Transplantation orthotopique des membres antérieurs du rat

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour démontrer la faisabilité microchirurgicale de la transplantation de membres antérieurs de rat. Ce modèle peut servir de plate-forme translationnelle importante pour la recherche VCA.

Résumé

L’allotransplantation composite vascularisée (ACV) implique la transplantation de plusieurs types de tissus, notamment la peau, les muscles, les os et les nerfs, offrant une option reconstructive prometteuse pour les patients souffrant de blessures traumatiques graves ou de défigurations. Malgré son potentiel de transformation, l’ACV a rencontré des défis importants tels que le rejet du greffon, les complications chroniques de l’immunosuppression et les subtilités de la récupération neuromusculaire.

Nous utilisons un modèle de membre antérieur de rat comme plate-forme rentable et anatomiquement pertinente pour relever ces défis. Le membre antérieur du rat reflète étroitement l’anatomie des membres humains, ce qui renforce l’impact translationnel de nos résultats. Des études antérieures ont validé ce modèle pour mesurer de manière fiable et reproductible la récupération fonctionnelle, l’établissant ainsi comme un outil clé pour évaluer la trajectoire de rejet des greffes de membres antérieurs.

De plus, le modèle offre une occasion précieuse d’explorer des approches thérapeutiques innovantes et de servir de bonne plate-forme translationnelle pour de nouvelles techniques de préservation. Grâce à une étude plus approfondie de ce modèle, nous visons à approfondir notre compréhension des mécanismes à l’origine du rejet de greffe et de la récupération neuromusculaire. En fin de compte, ce travail vise à ouvrir la voie à l’amélioration des résultats cliniques de l’ACV, en abordant à la fois les limites actuelles et les défis futurs de la médecine de transplantation.

Introduction

L’allotransplantation composite vascularisée (AVC) est une procédure qui change la vie pour reconstruire de graves défauts tissulaires. L’ACV fait référence à la transplantation d’un tissu composite composé de peau, de muscles, d’os, de tissu conjonctif, de vaisseaux sanguins et de nerfs. Un perfectionnement et une exploration plus poussés des techniques d’ACV bénéficieraient profondément aux patients souffrant de blessures traumatiques ou de défigurations¹. Cependant, son application plus large est remise en question par des obstacles persistants tels que le rejet du greffon, les complications dues à l’immunosuppression à long terme, la récupération neuromusculaire et la logistique péri-transplantation.

Le modèle des membres antérieurs du rat s’est imposé comme un choix privilégié pour les études VCA en raison de son rapport coût-efficacité et de sa ressemblance étroite avec les caractéristiques anatomiques et neuromusculaires humaines ^2,3. Nos travaux précédents ont démontré que ce modèle fournit un moyen fiable et reproductible d’évaluer la récupération fonctionnelle comportementale⁴. Dans cette étude, nous présentons un guide détaillé, étape par étape, des techniques microchirurgicales essentielles requises pour ce modèle.

Au fur et à mesure que la recherche VCA continue d’évoluer, le modèle des membres antérieurs du rat permettra d’étudier mécaniquement le processus de rejet, la régénération nerveuse et la récupération fonctionnelle neuromusculaire. Les chercheurs pourraient explorer de nouvelles techniques de conservation, évaluer l’efficacité des méthodes de perfusion mécanique et tester des thérapies immunomodulatrices émergentes, ce qui pourrait aider à réduire la dépendance actuelle à l’immunosuppression à long terme.

Protocole

Les interventions chirurgicales ont été effectuées selon les protocoles approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux (RA18M74) de l’Université Johns Hopkins, conformément aux lignes directrices établies par les National Institutes of Health et l’American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care.

1. Procédure du donneur (figure 1)

1. Procéder à l’induction de l’anesthésie par inhalation d’isoflurane à une concentration de 5 % et maintenir à 1 % tout au long de la procédure. Commencez la procédure après avoir confirmé le niveau d’anesthésie précis par pincement des orteils.
2. Faites une incision circonférentielle à environ 1 cm au-dessus du coude. Divisez la peau et exposez le tissu sous-cutané superficiel sous-jacent sans l’endommager (Figure 1A).
3. Disséquez le tissu sous-cutané/fascia, cautérisez tous les vaisseaux superficiels et transectez. Par la suite, le deltoïde, une partie du grand pectoral, et le triceps brachial seront exposés.
4. Disséquer brusquement sous le muscle grand pectoral, révélant les vaisseaux brachiaux, ainsi que le nerf médian et le nerf ulnaire (Figure 1B).
5. Cautériser la veine superficielle du muscle deltoïde et transecter proximalement, puis transecter le muscle deltoïde perpendiculairement à l’orientation de la fibre musculaire. Ensuite, disséquez et transectez le grand et le petit pectoral, révélant l’artère axillaire, la veine et le nerf. (Figure 1C).
6. Transectez les nerfs médian, ulnaire et radial à leur extrémité proximale (juste après la séparation), en préservant autant de longueur que possible.
7. Disséquez et libérez l’artère et la veine brachiale.
8. Transect du biceps brachial, du triceps brachial et du muscle grand dorsal. Assurez-vous que l’humérus est correctement exposé à la fin de la dissection.
9. À l’aide d’une pince à rongeur, transectez l’os distal à la tubérosité deltoïde de l’humérus.
10. Vérifiez doucement la lumière de l’artère et de la veine brachiales (Figure 1C). Rincer le greffon avec 6 mL de solution saline héparinisée.
11. Montez le ballonnet en polyimide sur l’artère brachiale et la veine, respectivement (figure 1D).
12. Enveloppez le greffon avec de la gaze de coton humide et conservez-le à 4 °C.
13. Euthanasier le rat donneur par un anesthésique inhalé (isoflurane) en surdose. Une fois qu’il ne répond plus à une pincement de l’orteil, effectuez une thoracotomie et excisez le cœur.

2. Procédure du destinataire (figure 2)

1. Procéder à l’induction de l’anesthésie par inhalation d’isoflurane à une concentration de 5 % et maintenir à 1 % tout au long de la procédure. Confirmez l’état de l’anesthésie par pincement des orteils.
2. Faites une incision circonférentielle à environ 1-2 cm au-dessus du coude.
3. Disséquez les vaisseaux sous-cutanés et cautérisez les plus gros vaisseaux pour exposer le deltoïde, une partie du grand pectoral et le muscle triceps brachial.
4. Effectuez une dissection contondante sous le muscle grand pectoral pour révéler les vaisseaux brachiaux, ainsi que les nerfs médian et ulnaire.
5. Transect du deltoïde et d’une partie du muscle grand et petit pectoral à leur extrémité distale, exposant les vaisseaux brachiaux, les nerfs médian et ulnaire (Figure 2A).
6. Disséquer et transecter les nerfs médian et ulnaire à leur extrémité distale. Lister toutes les branches vasculaires (Figure 2B).
7. Transectez le biceps brachial, le triceps brachial et le muscle grand dorsal pour exposer l’humérus. Cautériser soigneusement tout saignement des muscles transectés.
8. Transect de l’humérus au niveau de la tubérosité deltoïde. Utilisez de la cire d’os pour sceller la cavité de la moelle.
9. Utilisez une tige intramédullaire pour reconnecter la cavité de la moelle osseuse du donneur et du receveur, puis utilisez de la cire osseuse pour sceller la connexion. Suturez le muscle triceps brachial avec une suture résorbable 6-0, créant ainsi une plate-forme pour l’anastomose des vaisseaux.
10. Effectuer une neurorragie épipérineuriale avec suture interrompue 10-0 du nerf radial.
11. Réaliser l’anastomose vasculaire à l’aide d’une technique de brassard sans suture (Figure 2C).
12. Effectuer une neurorragie épipérineuriale avec des sutures 10-0 interrompues pour reconnecter les nerfs médian et ulnaire (Figure 2D).
13. Reconnectez le muscle deltoïde et le muscle grand pectoral à l’aide de sutures interrompues.
14. Fermez la plaie avec une suture non résorbable 4-0.
15. Administrer une solution saline chaude et stérile à 2 % du poids corporel par voie sous-cutanée à la fin de la chirurgie.
16. Observez l’animal pendant au moins 4 h sous une lampe chauffante pour récupérer. Retournez-le à l’animalerie une fois qu’il est alerte, qu’il peut se tenir debout, faire preuve de mouvement coordonné et obtenir de l’eau et de la nourriture de manière indépendante.

3. Prise en charge post-greffe à long terme

1. Surveillez les animaux tous les jours pour détecter les signes de douleur et de détresse tels que définis ci-dessous.
   1. Vérifiez l’anorexie indiquée par l’absence de matières fécales dans la cage.
   2. Vérifiez si l’animal ne boit pas d’eau, ce qui entraîne une déshydratation mise en évidence par la tente de la peau.
   3. Vérifiez si l’animal est voûté, s’il ne veut pas bouger, s’il privilégie un membre ou s’il garde le site d’incision.
   4. Vérifiez si l’animal ne se toilette pas, ce qui se reflète dans un pelage ébouriffé ou sale.
   5. Vérifiez si l’animal ne lèche/griffe pas excessivement. Vérifiez s’il y a une rougeur et un gonflement au site de l’incision et une automutilation.
   6. Vérifiez s’il y a un comportement agressif, en particulier lorsque vous essayez de soulever l’animal.
   7. Vérifiez si l’animal halète, a une respiration laborieuse et a un écoulement nasal/oculaire brun rougeâtre.
   8. Vérifiez la présence d’une septicémie.
2. Retirez les sutures 14 jours après l’opération.
3. Administrer une deuxième dose de buprénorphineSR (dose chez le rat : 1,0 mg/kg SC) le jour 2 postopératoire (POD2 ; 48 h après la dose initiale).
4. Commencer une évaluation fonctionnelle hebdomadaire à la semaine 4 après la transplantation.
   1. Brièvement, sous anesthésie générale, fixer le membre antérieur de l’animal en abduction à 90°. Placez deux électrodes à aiguille à 1 mm d’intervalle dans l’aisselle près de l’insertion du grand pectoral sur l’humérus.
   2. Stimuler le nerf médian proximal par voie percutanée à 10 V pour induire une contraction tétanique maximale des fléchisseurs.
   3. Une fois que la flexion digitale complète forme une prise, placez une boucle métallique reliée à un dynamomètre sur la paume et fixez-la dans les doigts fléchis. Ensuite, tirez sur le dynamomètre jusqu’à ce que la prise soit perdue, en enregistrant la force maximale (en Newtons).

Résultats

La survie des greffons peut être surveillée et déterminée par observation macroscopique. La figure 3 présente des images représentatives du suivi à court terme (POD7) et à long terme (POD120). Le greffon a pu se rétablir sans signes apparents de nécrose. Les données de survie sont présentées à la figure 4. Des échantillons de peau et de muscle sont prélevés au point final désigné. Des images histologiques représentatives sont présentées à la...

Discussion

La transplantation orthotopique des membres antérieurs chez le rat est un modèle couramment utilisé dans la transplantation reconstructive expérimentale car elle contient non seulement des tissus composites vascularisés, mais permet également d’évaluer la récupération fonctionnelle. Une technique de suture conventionnelle pour l’anastomose vasculaire est très complexe et exige des compétences microchirurgicales avancées qui nécessitent des années de formation en microchirurgie. Pour rédu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10-0 Micro Suture Non Stérile	AROSurgical	TK-107038
4-0 Sharpoint Nylon Noir	sutures	A1667N
4-0 Sharpoint Polysyn Taper		seringues G214N
5 mL	MDC	2045
6-0	soie Fisher Scientific	NC9742105
ABB-22 V Double Micro Vessel	S& T	00480
B-1 V Pince à micro-cuve unique	S& T	00462
BD Quincke Esuures à aiguille spinale		405073
Castroviejo Micro Porte-aiguilles	F.S.T	12061-02
Chatilon DFE II dynamomètre  ;	Ametek	DFE série
Coton à pointe JH	Supply magasin	100252
Ciseaux fins - Carbure de tungstène	F.S.T	14569-09
Pince	S& T	FRS-15 RM-8
Éponges de gaze	Fisher Scientific	22-362178
Halsted-Mosquito Hemostats	F.S.T	13009-12
Héparine	JHH Pharmacie	NDC 63323-540-05
Cathéter I.V. Radio-opaque 24 G	Esutures	SMTH5053
Jewelers Pince de coagulation bipolaire, acier inoxydable	ASSI	103000BPS03
Ciseaux à ressort Vannas à manche rond	F.S.T	15400-12
Forceps	Spéciale S& T	FRAS-15 RM-8
Dilatateurs de cuve - Instruments équilibrés	F.S.T	18602-15

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