Method Article

Une approche simplifiée pour la protéomique basée sur la spectrométrie de masse à l’aide de régions tissulaires sélectionnées

DOI:

10.3791/68076

⸱

April 18th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science, School of Medicine, CHA University, 2Department of Proteomic Research, CHA Future Medicine Research Institute, 3Department of Pathology, Seoul National University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous établissons une méthode protéomique basée sur la spectrométrie de masse en utilisant des régions d’intérêt isolées dans des coupes de tissus fixées au formol et incluses dans la paraffine. Ce protocole est utilisé pour analyser le protéome de zones tissulaires spécifiques dans des coupes de tissus archivées fixées au formol et incluses dans la paraffine.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La protéomique basée sur la spectrométrie de masse (MS) permet une analyse complète du protéome sur un large éventail d’échantillons biologiques, y compris des cellules, des tissus et des fluides corporels. Les coupes de tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine (FFPE), couramment utilisées pour l’archivage à long terme, sont devenues des ressources précieuses pour les études protéomiques. Au-delà de leurs avantages en matière de stockage, les chercheurs peuvent isoler les régions d’intérêt (ROI) des régions tissulaires normales grâce à des efforts de collaboration avec des pathologistes. Malgré ce potentiel, il n’existe toujours pas d’approche rationalisée pour les expériences protéomiques englobant l’isolation du retour sur investissement, la préparation protéomique des échantillons et l’analyse MS. Dans ce protocole, un flux de travail intégré qui combine la macrodissection des ROI, la préparation d’échantillons basée sur le piégeage en suspension et l’analyse MS à haut débit est présenté. Grâce à cette approche, les ROI des tissus FFPE des patients, composés de néoplasmes kystiques séreux bénins (SCN) et de néoplasmes mucineux papillaires intracanalaires précancéreux (IPMN) diagnostiqués par les pathologistes, ont été macrodisséqués, collectés et analysés, ce qui a entraîné une couverture protéologique élevée. De plus, les différences moléculaires entre les deux néoplasmes kystiques pancréatiques distincts ont été identifiées avec succès, démontrant ainsi l’applicabilité de cette approche pour faire progresser la recherche protéomique avec des tissus FFPE.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pendant des décennies, les tissus humains excisés chirurgicalement ont été archivés sous forme de blocs FFPE (Formalin Fixed-Formalin Embedded Within). Ces blocs tissulaires préservent initialement la structure tridimensionnelle (3D) intégrée dans la paraffine. Les tissus sont ensuite découpés à l’aide de microtomes, montés sur des lames et colorés, généralement à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) ou à l’immunohistochimie (IHC), afin de faciliter le diagnostic histopathologique par des pathologistes expérimentés 1,2. Les tissus FFPE offrent des avantages distincts pour le stockage à long terme en raison de la réticulation des protéines induite par le formol, qui arrête l’activité enzymatique et protéolytique3. Parce qu’ils soutiennent la construction de grands ensembles d’échantillons bien archivés, les tissus FFPE ont été considérés comme une pierre angulaire pour la découverte de biomarqueurs dans divers domaines, y compris la génomique 4,5,6,7.

Cependant, leur application dans la protéomique basée sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) a toujours posé des défis. L’une des principales limitations est la réticulation des protéines induite par le formol, qui interfère avec la digestion tryptique - une étape critique de l’analyse globale du protéome8. De plus, la faible quantité de protéines récupérables dans les lames de tissus rend souvent les méthodes conventionnelles de préparation d’échantillons inadaptées. Malgré ces défis, les progrès ont démontré que les réticulations protéiques peuvent être inversées par un traitement prolongé à haute température 9,10,11. Parallèlement, les méthodes de préparation d’échantillons optimisées pour les échantillons de protéines de faible quantité ont élargi l’utilisation des tissus FFPE dans la recherche protéomique 12,13,14,15.

L’un des avantages significatifs de l’utilisation des lames de tissus FFPE en protéomique réside dans leur capacité à permettre une analyse spécifique à une région. Les lames FFPE contiennent généralement à la fois des lésions et des tissus normaux adjacents (ANT). L’analyse de l’ensemble du tissu sans discernement risque de confondre les résultats en raison de signatures moléculaires mixtes. En revanche, l’isolement et l’analyse des régions d’intérêt (ROI) - lésions par rapport à l’ANT - permettent une caractérisation plus précise des caractéristiques moléculaires spécifiques aux régions pathologiques. Par conséquent, les approches basées sur la FFPE sont devenues de plus en plus populaires dans les études de protéomique 16,17,18,19,20. Malgré leur application croissante, un flux de travail rationalisé qui décrit l’ensemble de l’expérience protéomique étape par étape reste encore rare. En particulier, aucun protocole basé sur la vidéo n’a été publié.

Dans cette étude, un flux de travail protéomique robuste basé sur la LC-MS, adapté au profilage précis des changements moléculaires dans des régions spécifiques aux lésions, a été établi. À l’aide de tissus FFPE diagnostiqués par deux pathologistes, les ROI des tumeurs kystiques séreuses bénignes (SCN) et des tumeurs mucineuses papillaires intracanalaires précancéreuses (IPMN) ont été macrodisséquées, collectées et analysées. Le protocole intègre une macrodissection des ROI, une préparation d’échantillon basée sur le piégeage en suspension optimisée pour des apports minimaux de protéines, et une analyse DEA (Data-Independent Acquisition) à plage étroite. Cette méthode a permis d’identifier plus de 9 000 protéines dans des zones tissulaires d’environ 1 cm², déchiffrant des signatures protéomiques distinctes associées au NSC et à l’IPMN.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été examinée et approuvée par le Conseil d’examen institutionnel de l’hôpital universitaire national de Séoul (IRB n° 1904-114-1028). Tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit pour participer à l’étude. Des informations détaillées sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole sont présentées dans le tableau des matériaux.

1. Récupération d’antigènes tissulaires FFPE pour la préparation d’échantillons protéomiques

REMARQUE : Assurez-vous que les scalpels et tous les matériaux, tels que le tube utilisé, sont stériles pour éviter toute contamination croisée. Les protocoles de cette étude peuvent être adaptés à n’importe quel tissu FFPE avec des modifications mineures en fonction de la configuration du laboratoire.

  1. Découpez des coupes de tissu FFPE de 10 μm dans des blocs de tissu FFPE entiers et placez-les sur des lames de verre.
    REMARQUE : Dans cette étude, le tissu FFPE du kyste pancréatique humain (deux types différents de tissu kystique - SCN et IPMN) a été utilisé pour la préparation des échantillons de protéomique.
  2. Retirez la cire de paraffine du tissu FFPE (déparaffiniser) avec deux lavages au xylène avec prudence : un pendant 5 min et un autre pendant 2 min.
  3. Réhydratez le tissu par un lavage en série avec un mélange d’éthanol gradué : 3 min chacun dans 100 %, 85 %, 70 % et 50 % d’éthanol, suivi d’un rinçage à l’eau déminéralisée.
    REMARQUE : Assurez-vous que le xylène et l’éthanol sont manipulés dans une hotte chimique.

2. Extraction des protéines tissulaires FFPE

  1. Préparez une lame de tissu colorée à l’HE ou à l’IHC sur laquelle le retour sur investissement est indiqué par les pathologistes.
  2. Placez la lame de tissu non coloré et la lame de tissu coloré avec leurs côtés arrière face à face, en les alignant ensemble. Assurez-vous que le retour sur investissement est observé à travers la lame de verre.
  3. Retirez les régions tissulaires non intéressées à l’aide du scalpel.
    REMARQUE : Si les tissus normaux adjacents doivent être analysés, collectez-les dans les autres tubes.
  4. Grattez les ROI des tissus jusqu’au centre de la lame à l’aide du scalpel et transférez-les dans les tubes de liaison propres à faible teneur en protéines de 1,5 ml.
  5. Ajouter 180 μL de tampon de lyse au dodécylsulfate de sodium (SDS) (5 % SDS, 2 mM de tris (2-carboxyéthyl)phosphine) [TCEP], 300 mM de pH 8,5 Tris-HCl dans de l’eau déminéralisée) dans chaque tube.
    REMARQUE : S’assurer que le volume du tampon de lyse est suffisant pour solubiliser le tissu pendant la sonication et pour suspendre les protéines extraites. Un tampon insuffisant peut entraîner une lyse tissulaire incomplète, tandis qu’un tampon excessif peut diluer le lysat de protéines.
  6. Effectuer la sonication de la sonde à une amplitude de 20 %, en appliquant 10 cycles de 5 s allumés et 5 s éteints.
  7. Incuber les échantillons à 100 °C pendant 3,5 h avec 1 000 x g.
    REMARQUE : Effectuez une sonication à l’eau des échantillons pendant 1 min toutes les heures pendant l’incubation pour une extraction efficace des protéines.
  8. Après l’incubation, refroidissez l’échantillon à température ambiante (RT) pendant 10 min. Centrifuger les échantillons à 16 000 x g pendant 10 min à RT pour séparer les débris tissulaires du surnageant.
  9. Recueillir le surnageant dans un tube propre et étiqueté et le conserver à -80 °C jusqu’à nouvel ordre.

3. Quantification protéique du lysat tissulaire FFPE

REMARQUE : La plupart des étapes de dosage de l’acide bicinchoninique pour la quantification des protéines sont basées sur les instructions du fabricant, avec des modifications mineures. Il est recommandé de préparer les réactifs conformément aux directives du fabricant.

  1. Préparer des étalons d’albumine sérique bovine (BSA) de concentration variable en diluant en série la solution mère (2 mg/mL de BSA). Si nécessaire, diluer les échantillons avec un facteur de dilution de 20 ou 40.
  2. Préparez l’eau désionisée comme blanc et le tampon de lyse SDS comme contrôle de l’échantillon.
  3. Pipette de 9 μL d’étalons, blanc, contrôle d’échantillon et échantillons au centre du puits de microplaque.
  4. Ajouter 4 μL de solution de réactif de compatibilité à l’échantillon dans chaque puits.
  5. Couvrez la plaque et mélangez sur une plaque en secouant à vitesse moyenne pendant 1 min. Ensuite, incubez la plaque à 37 °C pendant 15 min.
  6. Ajouter 260 μL de réactif de travail BCA dans chaque puits, puis incuber la plaque à 37 °C pendant 30 min.
  7. Refroidir la plaque à RT pendant 3 min.
  8. Mesurer l’absorbance des puits à 562 nm sur un lecteur de plaques.
  9. Soustraire la valeur d’absorbance de 562 nm du blanc de celle de tous les échantillons et de l’échantillon témoin.
  10. De plus, soustrayez la valeur d’absorbance de 562 nm du témoin d’échantillon soustrait à blanc de celle de tous les échantillons.
  11. Tracez et utilisez la courbe standard pour déterminer la concentration en protéines de chaque échantillon.
    REMARQUE : S’assurer que les 200 à 250 μg de protéines estimés sont extraits de trois lames de verre de tissus FFPE, chacune d’une surface approximative de 1cm2.

4. Précipitation de l’acétone des protéines

REMARQUE : S’assurer qu’un total de 100 à 300 μg de protéines est utilisé pour la précipitation de l’acétone et la digestion des protéines par piégeage en suspension.

  1. Placez l’échantillon de protéines (correspondant à 100-300 μg) dans un tube compatible avec l’acétone.
  2. Ajoutez -20 °C d’acétone dans un volume cinq fois supérieur au volume de l’échantillon dans le tube.
  3. Incuber le mélange à -20 °C pendant 18 h.
  4. Centrifuger le tube à 16 000 x g pendant 15 min.
  5. Éliminez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille de protéine.
  6. Ajoutez 500 μL d’acétone à -20 °C et répétez les étapes 4.4-4.5.
  7. Faites sécher l’échantillon à l’air.

5. Digestion des protéines basée sur le piégeage en suspension

REMARQUE : La procédure de digestion des protéines à l’aide d’un filtre à piégeage en suspension a été adaptée à partir des instructions du fabricant, avec des modifications mineures.

  1. Préparer un tampon de lyse de piégeage en suspension (5 % SDS, 5 mM TCEP, 50 mM pH 8,5 TEAB dans de l’eau désionisée).
  2. Ajoutez 40 μL de tampon dans le tube d’échantillon et faites un tourbillon complet pour dissoudre la pastille de protéine séchée à l’air.
  3. Incuber l’échantillon à 100 °C en agitant à 1 000 x g pendant 35 min.
  4. Ajouter 10 μL du réactif alkylant (100 mM de chloroacétamide [CAA] dans 100 mM de pH 8,5 de bromure de tétraéthylammonium [TEAB]) à l’échantillon.
  5. Incuber à RT en secouant à 300 x g pendant 1 h.
  6. Préparez un acidifiant (10 % d’acide trifluoroacétique [TFA] dans de l’eau déminéralisée) avec prudence. Assurez-vous que le TFA, un acide fort, est manipulé dans une hotte chimique.
  7. Ajouter 5 μL d’acidifiant à l’échantillon pour obtenir une concentration finale de 1 % de TFA (volume final de l’échantillon : 55 μL).
  8. Vérifiez le pH de l’échantillon à l’aide de papier pH. Assurez-vous que le pH est inférieur à 1.
  9. Ajouter 350 μL de tampon de liaison/lavage-1 (0,1 M, pH 8,5 TEAB à 90 % MeOH) à l’échantillon pour piéger les protéines.
    REMARQUE : Évitez le vortex et la centrifugation pendant le piégeage des protéines (étape 5.9) pour éviter la perte d’échantillon. Des quantités suffisantes de protéines assurent la formation de protéines colloïdales visibles particulaires d’aspect translucide.
  10. Placez la colonne de piégeage en suspension dans un tube de 2 mL et transférez l’échantillon entier, y compris tout matériau insoluble, dans la colonne de piégeage en suspension.
  11. Centrifuger la colonne à 4 000 x g pendant 50 s pour piéger les protéines.
    REMARQUE : Assurez-vous que tout l’échantillon passe à travers la colonne ; Sinon, répétez la centrifugation jusqu’à la filtration complète.
  12. Ajouter 400 μL de tampon de lavage-2 (50 % CHCl3/50 % MeOH) dans la colonne, centrifuger à 4000 x g pendant 50 s et jeter le passage continu.
  13. Répétez l’étape 5.12 trois fois.
  14. Ajouter 400 μL de tampon-1, centrifuger à 4000 x g pendant 50 s et jeter le tampon.
  15. Répétez l’étape 5.14 trois fois.
  16. Centrifugeuse à 4000 x g pendant 1,25 min pour assurer l’intégralité du passage du tampon-1.
  17. Transférez la colonne de piégeage en suspension dans un nouveau tube d’échantillon pour la digestion enzymatique.
  18. Ajoutez 125 μL de tampon de digestion (0,16 μg/μL de trypsine/Lys-C dans 50 mM de pH 8,5 TEAB) dans la colonne de piégeage en suspension et recouvrez-la pour éviter l’évaporation.
    REMARQUE : Le rapport trypsine/Lys-C doit être de 1:10 (poids/poids). Assurer un minimum de 10 μg de trypsine/Lys-C pour une digestion efficace.
  19. Incuber à 37 °C pendant 18 h sans agiter.
  20. Préparez les tampons d’élution suivants : tampon-1 (50 mM pH 8,5 TEAB dans l’eau désionisée), tampon-2 (0,2 % FA dans l’eau désionisée) et tampon-3 (50 % d’acétonitrile [ACN] dans l’eau désionisée).
  21. Ajouter 80 μL de tampon d’élution-1 dans la colonne de piégeage en suspension et centrifuger à 4000 x g pendant 1,25 min.
  22. Répétez l’étape 5.20 avec 80 μL de tampon d’élution-2 et tampon-3.
  23. Mettez en pool les peptides élués et transférez-les dans un nouveau tube propre.

6. Quantification des peptides

REMARQUE : La plupart des étapes du dosage colorimétrique quantitatif des peptides sont adaptées des instructions du fabricant avec des modifications mineures. Il est recommandé de préparer les réactifs conformément aux directives du fabricant.

  1. Préparer une série d’étalons en diluant en série la solution mère de l’étalon (1 mg/mL). Si nécessaire, diluer les échantillons en utilisant un facteur de dilution de 4 ou 5.
  2. Préparez l’eau désionisée comme blanc et un mélange de tampon d’élution 1, tampon 2 et tampon 3 dans des proportions égales comme contrôle de l’échantillon.
  3. Placez 20 μL d’étalons, de blancs, de contrôle d’échantillons et d’échantillons au centre de chaque puits de microplaques.
  4. Ajouter 180 μL du réactif de travail dans chaque puits et bien mélanger la plaque sur un agitateur de plaque pendant 1 min.
  5. Couvrez l’assiette et incubez-la à 37 °C pendant 20 min.
  6. Laisser refroidir la plaque à RT pendant 3 min.
  7. Mesurer l’absorbance des puits à 480 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
  8. Soustraire la valeur d’absorbance de 480 nm du blanc de celle de tous les échantillons et de l’échantillon témoin.
  9. De plus, soustrayez la valeur d’absorbance de 480 nm du témoin d’échantillon soustrait à blanc de celle de tous les échantillons.
  10. Tracez et utilisez la courbe standard pour calculer la concentration peptidique de chaque échantillon.

7. Analyse par chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse

  1. Après la quantification des peptides, lyophiliser 20 μg de peptides.
  2. Redissoudre les peptides dans 40 μL de tampon aqueux (3 % d’ACN dans de l’eau à 0,1 % d’acide formique [AF]) pendant 10 min dans un bain de sonication. La concentration peptidique résultante sera de 0,5 μg/μL.
  3. Centrifuger l’échantillon à 16 000 x g pendant 60 min et transférer les échantillons dans des flacons pour l’analyse MS.
  4. Injectez 2 μL de chaque échantillon à l’aide de l’échantillonneur automatique du système nano LC-MS/MS.
  5. Séparez les peptides sur une colonne en phase inverse (0,075 mm ID x colonne 150 mm, emballée avec un matériau C18 de 3 μm, en utilisant un gradient de 127 min de 5 % à 35 % d’acétonitrile à 100 nL/min. Ionisez les peptides via une source d’ions nanospray et transférez-les dans un spectromètre de masse basé sur orbitrap.
  6. Analyser les peptides à l’aide d’une méthode d’acquisition indépendante des données à portée étroite21.
  7. Appliquez le réglage des paramètres MS suivant : Plage MS m/z : 495-745, cible de résolution : 15000, cible AGC : 3 x 10E6, temps d’injection maximal : auto, fenêtre MS/MS : définie par l’utilisateur (fichier supplémentaire 1), cible de résolution : 45000, cible AGC 3 x 10E6, temps d’injection maximal : auto, énergie de collision HCD : 22 %, 26 %, 30 %.
    REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer un contrôle de qualité initial de l’instrument en analysant les échantillons standard avant l’analyse. Utilisez le logiciel d’acquisition de données MS pour configurer les paramètres (reportez-vous à la table des matériaux).

8. Analyse des données pour la recherche protéomique

REMARQUE : Pour la recherche protéomique des données brutes de MS, des outils open source ont été utilisés pour convertir le format des données LC-MS et effectuer une recherche de protéome (voir la table des matériaux). Les paramètres utilisés pour l’analyse des données sont détaillés dans le fichier supplémentaire 2. Pour obtenir des instructions d’utilisation de base des outils open source, reportez-vous au lien inclus dans la Table des matériaux.

  1. Convertir les fichiers bruts de spectre MS/MS (*.raw) obtenus à partir du LC-MS au format *.mzML à l’aide d’un logiciel open source.
  2. Utilisez les fichiers bruts convertis au format (*.mzML) comme entrée pour un moteur de recherche open source afin d’effectuer la recherche protéographique.
  3. Lancez la recherche protéomique en fonction des paramètres spécifiés dans le fichier supplémentaire 2.

9. Analyse statistique

REMARQUE : Pour l’analyse statistique visant à identifier les protéines exprimées de manière différentielle, un outil open source a été utilisé pour effectuer une analyse univariée (par exemple, le test t de Student ; reportez-vous à la table des matériaux). Il est recommandé de se référer aux instructions d’utilisation de base de l’outil open source via le lien fourni dans la table des matériaux.

  1. Importez la liste des protéines identifiées (*.txt) dans l’outil open-source.
  2. Catégoriser les échantillons en groupes. Pour cette étude, deux groupes ont été désignés : le SCN et l’IPMN.
  3. Effectuez la transformation log2 des valeurs d’abondance pour ajuster la distribution des données à une distribution approximative normale.
  4. Appliquez une étape de filtrage pour supprimer les protéines dont les valeurs sont manquantes. Dans cette étude, un minimum de deux valeurs valides dans chaque groupe était requis pour l’inclusion.
  5. Imputer les valeurs manquantes à l’aide d’une approche basée sur la distribution normale afin de générer une liste complète de protéines quantifiées pour une analyse univariée ultérieure.
  6. Effectuez un test t de Student pour identifier les protéines exprimées de manière différentielle entre les deux groupes. Dans cette étude, la correction du taux de fausses découvertes (FDR) de Benjamini-Hochberg a été appliquée.
  7. Extraire les protéines exprimées différentiellement en satisfaisant aux critères suivants : Benjamini-Hochberg FDR < 0,05 et |fold-change| ≥ 2.

10. Analyse bio-informatique

REMARQUE : Un outil bio-informatique commercial a été utilisé pour l’analyse de la surreprésentation (p. ex., analyse de la voie d’ingéniosité, voir la Table des matériaux). Avant d’utiliser cet outil, il est recommandé de se référer aux instructions du fabricant.

  1. Importez la liste des DEP (*.txt) dans l’outil commercial.
  2. Amorcer une analyse de base pour effectuer une analyse de surreprésentation.
  3. Exporter des voies canoniques significatives enrichies à partir des DEP à l’aide du test exact de Fisher (valeur p ajustée < 0,05). Identifiez les voies d’intérêt qui sont pertinentes pour la recherche.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La préparation d’échantillons protéomique basée sur un filtre de piégeage en suspension établie, combinée à une quantification sans marquage à l’aide d’une acquisition indépendante des données en une seule injection, a été appliquée à des tissus pancréatiques kystiques FFPE (Figure 1). Une isolation précise du retour sur investissement pendant le traitement des tissus FFPE a été obtenue sur différents tissus FFPE kystiques pancréatiques (Figure 2A), ce qui a per...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode protéomique rapide et efficace qui utilise des zones d’intérêt isolées à partir de coupes de tissus FFPE montées sur des lames de verre pour le diagnostic pathologique. Lorsqu’une intervention chirurgicale est avantageuse, les néoplasmes solides tels que les cancers et les kystes sont réséqués chirurgicalement et conservés pour une évaluation pathologique. Pour le stockage à long terme, les tissus sont fixés dans du formol et noyés dans de la paraffine (FF...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les figurines de cet article ont été créées avec BioRender (http://www.biorender.com). Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) (subvention n°. RS-2023-00253403 et RS-2024-00454407).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1 % d’AF dans l’ACN (grade LC-MS)Fisher ChemicalLS120-212
0,1 % d’AF dans l’eau (grade LC-MS)Fisher ChemicalLS118-4
0,5 M TCEPThermo Scientific77720
10 % SDSInvitrogen2679093
1M TEAB (pH 8,5)Sigma-Aldrich102545001
1M Tris-cl (pH 8,5)BIOSOLUTIONBTO21
A-14Ccentrifugeuse Satorious167709
Acétone (grade HPLC)Fisher ScientificA949-4
ACN (grade HPLC)J.T.Baker9017-88
CHCl3 (grade HPLC)Thermo Scientific022920.k2
CR papierADVANTEC70406001
DIA-NN ver 1.9  ;Open source  ;https://github.com/vdemichev/DiaNNMoteur de recherche de protéomique  ;
Lecteur de microplaques EPOCH2Agilent  ;
ÉthanolMERCKK50505283 836
FA (GRADE LC-MS)Fisher ChemicalA117-50
Analyse de la voie de l’ingéniosité (IPA)QIAGEN830018Outil bioinformatique
Lyophilisateur (SRF110R+piège à vapoteur)Thermo ScientificSRF-110-115
MeOH (grade HPLC)MERCKUN1230
Microplaque BCA protein Kit de dosage-Agent réducteur CompatibleThermo Scientific23252
MSConvert  ;Open source  ;http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlLogiciel de transformation de données MS
Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CMS
PepMAP RSLC C18 colonne de séparation  ;Thermo ScientificES903
PerseusOpen sourcehttps://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.htmlOutil statistique
PIERCE chloroacétamide No-Weigh FormatThermo ScientificA39270
PIERCE Peptide colorimétrique quantitatif ThermoScientific23275
Agitateur de plaques  ;Vert SSerikerVS-202D
Sonde sonicateurVibraCellTMVCX750
Protein LoBind Tube 1,5 mLEppendorf22431081
QSP 10 µ ; L Pointe de pipetteThermo ScientificTLR102RS-Q
QSP 300 µ ; L Pointe de pipetteThermo ScientificTLR106RS-Q
ScalpelBard-Parker372615
S-Trap : Rapid Universal MS sample PrepPROTIFICO2-mini-40
SureSTART Vial 0.2 mLThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Trypsine/Lys-C (grade LC-MS)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249LC
Water (grade HPLC)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Thermo Scientific30966MS logiciel d’acquisition de données
XyleneSigma-Aldrich102033629
2106208

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
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