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Article de méthode

Génération et caractérisation d’astrocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines dépourvus de ribonucléoprotéine messagère X fragile

1.3K vues

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DOI :

10.3791/68081

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6 juin 2025

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1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole qui facilite la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en astrocytes fonctionnels spécifiques du cerveau antérieur. Cela permet d’étudier le rôle des cellules gliales dans la pathogenèse des troubles neurodéveloppementaux, tels que le syndrome de l’X fragile, et de modéliser d’autres troubles cérébraux.

Résumé

Le syndrome de l’X fragile (FXS), l’une des principales causes héréditaires de troubles du spectre autistique et de déficience intellectuelle, a été étudié de manière approfondie à l’aide de modèles de rongeurs. Plus récemment, des systèmes modèles dérivés de cellules souches humaines ont également été utilisés pour obtenir des informations mécanistes sur la physiopathologie du FXS. Cependant, ces études se sont concentrées presque exclusivement sur les neurones. De plus, malgré les preuves croissantes d’un rôle clé de la glie dans la fonction neuronale dans la santé et la maladie, on sait peu de choses sur la façon dont les astrocytes humains sont affectés par le FXS.

Par conséquent, dans cette étude, nous avons réussi à développer un protocole qui capture les étapes spatio-temporelles clés du développement du cerveau et s’aligne également sur le processus de gliogenèse. Ensemble, ces éléments offrent un cadre utile pour l’étude des troubles neurodéveloppementaux. Tout d’abord, nous avons modelé les cellules souches pluripotentes induites humaines dans la lignée neuroectodermique avec un double suppresseur de mères contre l’inhibition décapentaplégique (SMAD) et de petites molécules. Par la suite, nous avons utilisé des facteurs de croissance et des cytokines spécifiques pour générer des cellules progénitrices astrocytaires (APC) de contrôle (CTRL) et de patients FXS. Le traitement des CPA avec le facteur neurotrophique ciliaire, une cytokine différenciante, a régulé et conduit les cellules progénitrices vers la maturation astrocytaire, produisant des astrocytes exprimant la protéine acide fibrillaire gliale spécifique du cerveau antérieur.

Nous avons constaté que ces astrocytes sont fonctionnels, comme en témoignent leurs réponses calciques à l’application d’ATP, et qu’ils présentent un métabolisme glycolytique et mitochondrial dérégulé dans le FXS. Pris ensemble, ces résultats fournissent une plate-forme expérimentale utile d’origine humaine pour l’étude des conséquences autonomes et non cellulaires des altérations de la fonction astrocytaire causées par des troubles neurodéveloppementaux.

Introduction

Le syndrome de l’X fragile (FXS), une forme héréditaire courante de déficience intellectuelle et de trouble du spectre autistique (TSA), est causé par l’absence de ribonucléoprotéine messagère de l’X fragile (FMRP) produite par le gène de la ribonucléoprotéine messagère de l’X fragile 1 (FMR1) (OMIM : #300624, https://www.omim.org/entry/300624). FMRP joue un rôle dans la régulation de la traduction de l’ARNm, la formation et le transport des granules d’ARNm, et la régulation de l’expression des gènes par les microARN1. Ainsi, la perte de FMRP affecte non seulement le développement du cerveau, mais aussi le fonctionnement du cerveau adulte. Les niveaux de transcription de l’ARNm de FMR1 et l’immunomarquage pour FMRP dans le cerveau ont montré une expression neuronale élevée, ainsi qu’une expression significative dans les cellules gliales ainsi que2. Cependant, une grande majorité des études antérieures sur des modèles animaux de FXS se sont principalement concentrées sur les neurones et les aberrations de leur fonction. Par conséquent, on sait peu de choses sur le rôle de la glie dans FXS3. Traditionnellement considérées comme des cellules de « soutien passif »4, il existe de plus en plus de preuves que les astrocytes sont essentiels à la médiation d’un large éventail de fonctions neuronales 5,6, notamment la promotion de la synaptogenèse7, le raffinement des circuits neuronaux en développement8 et le recyclage des neurotransmetteurs9. En parallèle, il existe de plus en plus de preuves du rôle des astrocytes dans la pathogenèse de la maladie et de nombreuses affections neurologiques ont été associées à la dysfonction astrocytaire10.

Alors qu’une grande partie des travaux antérieurs utilisant des modèles animaux de FXS se concentraient sur l’identification et la validation de diverses cibles moléculaires dans les neurones pour le traitement du FXS, ces résultats précliniques n’ont pas toujours conduit à des résultats cliniques positifs. De plus, les revers des récents essais cliniques soulignent également la nécessité de systèmes modèles basés sur l’homme. Les modèles de troubles neurologiques basés sur des cellules cérébrales dérivées de cellules souches humaines offrent une stratégie puissante pour combler ce fossé entre les connaissances mécanistes des études animales et le succès limité des résultats cliniques pour les patients. Cependant, seule une poignée de ces études se sont concentrées sur les astrocytes et cela aussi principalement sur les astrocytes d’origine spinale. Ceci, à son tour, est pertinent à la lumière des études montrant que la structure et la fonction des astrocytes varient entre les régions du cerveau11,12. Ainsi, une meilleure compréhension des changements induits par la maladie dans les astrocytes humains doit également prendre en compte ces différences spécifiques à la région du cerveau dans les astrocytes. Cependant, les modèles de troubles neurodéveloppementaux utilisant des astrocytes dérivés de cellules souches humaines spécifiques au cerveau antérieur restent relativement sous-explorés13. Par conséquent, pour commencer à combler ces lacunes, nous décrivons des protocoles pour générer des astrocytes spécifiques au cerveau antérieur à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dérivées de patients portant des mutations FXS ; De plus, nous montrons que les astrocytes sont fonctionnels et présentent un métabolisme altéré.

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Protocole

Toutes les expériences utilisant des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) (tableau 1) ont été réalisées après l’obtention des approbations réglementaires institutionnelles appropriées. La figure 1A représente le protocole de différenciation complet des hiPSC vers les astrocytes matures spécifiques du cerveau antérieur.

1. Maintenance et extension des hiPSC

  1. Un jour avant de plaquer les iPSC, enduire un plat à 6 puits de Matrigel dilué 1:60 (une matrice extracellulaire [ECM]) dans Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 (DMEM/F12) et conserver à 2-8 °C.
    REMARQUE : Évitez de stocker des boîtes enrobées de Matrigel pendant >5 jours à 2-8 °C, car cela peut entraîner une dégradation des protéines dans l’ECM au fil du temps. Pour éviter le dessèchement du plat, enrobez un minimum de 1 mL de Matrigel dilué 1:60 par puits d’un plat à 6 puits et étalez-le uniformément sur le plat. En cas d’utilisation le même jour, conservez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 1 h.
  2. Le jour de la culture des hiPSC, retirez le matériau d’enrobage et ajoutez 1 mL de milieu Essential 8 complet (milieu basal E8 avec supplément Essential 8) avec l’inhibiteur de ROCK à une concentration finale de 1x et conservez la boîte dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 avant d’ajouter les hiPSC.
  3. Remettre en suspension les hiPSC dans le milieu E8 complet avec l’inhibiteur de ROCK à une concentration finale de 1x pour une meilleure adhérence des colonies.
    REMARQUE : Ne préparez pas de grandes quantités de milieu de culture. Ne préparez que pendant 3-4 jours maximum et conservez-le à 2-8 °C.
  4. Le lendemain, réapprovisionnez le milieu E8 complet sans l’inhibiteur de ROCK jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80 % (environ 4 à 5 jours).
  5. Lorsqu’elles atteignent 80 % de confluence, détachez les colonies par voie enzymatique.
    1. Pour faire passer les CSPi, retirez les milieux épuisés de la boîte et ajoutez 1 mL par puits d’un mélange préchauffé (37 °C) de collagénase (2 mg/mL) et de dispase (1 mg/mL) dans un rapport de 1:1 et incubez à 37 °C pendant plus de 20 à 30 minutes pour permettre aux colonies de CSPi de se soulever.
      REMARQUE : Ne laissez pas la vaisselle à 37 °C pendant plus de 20-30 min ; Au-delà de cette période, les colonies se désintégreront et les cellules mourront.
  6. Lorsque les colonies commencent à se soulever, sortez les plats de l’incubateur et neutralisez l’activité enzymatique en ajoutant 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS).
  7. Grattez les colonies à l’aide de DPBS et prélevez la suspension dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL à gros calibre.
  8. Triturez doucement la suspension 2 à 3 fois pour briser les colonies à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, et laissez les colonies se stabiliser.
    REMARQUE : Ne faites pas des colonies des cellules uniques ; Cela peut empêcher les cellules d’adhérer à la boîte et provoquer une plus grande mort cellulaire. De plus, ne les laissez pas comme de grandes colonies ; Cela conduira à des colonies plus différenciées plus tard.
  9. Une fois que les colonies se sont stabilisées (environ après 2 min), aspirez le mélange d’enzymes DPBS en laissant environ 1 mL dans le tube.
  10. Ajoutez 2 ml de DPBS dans le tube, mélangez les colonies en tapotant et laissez-les se déposer. Répétez cette opération 2 fois pour éliminer toute l’enzyme résiduelle des colonies. Retirer autant de surnageant que possible après le 2elavage, remettre les colonies en suspension dans 1 mL de milieu E8 complet et les déposer dans un plat fraîchement préparé comme mentionné aux étapes 1.2-1.3.
  11. Alternativement, cryoconservez une proportion de colonies en utilisant 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) comme solution cryoprotectrice pour une expansion et une utilisation futures.
    1. Préparez fraîchement le milieu de cryoconservation en mélangeant 90 % de milieu E8 complet et 10 % de DMSO comme solution cryoprotectrice et placez-le à 2-8 °C jusqu’à utilisation.
  12. Pour cryoconserver, suivez les étapes 1.5 à 1.10.
  13. Lors de l’étape 1.10, après le 2èmelavage, laissez les colonies se déposer et retirez le surnageant. Aux colonies, ajouter 1 mL de milieu de cryoconservation froid fraîchement préparé et transférer dans des flacons cryogéniques.
    REMARQUE : Après avoir ajouté le milieu de cryoconservation aux colonies, transférez rapidement le contenu dans des cryoflacons. Retarder peut entraîner un taux de réactivation plus faible, car le DMSO est un cryoprotecteur qui peut endommager les cellules.
  14. Placez immédiatement les flacons cryogéniques dans une cryoboîte et conservez-les au congélateur à -80 °C pendant la nuit.
  15. Le lendemain, placez tous les cryoflacons dans un réservoir d’azote liquide (réservoir LN2 ) pour une utilisation future.
    REMARQUE : Les hiPSC doivent être systématiquement caryotypées à l’aide de la bande G (figure supplémentaire S1) pour toute anomalie, caractérisées par immunocytochimie pour la pluripotence (figure 1B) et testées pour les mycoplasmes.
    1. Pour caractériser les hiPSC à l’aide de l’immunocytochimie, plaquez les colonies sur des lamelles en verre de 13 mm recouvertes d’un Matrigel 1:60 et autoclavées. Une fois qu’elles sont confluentes à 40 %, laver les cellules avec du PBS-T (PBS-0,1 % Tween 20), fixer avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min, perméabiliser avec du Triton X-100 à 0,3 % dans du PBS pendant 10 min, et bloquer avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % dans du PBS pendant 1 h pour éviter la liaison non spécifique.
    2. Après le blocage, incubez les cultures avec des anticorps primaires pendant 1 h, puis lavez-les 3 fois avec du PBS-T pendant 5 minutes chacune, puis avec les anticorps secondaires correspondants (tableau des matériaux) dans l’obscurité pendant 1 h.
    3. Montez les lamelles sur des lames de verre avec un support de montage et acquérez des images par balayage laser confocal à 405 nm, 488 nm, 561 nm et 633 nm. Capturer des images à 512 x 512 pixels ; réglez la taille du pas Z à 0,5 μm avec 1 unité aérée de diamètre de sténopé.

2. Génération et caractérisation de cellules progénitrices astrocytaires (CPA)

  1. Soulever par voie enzymatique les hiPSC comme mentionné aux étapes 1.5 à 1.10 et les déposer sur une boîte de culture en suspension non adhérente (100 mm) avec un milieu chimiquement défini14 contenant 50 % de milieu Dulbecco modifié d’Iscove (IMDM), 50 % de mélange de nutriments F-12 de Ham (F12), 5 mg/mL de BSA, 1 % de concentré de lipides chimiquement définis (CD-Lipid), 450 μM de monothioglycérol, 7 μg/mL d’insuline, 15 μg/mL de transferrine, Pénicilline-Streptomycine à 1 % supplémenté en mitogènes de structuration du cerveau antérieur N-acétyl cystéine (1 mM), LDN 193189 (0,1 μM) et SB431542 (10 μM) pendant 7 jours.
    REMARQUE : Les inhibiteurs de petites molécules SB431542 et LDN-193189 (LDN) sont des inhibiteurs des protéines morphogénétiques osseuses et des voies de signalisation du facteur de croissance transformant bêta.
    À partir de ce moment, le support a été réapprovisionné une fois tous les 2 jours ou selon le protocole lundi/mercredi/vendredi.
  2. Placez la suspension cellulaire sur un agitateur orbital à 40 tr/min pendant 7 jours dans des conditions normoxiques pour favoriser le développement des corticosphères (Figure 1A).
  3. Le jour 8, transférez les corticosphères dans un milieu de prolifération cellulaire contenant du DMEM/F12 avancé avec 1 % d’antibiotique-antimycosique, 1 % de supplément de N2, 1 % de substitut de glutamine, 0,1 % de supplément de B27 et 2,5 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) pendant 7 jours.
  4. Induire la spécification gliale des sphères en les soumettant à un milieu d’enrichissement glial contenant du DMEM/F12 avancé avec 1 % d’antibiotique-antimycosique, 1 % de N2, 1 % de substitut de glutamine, 0,1 % de supplément de B27, 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF), bFGF-H (20 ng/mL bFGF-5 mg/mL d’héparine) pendant 2 semaines pour obtenir des gliosphères précoces (Figure 1A).
  5. Pour la maturation des gliosphères précoces, remplacez bFGF-H par 20 ng/mL de facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) et maintenez les sphères pendant 4 semaines.
  6. Après 4 semaines dans le milieu de maturation, maintenez les sphères dans le milieu d’enrichissement glial pendant des périodes prolongées. Pour éviter l’agrégation et la perte de viabilité, toutes les 2 semaines, hachez mécaniquement les gliosphères à l’aide d’une lame industrielle stérile et remplacez l’ensemble du milieu par de la DNase I pour éliminer les fragments d’ADN générés par le hachage.
  7. Dissociez les gliosphères en monocouches d’APC à l’aide d’un kit de dissociation Papain et plaquez-les sur une boîte adhérente traitée par culture cellulaire avec dilution 1:80 de revêtement Matrigel.
  8. Propager les APC dans un milieu d’enrichissement glial jusqu’à ce qu’ils confluent à 80 % et les faire passer enzymatiquement à l’aide du milieu de détachement de cellules enzymatiques (voir le tableau des matériaux).
  9. Vers le passage :
    1. Retirez le support usagé et collectez-le dans un tube conique. Aux cellules, ajoutez le milieu enzymatique de décollement cellulaire et attendez 1 à 2 min. Une fois que les cellules commencent à se détacher, ajoutez le milieu épuisé pour neutraliser l’activité enzymatique.
    2. Recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 800 x ɡ pendant 2 min.
    3. Aspirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans un milieu d’enrichissement glial et placez environ 1 x 106 cellules/puits dans une boîte à 6 puits recouverte de Matrigel 1:80.
  10. Pour la cryoconservation :
    1. Remettre les cellules en suspension dans un mélange froid de milieu de prolifération de la corticosphère à 90 % (sans bFGF) et de 10 % de cryoprotecteur. Transférez les cellules remises en suspension dans des cryoflacons.
    2. Déplacez immédiatement les cryoflacons dans une cryoboîte et conservez-les au congélateur à -80 °C pendant la nuit.
    3. Le lendemain, placez tous les cryoflacons dans un réservoir d’azote liquide (réservoir LN2 ) pour une utilisation future.
      REMARQUE : Les APC ont été cryoconservés avec 10 % de DMSO jusqu’au passage numéro 6.
  11. Caractériser les CPA dissociés par immunomarquage (comme mentionné aux étapes 1.15.1-1.15.3) avec des marqueurs de vimentine et de facteur nucléaire IA (NFIA) (Figure 1C,D) (Voir le tableau des matériaux pour les dilutions).
  12. Pour confirmer la spécificité régionale du cerveau antérieur des APC dérivées de hiPSC, testez les cellules pour un marqueur de cerveau antérieur tel que la boîte de tête de fourche humaine G1 (hFOXG1) (positif) et un marqueur de cerveau postérieur tel que l’Homeobox B4 humain (hHOXB4) (négatif) en utilisant la qPCR en temps réel (Figure 1E,F).
    REMARQUE : Les séquences d’amorces utilisées pour ces expériences ont été énumérées dans le tableau supplémentaire S1.

3. Génération et caractérisation d’une population homogène d’astrocytes spécifiques du cerveau antérieur

  1. Différenciation des astrocytes des APC
    1. Utilisez le milieu de différenciation astrocytaire (ADM) pendant 14 jours pour différencier les APC en astrocytes. Le milieu de différenciation astrocytaire contient du neurobasal, 1 % d’antibiotique-antimycosique, 1 % de substitut de glutamine, 1 % de supplément N2, 0,2 % de supplément B27, 1 % de milieu d’acides aminés non essentiels (NEAA) et 10 ng/mL de facteur neurotrophique ciliaire (CNTF).
    2. Confirmer l’identité astrocytaire en utilisant l’immunomarquage (comme mentionné aux étapes 1.15.1-1.15.3.) avec la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et les marqueurs d’expression S100β (Figure 2A,B).
  2. Synthèse protéique de novo dans les APC et les astrocytes
    1. Maintenir les APC et les astrocytes du cerveau antérieur dérivés de hiPSC sur des lamelles en verre stériles autoclavées de 13 mm et les immunocolorer comme mentionné aux étapes 1.15.1-1.15.3.
    2. Pour la synthèse de novo des protéines, utilisez la méthode de marquage fluorescent non canonical des acides aminés (FUNCAT), expliquée brièvement aux étapes 3.2.3 à 3.2.6 (Figure 3A).
    3. Pour éviter une carence en méthionine, retirer le milieu de croissance des cultures et le remplacer par un milieu exempt de méthionine et de cystéine mélangé à 1 mM de L-azidohomoalanine (AHA) pendant 30 min à 37 °C et 5 % de CO2.
    4. Laver les cultures avec du PBS-T, fixer avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min, perméabiliser avec du Triton X-100 à 0,3 % dans du PBS pendant 10 min, et bloquer avec du BSA à 3 % dans du PBS pendant 1 h pour éviter une liaison non spécifique.
    5. Incuber les cultures dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante avec un mélange réactionnel de chimie cellulaire Click et d’Alcyne Alexa Fluor 647, suivi d’anticorps primaires pendant 1 h et d’anticorps secondaires correspondants (tableau des matériaux) pendant 1 h (Figure 3B).
    6. Montez les lamelles sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage et utilisez-les pour une analyse d’image plus approfondie.
      1. Acquérez des images par balayage laser confocal à 405 nm, 488 nm, 561 nm et 633 nm.
      2. Capturer des images à 512 x 512 pixels ; réglez la taille du pas Z à 0,5 μm avec 1 unité aérée de diamètre de sténopé.
      3. Maintenez les paramètres de microscopie et d’imagerie à un réglage constant sur tous les types de cellules. Capturez des images pour chaque répétition biologique au cours de la même session.
      4. Effectuez des mesures d’intensité à l’aide de n’importe quel logiciel d’analyse d’images standard (par exemple, Fiji ou Imaris). Dans Imaris, utilisez le module SURFACES pour obtenir des mesures volumétriques des corps cellulaires positifs pour le signal FUNCAT (fluorescent non-canonical amino acid markging) avec des Vimentines (APCs) et des GFAP (astrocytes) limitant la plage de voxels (250-350) pour éliminer les débris.
        REMARQUE : Maintenez les paramètres sur toutes les réplicats biologiques pour les deux types de cellules.
  3. Ondes calciques oscillatoires induites par l’adénosine 5′-triphosphate (ATP)
    1. Déposer les astrocytes sur une boîte à fond de verre (35 mm) à 5 × 103 cellules/boîte pour mesurer la réponse cellulaire à l’ATP.
    2. Laissez les cellules adhérer au fond du verre pendant 24 h, lavez-les 3 fois avec HBSS (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucose, 1 mM MgCl2, pH = 7,3) sans calcium, et incubez dans un milieu de culture avec un colorant métrique de rapport 5 μM Fura-2AM et 0,02 % de Pluronics F127 pendant 1 h à température ambiante.
      REMARQUE : Fura-2AM est un produit chimique sensible à la lumière et à la température ; Conserver à -20 °C.
    3. Après l’incubation, laver 2x avec un milieu de culture et remplacer par 2 mM de Ca2+ contenant HBSS et imager les cellules à une vitesse de 2 FPS à l’aide d’un objectif à huile 60x (1,35 NA) dans un microscope inversé à compensation de dérive de focale.
    4. Enregistrer les réponses calciques induites par l’ATP par l’application en bain d’ATP à la concentration finale de 5 mM à la 25e s (Figure 4A).
    5. Dessinez des régions d’intérêt autour de chaque cellule à l’aide de Fiji/ImageJ et calculez le rapport F340/F380 à tous les points temporels (Figure 4B).
  4. Essais métaboliques cellulaires
    REMARQUE : Le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) des cellules vivantes ont été mesurés conformément au protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    1. Un jour avant le dosage, laisser les astrocytes adhérer à la microplaque (densité d’ensemencement de 1,5 × 104 ) dans le milieu CNTF et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2.
    2. Pour le test de stress de glycolyse :
      1. Remplacer le milieu de culture cellulaire par un milieu de base complété par 2 mM de glutamine (pH ajusté à 7,4) et incuber dans une chambre sans CO2 à 37 °C pendant 1 h.
        REMARQUE : Le pH doit être ajusté dans un bain d’eau à 37 °C.
      2. Insérez la plaque de la cartouche dans l’instrument pour calibrer le capteur. Après l’étalonnage, remplacez la plaque de la cartouche par la plaque de culture cellulaire à la concentration finale des composants suivants du kit : 10 mM de glucose, 1 μM d’oligomycine et 50 mM de 2-désoxy-glucose (2-DG) (Figure 5A).
      3. À la fin du test, lyser les cellules et estimer la teneur totale en protéines.
    3. Pour le dosage du stress mitochondrique :
      1. Remplacer le milieu CNTF par un milieu de base complété par 2 mM de glutamine, 1 mM de pyruvate, 10 mM de glucose (pH ajusté à 7,4) dans un bain-marie à 37 °C.
      2. Incuber la plaque dans une chambre sans CO2 à 37 °C pendant 1 h. Pendant ce temps, insérez la plaque de la cartouche dans l’instrument pour calibrer le capteur.
      3. Après l’étalonnage, remplacez la plaque de cartouche par la plaque de culture cellulaire avec une concentration finale des composants suivants du kit : 1,5 μM d’oligomycine, 1 μM de cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) et 0,5 μM de roténone/antimycine A (Figure 5C).
      4. À la fin du test, lyser les cellules et estimer la teneur totale en protéines.

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Résultats

Des colonies de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) ont été maintenues à l’aide d’un milieu défini disponible dans le commerce et immunomarqués pour les marqueurs de pluripotence, Oct4 et Nanog (Figure 1B). Les APC FXS et CTRL ont montré des proportions comparables et fortement enrichies de cellules immunopositives pour la vimentine et la NFIA (Figure 1C, D). Nous avons constaté que les APC d...

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Discussion

Ici, nous décrivons une méthode pour générer des astrocytes humains dérivés d’iPSC qui servent de plate-forme de test pour caractériser les changements fonctionnels induits par FXS. Ces astrocytes sont fonctionnellement viables en culture et présentent diverses propriétés, comme en témoigne une série de mesures effectuées dans la présente étude. Une étape critique de ce protocole est la conversion initiale des CSPi en corticosphères à l’aide de la méthode de lifting enzymatique. À ce sta...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le professeur Sumantra Chattarji pour les fonds intra-muros. Nous remercions le professeur Gaiti Hasan pour l’accès à l’installation d’imagerie calcique, le Centre central d’imagerie et d’écoulement du Centre national des sciences biologiques, Padmanabh Singh et Prangya Hota pour la relecture et les suggestions, et l’équipe de Labmate Asia pour leur aide dans la réalisation des tests Seahorse XF.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-ThioglycérolSigma-AldrichM6145
Accutase  ; solutionSigma-AldrichA6964Milieu enzymatique de détachement cellulaire  ;
Adénosine 5&prime ;-triphosphatesel de magnésium Sigma-AldrichA9187
Advanced DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634010
Antibiotique-Antimycosique (100x)ThermoFisher Scientific15240062
B-27 Supplement (50x), sans sérumThermoFisher Scientific17504044
Albuminesérique bovineSigma-AldrichA9418
Concentré de lipides chimiquement définisThermoFisher Scientific11905031
Collagénase, type IV, poudreThermoFisher Scientific17104019
Désoxyribonucléase IWorthington Biochemical CorporationLK003170
DiméthylsulfoxydeSigma-AldrichD2650
Dispase II, poudreThermoFisher Scientific17105041
DPBS, sans calcium, sans magnésiumThermoFisher Scientific14190144
Essential 8 MediumThermoFisher ScientificA1517001
FXS1, FXS2  ;Institut Coriell de recherche médicale  ;GM07072, GM05848FXS cellules de patient
GlutaMAX SupplémentThermoFisher Scientific35050061substitut de glutamine
Mélange de nutriments F-12 de jambonThermoFisher Scientific11765054
Cellules de contrôle saines  ;Centre médical Cèdres-SinaïND30625cellules témoins saines  ;
Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcineSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
Insuline humaineRoche11376497001
LDN 193189  ;Stratech ScientificS2618-SEL
Leucémie Facteur Inhibiteur HumainSigma-AldrichL5283
Matrigel  ; Facteur de croissance réduit (DFG) Matrice de membrane basaleCorning354230
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)ThermoFisher Scientific11140050
Souris FGF-basic (FGF-2/bFGF) Protéine recombinantePeprotech450-33
Conteneur de congélation Mr. FrostyThermoFisher Scientific5100-0001cryobox
N-2 Supplément (100x)ThermoFisher Scientific17502048
N-acétyl-L-cystéineSigma-AldrichA9165
Milieu neurobasalThermoFisher Scientific21103049
Nunc Biobanking et culture cellulaire Tubes cryogéniquesThermoFisher Scientific377267
Nunc Cell-Culture Treated 6 well DishThermoFisher Scientific140675
Système de dissociation de la papaïneWorthington Biochemical CorporationLK003150
Pénicilline-streptomycineThermoFisher Scientific15140122
Protéine CNTF humaine recombinante, CF  ;R& D Systems257-NT-010
Protéine EGF humaine recombinante, CFR& D Systems236-EG-01M
Supplément RevitaCell (100x)ThermoFisher ScientificA2644501
SB431542Tocris1614
Seahorse XFe24 Analyzer  ;Agilent Technologies
Seahorse XF Cell Mito Test Test KitAgilent Technologies103015-100
Seahorse XF Glycolysis Test KitAgilent Technologies103020-100
Boîtes de culture tissulaire-100 cmBiostar LifetechTCD000100
TransferrinRoche10652202001
VWR Razor LamesVWR International55411-050
Antibodies  ;
Anticorps primaireCompanyNuméro de catalogueDilution
Oct4 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279Dilution : 1:250
Anticorps secondaire : IgG anti-souris de chèvre, Alexa Fluor 568
Nanog R & D SystemsAF1997Dilution : 1:100
Anticorps secondaire : IgG anti-chèvre âne, Alexa Fluor 488
VimentineAbcam Ab5733Dilution : 1:500
Anticorps secondaire : IgY anti-poulet de chèvre, Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb41851Dilution : 1:500
Anticorps secondaire : IgG anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205Dilution : 1:500
Anticorps secondaire : NA
GFAPDAKOZ0334Dilution : 1:500
Anticorps secondaire : IgG anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 568
S100&beta ;DAKOIR504Dilution : 1:500
Anticorps secondaire : IgG anti-Lapin de chèvre, Alexa Fluor 488
Anticorps anti-noyaux, clone 235-1Merck MilliporeMAB1281Dilution : 1:1000
Anticorps secondaire : IgG1 anti-souris de chèvre, Alexa Fluor 555
Secondaires forts  ; Dilution
IgG anti-souris Goat, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific  ;A110041:1000
Âne anti-chèvre IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific  ;A110551:1000
Chèvre anti-Poulet IgY, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific  ;A110391:1000
Chèvre anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific  ;A110111:1000
Chèvre anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific  ;A110341:1000
Chèvre anti-souris IgG1, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific  ;A211271:1000

Références

  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective. Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).
  2. Wang, H., et al. Developmentally-programmed FMRP expression in oligodendrocytes: A potential role of FMRP in regulating translation in oligodendroglia progenitors. Hum Mol Genet. 13 (1), 79-89 (2004).
  3. Pacey, L. K. K., Doering, L. C. Developmental expression of FMRP in the astrocyte lineage: Implications for fragile X syndrome. Glia. 55 (15), 1601-1609 (2007).
  4. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  5. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  6. Khakh, B. S., McCarthy, K. D. Astrocyte calcium signaling: From observations to functions and the challenges therein. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (4), a020404(2015).
  7. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  9. Rothstein, J. D., et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  10. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nat Rev Neurol. 14 (6), 351-362 (2018).
  11. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: An underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20 (5), 588-594 (2010).
  12. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14 (5), 311-321 (2013).
  13. Bradley, R. A., et al. Regionally specified human pluripotent stem cell-derived astrocytes exhibit different molecular signatures and functional properties. Development. 146 (13), dev170910(2019).
  14. Das Sharma, S., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42 (4), 112344(2023).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Hu, X., et al. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Sig Transduct Target Ther. 6, 402(2021).
  17. Baser, A., et al. Onset of differentiation is post-transcriptionally controlled in adult neural stem cells. Nature. 566 (7742), 100-104 (2019).
  18. Pal, R., Bhattacharya, A. Modelling protein synthesis as a biomarker in fragile x syndrome patient-derived cells. Brain Sci. 9 (3), 1-12 (2019).
  19. Gross, C., Bassell, G. J. Excess protein synthesis in FXS patient lymphoblastoid cells can be rescued with a p110β-selective inhibitor. J Mol Med. 18 (3), 336-345 (2012).
  20. Kumari, D., et al. Identification of fragile X syndrome specific molecular markers in human fibroblasts: A useful model to test the efficacy of therapeutic drugs. Hum Mutat. 35 (12), 1485-1494 (2014).
  21. Jacquemont, S., et al. Protein synthesis levels are increased in a subset of individuals with fragile X syndrome. Hum Mol Genet. 27 (12), 2039-2051 (2018).
  22. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24 (39), 8606-8620 (2004).
  23. Schmunk, G., Boubion, B. J., Smith, I. F., Parker, I., Gargus, J. J. Shared functional defect in IP3R-mediated calcium signaling in diverse monogenic autism syndromes. Transl Psychiatry. 5 (9), e643-e710 (2015).
  24. Peteri, U. K., et al. Generation of the human pluripotent stem-cell-derived astrocyte model with forebrain identity. Brain Sci. 11 (2), 209(2021).
  25. Alvarez-Mora, M. I., et al. Impaired mitochondrial function and dynamics in the pathogenesis of FXTAS. Mol Neurobiol. 54 (9), 6896-6902 (2017).
  26. Giulivi, C., et al. Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA. 304 (21), 2389-2396 (2010).
  27. Anitha, A., et al. Brain region-specific altered expression and association of mitochondria-related genes in autism. Mol Autism. 3 (1), 12(2012).
  28. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Front Neurosci. 11, 737(2018).
  29. Yao, J., et al. Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (34), 14670-14675 (2009).
  30. Sonntag, K. C., et al. Late-onset Alzheimer's disease is associated with inherent changes in bioenergetics profiles. Sci Rep. 7 (1), 14038(2017).

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