous que toutes les fournitures (spatules autoclavées, solution saline stérile et flacons cryogéniques à bouchon à vis contenant des milieux de conservation) sont pré-réduites pendant 24 heures dans la chambre anaérobie.
3. Prélever des échantillons fécaux de souris de manière aseptique à l’aide de tubes stériles à capuchon à pression dans une enceinte de biosécurité à l’aide de gobelets de collecte de selles autoclavés et de pinces. Immédiatement après la collecte, congelez les tubes dans de l’azote liquide.
4. Transférez immédiatement les échantillons dans une chambre anaérobie avec une balance portable pour la pesée. Pré-pesez chaque tube. Pour les échantillons de matières fécales de souris, des granules fécales distinctes peuvent être aliquotes par tube. Si vous utilisez des échantillons humains, utilisez les spatules stériles pour remuer chaque échantillon et divisez-le également dans des flacons cryogéniques. Après avoir pesé à nouveau chaque tube, ajoutez du milieu dans un rapport estimé de 1:10 (masse) à chaque tube pour une conservation optimale.
   REMARQUE : La conservation anaérobie immédiate des échantillons fécaux est recommandée après le prélèvement. Les échantillons qui ne sont pas immédiatement conservés peuvent présenter une viabilité réduite, des changements de composition, etc., par rapport aux échantillons fraîchement conservés ^6,7,8. Les milieux de conservation Cary Blair maintiennent la viabilité des communautés bactériennes tout en inhibant la croissance ultérieure et peuvent être stockés à -80 °C. Pour le rapport estimé entre les milieux de conservation et les matières fécales, bien que le poids humide de l’échantillon fécal soit très variable, il s’agit de la meilleure estimation disponible.
5. Étiquetez, scellez, retirez les flacons de la chambre anaérobie, congelez la pellicule flash avec de l’azote liquide et conservez-la à -80 °C jusqu’à un an ou plus.

2. Construction d’un réseau de réacteurs à 6 puits

1. Utilisez le fichier CAD (Supplementary File 1) pour l’impression 3D du réacteur à 6 puits. Ce fichier peut être soumis à n’importe quelle entreprise d’impression 3D pour la production. Utilisez du plastique transparent translucide de type ABS comme matériau d’impression pour permettre la visualisation à travers les réacteurs tout en résistant aux cycles répétés d’autoclavage.
   REMARQUE : Nous avons commandé les réseaux de réacteurs à 6 puits pour qu’ils soient fabriqués à partir de plastique transparent translucide de type AB par stéréolithographie. Nous recommandons que la matrice soit inclinée (c’est-à-dire que la pièce soit imprimée en 3D à un angle de 30 à 45 %) en production, ce qui réduit les inexactitudes dimensionnelles. Cette correction se traduira par des lignes de couche visibles en diagonale à travers le réseau, mais cela n’affecte pas les performances des réacteurs.
2. À l’aide d’un outil taraudeur de 25 à 28 mm, introduire des filetages à chaque ouverture du réseau de réacteurs.
3. Coupez des bandes de 12 à 25 mm dans le tube en PTFE de 1/8 de pouce et insérez une extrémité de chaque segment de tube dans l’ouverture du filetage d’un raccord mâle luer à filetage 25-28. Vissez solidement les raccords dans les ouvertures désignées pour les déchets et les échantillons du réseau (Figure 2B).
   REMARQUE : Une lame de rasoir peut être utilisée pour raser légèrement les extrémités du tube dans une configuration en forme de cône afin de mieux adapter le tube à l’insertion.
4. Insérez une micro-barre d’agitation dans chaque puits du réacteur, puis vissez un raccord mâle à filetage 1/4-28 dans les trous de source de chaque puits du réacteur (Figure 2B).
5. Vissez les raccords d’adaptation de tuyau cannelé femelle Luer x 1/8 pouce dans les raccords filetés 1/4-28 pour les déchets et la source de chaque puits du réacteur (figure 2C).
6. Vissez les raccords d’adaptateur de tuyau cannelé femelle luer x 3/32 pouce dans les raccords filetés 1/4-28 pour le port d’échantillon. Placez un septum en caoutchouc sur les adaptateurs de cannelure du tuyau de 3/32 de pouce et repliez le haut (Figure 2C).
7. Coupez deux jeux de tubes E-LFL de 2,06 mm dans les longueurs suivantes pour les lignes de déchets et de source : 14 cm, 15,25 cm, 16,5 cm, 17,75 cm, 19 cm et 20,25 cm.
   REMARQUE : Du ruban d’étiquette coloré enroulé autour de la section médiane peut être utilisé pour identifier chaque longueur de tube.
8. Fixez le tube E-LFL de 2,06 mm aux raccords d’adaptateur de cannelure de tuyau Luer femelle de 1/8 de pouce pour les raccords de source et d’évacuation (Figure 2D). Utilisez de l’eau chaude pour rendre le tube plus malléable. Cela permettra au tube de s’adapter facilement aux adaptateurs.
9. Fixez un luer mâle avec un anneau de verrouillage x un raccord adaptateur de tuyau cannelé de 1/8 de pouce à l’autre extrémité du tube. Vissez un adaptateur de tuyau cannelé femelle luer x 1/16 de pouce qui s’y raccorde (Figure 2D).
10. Connectez le tube à 2 arrêts de taille appropriée aux raccords d’évacuation et de source correspondants. Les conduites d’évacuation utilisent des tubes à 2 arrêts de 1,14 mm de diamètre intérieur, tandis que les conduites sources utilisent des tubes à 2 arrêts de 1,02 mm de diamètre intérieur. À l’autre extrémité du tube à 2 butées, fixez un autre raccord d’adaptateur de tuyau cannelé Luer femelle x 1/16 de pouce (Figure 2D).
11. Coupez des morceaux de 20 et 5 cm d’E-LFL, un tube de 2,06 mm, et insérez le luer mâle avec bague de verrouillage x raccords d’adaptateur de cannelure de tuyau de 1/8 de pouce aux deux extrémités de chaque tube. Fixez une extrémité du tube de 5 cm avec le raccord Luer mâle avec bague de verrouillage x adaptateur de tuyau cannelé de 1/8 de pouce au raccord adaptateur de tuyau cannelé femelle inoccupé x 1/16 de pouce à l’extrémité de chaque section de tube à 2 arrêts. Répétez ce processus pour les 19 morceaux de tube restants (Figure 2D).
12. Connectez le tube E-LFL de 2,06 mm pour les conduites sources des puits 1 et 2 du réacteur à l’aide des extrémités opposées d’un té Luer femelle. Fixez l’un des morceaux de tube de 5 cm avec des raccords d’adaptateur mâles Luer avec bague de verrouillage x 1/8 de pouce à chaque extrémité à la sortie centrale du té, menant à une deuxième jonction en T (figure 2E).
13. Connectez le tube source E-LFL, de 2,06 mm pour le troisième réacteur, sur le côté opposé du deuxième té. Un autre tube de 5 cm avec un luer mâle avec une bague de verrouillage x un adaptateur de 1/8 de pouce doit être fixé à une extrémité, tandis que l’autre extrémité doit avoir un luer femelle avec une bague de verrouillage x un adaptateur de 1/8 de pouce. Suivez le même schéma pour les réacteurs 4, 5 et 6 (Figure 2E).
14. Coupez un morceau de 25 cm de tube E-LFL de 2,06 mm, en fixant un raccord d’adaptateur de tuyau cannelé mâle avec bague de verrouillage x 1/8 de pouce à une extrémité du tube, qui se fixera à la dernière jonction en T de Luer femelle restante, et à l’autre extrémité, fixez un raccord d’adaptateur de tuyau cannelé de luer femelle x 1/8 de pouce. Fermez cette extrémité avec du papier d’aluminium (Figure 2E).
    REMARQUE : Pendant l’opération, il est essentiel de garder les extrémités ouvertes stériles, nous vous recommandons donc de les garder recouvertes d’une feuille d’aluminium pendant l’autoclave et fixées en place avec du ruban adhésif.
15. Préparez les conduites de déchets en répétant la même procédure que les conduites sources décrites aux étapes 2.12 à 2.14 (figure 2E).
16. Pour assembler une bouteille de collecte des déchets, fixez sans serrer un bouchon de bouteille à deux trous sur une bouteille de 2 L. Insérez les raccords filetés mâles 1/4-28 dans les deux trous du capuchon. Fixez un luer femelle avec des adaptateurs cannelés de tuyau de 1/8 de pouce au raccord fileté mâle qui ne se connecte pas au tube en PTFE pré-fixé dans le capuchon (Figure 2F).
17. Ensuite, coupez un morceau de 5 cm de tube E-LFL 2,06 mm et connectez-le à l’adaptateur de cannelure du tuyau sur la bouteille. Fixez un luer mâle avec bague de verrouillage x adaptateur de cannelure de tuyau de 1/8 de pouce à l’autre extrémité du tube de 5 cm et couvrez-le d’une feuille d’aluminium (ce tube sert de bouche d’aération ; après l’autoclavage, un filtre de seringue de 0,22 μm sera ajouté pour éviter la contamination ; Figure 2F).
18. Couvrez tout le capuchon avec du papier d’aluminium. Autoclavez les réacteurs et la bouteille de déchets à 121 °C et à un minimum de 15 psi pendant 45 min en utilisant le programme d’échappement lent généralement réglé pour les liquides. Une fois les réacteurs refroidis, serrez les raccords et les joints en feuille d’aluminium et placez-les dans la chambre anaérobie pendant 48 h avant de les utiliser.

3. Préparation des médias MEGA

1. Préparer toutes les solutions mères conformément au tableau supplémentaire 1, au tableau supplémentaire 2, au tableau supplémentaire 3, au tableau supplémentaire 4, au tableau supplémentaire 5, au tableau supplémentaire 6, au tableau supplémentaire 7 et au tableau supplémentaire 8.
2. Dans une bouteille en verre de 2 L, ajouter tous les ingrédients secs du tableau supplémentaire 9, suivis de 1640 ml d’eau ultrapure, puis du reste des ingrédients liquides du tableau supplémentaire 10 . Ajoutez une barre d’agitation et dissolvez-la complètement à feu moyen (90 °C) sur une plaque d’agitation. Le milieu sera de couleur bleu pâle à violet et ne sera pas complètement clair, mais n’aura pas de grumeaux non dissous évidents.
   REMARQUE : L’autoclave du glucose et d’autres sucres en présence de peptides peut entraîner une modification et peut réduire le sucre disponible dans les milieux. Si vous le souhaitez, toutes les solutions de sucre peuvent être filtrées stérilement et ajoutées avec les composants du tableau supplémentaire 10, comme décrit à l’étape 3.7.
3. Une fois le mélange terminé, ajustez le pH du média à 7,0 en ajoutant de l’hydroxyde de sodium (NaOH) 10 N, en mesurant exactement le volume ajouté. Après la mesure du pH, ajoutez 14,4 ml d’eau moins le volume d’hydroxyde de sodium ajouté pour porter le volume à exactement 2 L.
4. Préparez un bouchon de bouteille à deux trous en insérant un raccord fileté mâle luer 1/4-28 mm dans les deux ouvertures.
5. Dans le trou du capuchon non pré-fixé au tube en PTFE, coupez un morceau de 5 cm de tube C-flex et connectez-le à l’ardillon du tuyau de 1/8 de pouce du raccord Luer femelle. À l’autre extrémité du tube de 5 cm, insérez un autre luer mâle avec une bague de verrouillage et un adaptateur de tuyau cannelé de 1/8 de pouce, et couvrez avec une feuille d’aluminium (celle-ci sera également connectée à un filtre de seringue de 0,22 μM).
6. Couvrez l’ensemble du bouchon avec du papier d’aluminium et vissez-le sur le flacon de média MEGA de 2 L. Autoclave à 121 °C et un minimum de 15 psi pendant 45 min, en utilisant le programme d’échappement lent pour les liquides.
7. Retirez le support de l’autoclave et laissez-le refroidir en remuant jusqu’à ce qu’il soit tiède. Ajouter les composants du tableau supplémentaire 10 dans la bouteille de milieu de 2 L dans une enceinte de biosécurité, fermer le couvercle, puis passer à une plaque d’agitation pour homogénéiser. Une fois le fluide refroidi, serrez les raccords et les joints en feuille d’aluminium et placez-les dans la chambre anaérobie pendant 48 h avant de les utiliser.
   REMARQUE : Nous recommandons de faire fonctionner la pompe source à 16 μL/min (0,94 mL/h) pendant un temps de rétention de 16 h. Pour ce débit, un réacteur à 6 puits utilise environ 0,135 L de média par jour. Nous recommandons également de faire fonctionner la pompe à déchets à 40 μL/min pour éviter la formation d’un blocage dans le tube de déchets. Surveillez le tube et le débit, en notant que le débit de déchets peut être augmenté au besoin si des blocages se produisent. Les débits à la source et aux déchets sont modifiables, mais les chercheurs doivent surveiller attentivement la composition de leurs communautés et leurs taux de croissance, car ceux-ci peuvent également changer avec un débit plus rapide ou plus lent. Pour faire fonctionner un réacteur à 6 puits pendant une semaine, nous vous recommandons de faire au moins 2L de média (il consommera un peu plus de 1 L).

4. Configuration du réseau dans la chambre anaérobie

REMARQUE : Il est essentiel de nettoyer l’intérieur de la cagoule et des gants de cagoule avec 3 % de peroxyde d’hydrogène, suivi d’un triple rinçage à l’eau désionisée pour s’assurer qu’il n’y a pas de contamination de surface avant l’assemblage. Si les connexions sont effectuées rapidement après le retrait de la feuille et qu’aucun contact direct n’est établi avec l’intérieur des raccords et des gants de la chambre anaérobie, le risque de contamination est minime

1. Alignez le réseau sur une plaque d’agitation magnétique dans la chambre anaérobie. Assurez-vous que le réseau est correctement aligné en réglant le contrôleur de plaque d’agitation sur la vitesse maximale (1600 tr/min) et en observant les barres d’agitation tourner.
2. Montez le tube à 2 arrêts pour la source et l’évacuation dans les pinces des pompes péristaltiques correspondantes. Si vous le faites moins de 24 heures avant l’utilisation prévue, verrouillez les pinces en place. Sinon, laissez-le lâche jusqu’au moment de l’utiliser pour réduire l’usure du tube.
3. Retirez le capuchon en aluminium sur les raccords d’adaptateur de cannelure de tuyau femelle Luer x 1/8 de pouce sur les conduites de source et de décharge et vissez-le dans les raccords mâles Luer à 1/4 -28 vissés dans les capuchons (assurez-vous que cette ouverture est connectée au tube interne en PTFE).
4. Retirez les bouchons en aluminium et fixez un filtre à seringue de 0,22 μm à la conduite d’aération de 5 cm de la bouteille source et à la conduite d’aération de la bouteille d’évacuation.
5. Commencer l’écoulement à un débit modéré (1 mL/min sur la pompe source et 2 mL/min sur la pompe à déchets) pour commencer à remplir les réacteurs. Assurez-vous que le tube de la conduite d’évacuation dans chaque puits du réacteur est plus bas que celui du tube source, ce qui empêchera le débordement ou la vidange de chaque puits.
6. Lorsque les réacteurs commencent à se remplir, assurez-vous qu’ils atteignent tous le même volume et que le fluide s’écoule dans la conduite de déchets. Avec les mesures décrites ici, le volume de travail de chaque réacteur est de 15 mL.
   REMARQUE : Si un réacteur ne se remplit pas, serrez les raccords desserrés et inspectez les conduites d’origine pour détecter tout problème, en les remplaçant par des extras préparés si nécessaire. Si le problème persiste, remplacez la bouteille source si elle est disponible. Si le niveau du fluide dépasse la conduite de déchets intérieurs dans les réacteurs, vérifiez que le tube en PTFE à l’intérieur de l’orifice de déchets du réacteur est toujours en place.
7. Une fois chaque réacteur rempli, ajustez les paramètres de la pompe au débit de 16 μL/min, puis éteignez les pompes.
8. Laisser le milieu dans les réacteurs et les bouteilles de déchets pendant la nuit avant l’inoculation. Cela permet un conditionnement anaérobie supplémentaire du milieu (pour un total de ~72 h) et permet à l’utilisateur de confirmer la stérilité du système.
9. Pour confirmer la stérilité du système avant l’inoculation de l’échantillon fécal, échantillonnez chaque réacteur et le milieu source directement après le remplissage initial (étape 4.7) et de nouveau après l’étape 4.8. Suivez la procédure d’échantillonnage aseptique des réacteurs décrite à l’étape 6.
   1. S’assurer que la mesure de la densité optique de tous les échantillons est la même que celle du milieu source ; Si une augmentation de la densité optique est observée, une contamination est suspectée et tous les supports et le système doivent être déconstruits, nettoyés et réassemblés.

5. Inoculation d’échantillons fécaux

1. Placez des pointes de pipette stériles de gros calibre, du sérum physiologique stérile, des tubes coniques de 50 ml, des pipettes sérologiques stériles de 25 ml, des seringues de 5 ml et des aiguilles de calibre 16 dans la chambre anaérobie pour les conditionner dans l’environnement anaérobie pendant au moins 24 heures.
2. Calculer la quantité de matières fécales nécessaire pour inoculer le nombre souhaité de réacteurs. Chaque puits du réacteur nécessite 3,8 mL de surnageant dans une boue fécale à 25 % m/v. Pour six puits de réacteur, un total de 22,8 mL de boue fécale à 25 % m/v devrait fournir suffisamment de surnageant pour l’inoculation, ce qui nécessitera 5,7 g de matières fécales solides.
3. Transférez les échantillons fécaux conservés dans des flacons cryogéniques dans la chambre anaérobie et laissez-les décongeler pendant 15 min.
4. À l’aide d’une pointe de pipette à large calibre, transférer les matières fécales des flacons cryogéniques dans un tube conique de 50 ml, fermer hermétiquement et centrifuger à 200 x g pendant 5 minutes pour stabiliser les particules.
5. Transférez à nouveau dans une chambre anaérobie et retirez le surnageant. À l’aide d’une spatule de laboratoire autoclave, transférez les matières fécales dans un nouveau tube conique de 50 ml, pour obtenir une masse totale de 5,7 g. Ajoutez 17,1 ml de solution saline stérile anaérobie dans le tube et fermez hermétiquement.
6. Retirer les tubes coniques de la chambre, homogénéiser par vortex pendant 5 min, puis centrifuger à 200 x g pendant 5 min pour décanter les particules.
7. Stérilisez les septa sur le dessus de chaque réacteur avec une lingette de laboratoire à 10 % d’eau de Javel pendant au moins 2 minutes pendant que les échantillons sont placés dans la centrifugeuse.
8. Retourner les échantillons dans la chambre anaérobie et, à l’aide de pipettes sérologiques stériles, transférer les surnageants dans de nouveaux tubes coniques de 50 mL.
9. Chargez 3,8 mL de surnageant de boue fécale dans six seringues distinctes de 5 mL avec 16 aiguilles de 1,5 g.
10. Retirez la lingette, insérez l’aiguille dans le septum et injectez lentement la boue fécale dans le réacteur.
11. Laisser les communautés fécales s’établir dans chaque réacteur pendant environ 16 à 18 h avant de commencer l’écoulement vers le réacteur. Réglez la plaque d’agitation magnétique à la vitesse maximale à partir du moment où la boue fécale est injectée (1600 tr/min).

6. Prélèvement aseptique d’échantillons dans les puits du réacteur

1. Percez l’emballage sur six seringues stériles de 1 mL et six aiguilles stériles 22G de 3 pouces et placez-les dans la chambre anaérobie pour les dégazer pendant 24 h.
2. Immédiatement avant l’échantillonnage, stérilisez les septa sur le dessus de chaque réacteur avec une lingette de laboratoire à 10 % d’eau de Javel pendant au moins 2 min.
3. Retirez la lingette de laboratoire à l’eau de Javel et fixez immédiatement une aiguille à une seringue et insérez l’aiguille au centre des septa du premier puits du réacteur.
4. Prélevez 1 mL de l’échantillon, retirez l’aiguille des septa et transférez l’échantillon de la seringue dans un tube étiqueté de 1,7 mL pour une utilisation en aval. Les septa en caoutchouc se refermeront lorsque l’aiguille sera retirée. Utilisez une aiguille et une seringue neuves pour chaque puits de réacteur afin d’éviter la contamination croisée.
5. Si le surnageant est souhaité, retirez les tubes de la chambre anaérobie et centrifugez à 20 000 x g pendant 1 min pour granuler les cellules bactériennes.
6. Transvasez le surnageant dans un tube de 1,7 mL étiqueté séparément et conservez-le à -80 °C.

7. Déconstruction et nettoyage du système de mini-bioréacteur

1. Débranchez la bouteille source du té Luer source et augmentez le débit (1 mL/min sur la pompe source et 2 mL/min sur la pompe à déchets) pour commencer à vider le tube. Laissez le tube se vider complètement. Éteignez la plaque d’agitation.
2. Une fois le tube vide, débranchez la bouteille de déchets du té Luer usagé. Ensuite, placez l’ensemble du réacteur dans le sas de la chambre anaérobie et retirez-le de la chambre.
3. Débranchez tous les tubes E-LFL 2,06 mm et les segments de tube en PTFE et jetez-les. Débranchez tous les raccords et placez-les dans une solution d’eau de Javel à 10 %.
4. Retirez les mini-barres d’agitation de chaque puits et placez-les dans la solution d’eau de Javel. Inversez le réseau du réacteur pour vider le média dans une solution d’eau de Javel à 10 % distincte pour la désinfection. Ensuite, immergez le tableau vide dans une solution d’eau de Javel fraîche.
5. Laissez tous les raccords et le réseau du réacteur tremper dans la solution d’eau de Javel à 10 % pendant 30 minutes (un trempage prolongé provoquera une décoloration).
6. Rincez les raccords et le réseau de réacteurs avec de l’eau déminéralisée, puis immergez-les toute la nuit dans une solution détergente enzymatique selon les instructions du fabricant.
7. Rincez trois fois les raccords et le réseau de réacteurs avec de l’eau déminéralisée, puis laissez sécher complètement à l’air libre pendant au moins 3 jours. Une fois secs, le réseau de réacteurs et les raccords peuvent être utilisés à nouveau pour l’assemblage.

Résultats

Des échantillons de matières fécales ont été prélevés sur des souris colonisées avec du lisier fécal humain 2 semaines après l’inoculation et stockés à -80 °C. Le système de bioréacteur a été mis en place avec un flux continu de média MEGA pour deux puits de réacteur répétés (figure 3A). La boue fécale a été préparée à partir des boulettes fécales de souris conformément au protocole décrit à l’étape 6, et les deux réacteurs ont été inoculés par port d’échant...

Discussion

Le système de mini-bioréacteur décrit dans ce protocole permet de cultiver des communautés fécales indépendantes pour des expériences parallèles. Cette capacité à étudier les communautés microbiennes en isolant les facteurs de l’hôte est une approche essentielle pour comprendre la capacité intrinsèque des microorganismes à s’adapter à leur environnement. Ce protocole peut être facilement adapté à la culture de consortiums bactériens définis ou même de cultures d’isolats uniques si vous l...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 mL BD Slip Tip Seringue stérile, à usage unique	Fisher Scientific	309659
1/4-28 mm filetage à adaptateur mâle barbelé (3,2 mm), 5/paquet	Cole-Parmer	008NB32-KD5L	Pour construire 1 réseau à 6 puits, besoin de 2 paquets
10M NaOH (hydroxyde de sodium)	Sigma	72068-100ML
2.0ml Tube à bouchon à vis, non-moleté, jupe, naturel, E-Beam Tube stérile avec capuchon attaché	Fisher Scientific	14-755-228
2mag MIXdrive 60 Entraînement d’agitation	2mag	40060	Plaque d’agitation magnétique à 60 positions (ajout facultatif de capacité de chauffage - cat# 40260)
Réacteur à 6 puits, ABS-Like Translucide Plastique transparent	Protolabs Personnalisé		Voir les fichiers supplémentaires pour le fichier .stl pour l’impression 3D
Éthanol absolu (200 preuve)	Fisher Scientific	BP2818
Acide acétique, glacial	Sigma	A6283
Adaptateur, nylon, luer mâle à filetage 1/4-28, 25/paquet	Cole-Parmer	EW-45505-82	Pour construire 1 réseau de 6 puits, besoin de 6 (1 paquet)
Feuille d’aluminium	Fisher Scientific	01-213-100
Chambre anaérobie	Coy Lab Produits	Type B
Bel-Art  ; SP Scienceware Flea Micro Spinbar Barres d’agitation magnétiques (1/pk)	Fisher Scientific	22-261679	Pour construire 1 réseau de 6 puits, il faut 6  ;
Armoire de biosécurité classe 2	Acide butyrique Nuaire
	Sigma	B103500  ;
CaCl2 · ; 2H2O (chlorure de calcium dihydraté)	Sigma	C7902
Lingettes germicides Clorox Healthcare avec eau de Javel, non parfumées, 6 » x 5 », paquet de 150 lingettes	Office Depot	129202
D-(-)-Fructose	Sigma	F0127-100G
D-(+)-Cellobiose	Sigma	C7252-100G
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-100G
D-(+)-Maltose monohydraté	Sigma	M5885-100G
Drill America Plug Hand Tap DWTP1/4-28	Home Depot	305699489
Dulbecco’s Saline tamponnée au phosphate, 1X sans Ca ni Mg, Genesee		stérile 25-508
Luer femelle × ; 1/16&Prime ; adaptateur de tuyau cannelé, Nylon, 25/paquet	Cole-Parmer	EW-45502-00	Pour construire 1 réseau à 6 puits, besoin de 24 (1 paquet)
cannelé femelle × ; 1/8&Prime ; Nylon 25/paquet	Cole-Parmer	EW-45502-04	Pour construire 1 réseau à 6 puits, besoin de 6 (1 paquet)
Adaptateur de tuyau cannelé femelle × ; 3/32&Prime ; adaptateur de tuyau cannelé, Nylon, paquet de 25	Cole-Parmer	EW-45502-02	Pour construire 1 réseau à 6 puits, besoin de 6 (1 paquet)
Té Luer femelle, Nylon, 25/paquet	Cole-Parmer	EW-45502-56	Pour construire 1 réseau de 6 puits, besoin de 10 (1 paquet)
FeSO4 · ; 7H2O (Sulfate de fer [II] Heptahydrate)	Sigma	F8633
Hematin	Sigma	H3281
Histidine	Sigma	H7750
Acide isovalérique	Sigma	129542
K2HPO4 dibasique (hydrogénophosphate dipotassique)	Sigma	P2222-1KG
KH2PO4 monobasique (dihydrogénophosphate de potassium)	Sigma	P0662-500G
Embouts de pipette à grand orifice	Fisher Scientific	02-707-134
Chlorhydrate de L-cystéine	Sigma	C1276-10G
Luer mâle avec bague de verrouillage × ; 1/8&Prime ; adaptateur de cannelure de tuyau, Nylon, 25/paquet	Cole-Parmer	EW-45505-04	Pour construire 1 réseau à 6 puits, besoin de 42 (2 paquets)
Extrait	de viande Sigma	70164-500G
Med Vet International  ; Aiguille Exel, 20G x 1", Hypodermique, 100/boîte, 26417	Fisher Scientific	50-209-2532
Menadione (Vitamine K3)	Sigma	M5625
MgSO4  ; &point moyen ; 7H2O (Sulfate de Magnésium Heptahydraté)	Sigma	M1880-500G  ;
Milli-Q eau
NaCl (chlorure de sodium)	Sigma	S9888-500G  ;
NaHCO3 (bicarbonate de sodium)	Sigma	S5761-500G
Omnifi t Q-series bouchon de bouteille à deux trous	Cole-Parmer	00945Q-2	Pour construire 1 réseau de 6 puits, besoin de 1
PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115V	MasterFlex	ISM939C-115V	Pompe péristaltique à 24 canaux, nécessite 1 pour la source et 1 pour les déchets
Precision Seal® ; septa en caoutchouc, blanc, tube en verre de 7 mm de diamètre extérieur (100/pk)	Millipore Sigma	Z553905-100EA	Pour construire 1 réseau de 6 puits, il faut 6 septa
d’acide propionique	Sigma	P5561  ;
Tubulure de pompe, 2 arrêts, Tygon S3 E-Lab, 1,02 mm ID ; 12/PK	VWR	MFLX96460-28	Pour construire 1 réseau de 6 puits, il faut 6  ; (1 paquet)
Tubulure de pompe, 2 arrêts, Tygon S3 E-Lab, 1,14 mm ID ; 12/PK	VWR	MFLX96460-30	Pour construire 1 réseau de 6 puits, besoin de 6 (1 paquet)
Puritan Cary-Blair Medium, 5 ml	Fisher Scientific	22-029-646
Bouteilles de stockage de supports ronds PYREX 2L, avec bouchon à vis GL45	Fisher Scientific	06-414-1E
Lames de rasoir	Genesee	12-640
Résazurine, sel de sodium	ACROS Organics de ThermoFisher	AC41890-0010
Amidon soluble	Sigma	S9765-100G
Micro-spatules en acier inoxydable, lame en forme de cuillère	Fisher Scientific	S50823
TBNG TYGON ELFL 2.06MMID 100'VWR		MFLX06449-42	Pour construire 1 réseau de 6 puits, il faut 205,5 cm
de supplément d’oligo-éléments	ATCC	MD-TMS
Trypticase peptone (BBL)	Fisher Scientific	B11921
Tube, PTFE, 1/8&Prime ; (3,2 millimètres) OD & fois ; 1,5 mm ID, 10 M	Cole-Parmer	008 T32-150-10	Pour construire 1 réseau de 6 puits, il faut un
Tween 80	Sigma	P1754
Supplément vitaminique	ATCC	MD-VS
Extrait de levure (Bacto)	Fisher Scientific	DF0127-17-9