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Article de méthode

Effets de la shikonine sur la voie de signalisation HIF-1α/VEGF chez les souris atteintes de lésions pulmonaires aiguës causées par une septicémie

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DOI :

10.3791/68085

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6 juin 2025

 , 
1The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

Dans cet article

Résumé

Le protocole vise à évaluer l’efficacité de la shikonine dans le soulagement des lésions pulmonaires aiguës causées par la septicémie chez la souris. En ciblant la voie HIF-1α/VEGF, l’étude examine comment différentes doses de shikonin influencent les taux de survie, la pathologie pulmonaire et l’expression des marqueurs inflammatoires, mettant en évidence ses avantages thérapeutiques potentiels.

Résumé

La septicémie provoque souvent des lésions pulmonaires aiguës (ALI), une complication à forte mortalité. La voie HIF-1α/VEGF joue un rôle clé dans le sepsis, et la shikonine, un composé naturel aux propriétés anti-inflammatoires, peut atténuer les lésions pulmonaires en ciblant cette voie. Les souris Balb/c ont été divisées au hasard en quatre groupes : groupe fictif, groupe modèle, groupe de traitement à faible dose et groupe de traitement à forte dose. Le groupe placebo a subi une laparotomie sans ligature cæcale ni ponction (CLP), tandis que le groupe modèle a subi une CLP pour induire une lésion pulmonaire aiguë liée à la septicémie. Après modélisation, les groupes de traitement à faible dose et à forte dose ont reçu de la shikonine par gavage à des doses de 12,5 mg/kg et 50 mg/kg, respectivement, une fois par jour pendant 14 jours. Le taux de survie à 7 jours des souris a été surveillé. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) a été utilisée pour évaluer la pathologie du tissu pulmonaire, le rapport poids humide/sec (P/D) pulmonaire a été mesuré et un transfert Western a été effectué pour détecter l’expression de HIF-1α, VEGF, TNF-α et IL-6 dans le tissu pulmonaire. Shikonin a significativement amélioré le taux de survie des souris septiques, l’effet le plus important ayant été observé dans le groupe ayant reçu la dose élevée (p < 0,05). Par rapport au groupe modèle, le rapport P/D pulmonaire et les lésions tissulaires dans les groupes traités par la shikonine ont été significativement réduits de manière dose-dépendante. De plus, la shikonine a significativement régulé à la baisse l’expression de HIF-1α, VEGF, TNF-α et IL-6, le groupe ayant reçu la dose élevée montrant la réduction la plus prononcée (p < 0,05). Shikonin atténue les lésions pulmonaires aiguës chez les souris septiques, potentiellement en inhibant l’expression de HIF-1α et en réduisant la production de facteurs inflammatoires associés.

Introduction

La septicémie est une réponse inflammatoire systémique sévère déclenchée par une infection. 1 Elle entraîne souvent un dysfonctionnement de plusieurs organes et peut mettre la vie en danger à mesure que la maladie progresse. 2 Malgré l’utilisation de thérapies telles que la ventilation mécanique et les soins de soutien, les taux de mortalité liés à l’ALI associée à la septicémie restent élevés, atteignant 30 % à 40 %3. Ces traitements s’attaquent principalement aux symptômes plutôt qu’aux causes sous-jacentes, ce qui limite leur efficacité globale. Par conséquent, l’identification de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent les causes des lésions pulmonaires pourrait améliorer considérablement les résultats des patients atteints de septicémie.

Des études récentes ont identifié le facteur 1α induit par l’hypoxie (HIF-1α) comme un régulateur essentiel dans la progression de l’ALI 4,5 induit par le sepsis. HIF-1α s’accumule dans les tissus pulmonaires pendant la septicémie, entraînant l’expression des gènes en aval qui exacerbent l’inflammation et les lésions tissulaires6. Ce processus contribue de manière significative à l’aggravation des lésions pulmonaires. Par conséquent, le ciblage de la voie de signalisation HIF-1α offre une approche prometteuse pour atténuer les réponses inflammatoires et hypoxiques observées dans l’ALA induite par le sepsis.

Dans la recherche de traitements plus efficaces, la médecine traditionnelle chinoise (MTC) a fourni des informations précieuses 7,8. Shikonin est un composé d’anthraquinone extrait de Lithospermum erythrorhizon7. Il montre des effets anti-inflammatoiresnotables 9, antibactériens10 et antitumoraux11. Shikonin peut soulager les lésions pulmonaires induites par le lipopolysaccharide (LPS), suggérant son rôle thérapeutique potentiel dans les affections pulmonaires12. Dans le même temps, certaines études ont également proposé que la shikonine puisse atténuer les dommages oxydatifs causés par la septicémie en régulant le système macrophage mononucléaire, équilibrant les réponses pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Cependant, les mécanismes à l’origine des effets protecteurs de la shikonine dans l’ALI induite par la septicémie ne sont pas entièrement compris. Il s’agit d’une lacune critique dans la recherche actuelle.

Dans cette étude, nous visons à explorer les effets protecteurs de la shikonine dans un modèle murin d’ALI induit par la septicémie en utilisant la ligature et la ponction cæcales (CLP). La technologie CLP joue un rôle important dans la recherche sur le sepsis car elle peut simuler des réponses inflammatoires systémiques complexes et un dysfonctionnement multiviscéral, ce qui la rend adaptée à l’évaluation de l’efficacité de nouvelles stratégies de traitement. La technologie CLP est relativement plus pertinente cliniquement que les méthodes d’injection traditionnelles de LPS : elle simule la réponse inflammatoire systémique causée par la translocation du microbiote intestinal, qui est plus proche du processus pathologique de la septicémie clinique. Il peut être gradué et contrôlé : en ajustant la longueur de la ligature et la taille de la perforation, la gravité de la maladie peut être contrôlée, et il convient à l’ensemble de l’étude de la septicémie. De plus, il peut simuler des changements dynamiques similaires dans le dysfonctionnement multi-organes et la réponse aux cytokines. En étudiant le rôle de la shikonine dans la modulation de la voie de signalisation HIF-1α/VEGF, nous espérons fournir des informations sur de nouvelles stratégies thérapeutiques qui s’attaquent aux mécanismes sous-jacents des lésions pulmonaires liées à la septicémie, améliorant potentiellement les résultats cliniques.

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Protocole

Le protocole a obtenu l’approbation du Centre des animaux expérimentaux de l’Université médicale de Wenzhou. Des souris mâles C57Bl/6 (âgées de 5 à 6 mois ; 20 à 25 g) ont été utilisées dans la présente étude. Les détails des principaux réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation du modèle murin de sepsis

  1. Souris domestiques sous une température constante de 25 °C, 50 % d’humidité et un cycle lumière/obscurité de 12 heures.
  2. Après une période d’acclimatation de 7 jours, divisez au hasard les souris en quatre groupes : groupe fictif, groupe modèle, groupe de traitement à faible dose et groupe de traitement à forte dose, avec 20 souris dans chaque groupe.
  3. D’après les références d’une étude antérieure13, traiter le groupe à faible dose avec une concentration de 12,5 mg/kg de purpurine pendant 14 jours, et le groupe à forte dose avec une concentration de 50 mg/kg pendant 14 jours. Pour le groupe de chirurgie simulée, effectuez une laparotomie, une traction cæcale, une réduction et une fermeture sans ligature ni ponction, et traitez avec la même dose de solution saline physiologique pendant 14 jours. Les étapes expérimentales pour le groupe septicémie sont les suivantes.
  4. Après une nuit de jeûne (l’eau était autorisée), anesthésiez les souris avec du pentobarbital sodique (40-80 mg / kg) dans des conditions stériles tout au long du processus. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
  5. Vérifiez que l’anesthésie appropriée est un ralentissement de la fréquence respiratoire, une diminution de la tension musculaire et l’absence de réponse de stress évidente lors de la compression légère des membres inférieurs avec une pince hémostatique.
  6. Effectuer une désinfection avec de l’éthanol à 75 %, 3x. Faites une incision longitudinale d’environ 1 cm au milieu gauche de l’abdomen de la souris et ouvrez la peau, le fascia et les muscles en couches pour exposer la cavité abdominale.
  7. À l’aide d’une pince ophtalmique à bout émoussé dans les deux mains, explorez doucement la cavité abdominale, localisez et libérez le cæcum de la souris et ligaturez-le à une distance d’environ 1 cm de l’extrémité du caecum
  8. Utilisez une aiguille 21G pour percer et ligaturer l’extrémité du caecum , pressez doucement une petite quantité de contenu intestinal du site de ponction à l’aide d’une pince ophtalmique à pointe émoussée, puis récupérez-la dans le caecum
  9. Effectuer une réanimation liquidienne sous-cutanée avec 1 mL de solution de chlorure de sodium à 0,9 %. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Nous notons que l’animal qui a subi une intervention chirurgicale n’est pas renvoyé en compagnie d’autres animaux tant qu’il n’est pas complètement rétabli.
  10. Après 7 jours de modélisation CLP, administrer une anesthésie excessive pour l’euthanasie.
    REMARQUE : En raison des effets irritants possibles de la purpurine sur la peau, les voies respiratoires et le tube digestif, ainsi que de sa toxicité élevée pour les organismes aquatiques, la pollution de l’environnement, utilisez une protection individuelle pendant l’expérience.

2. Évaluation des modèles animaux

  1. Observation de la survie des souris
    1. Manipulez les animaux comme décrit ci-dessus. Enregistrer le taux de mortalité dans la semaine suivant la modélisation pour l’analyse statistique. Certaines souris meurent sans septicémie avant l’euthanasie, tandis que les souris modèles CLP ont un certain taux de mortalité (tableau 1).
    2. Mesure du rapport poids/poids humide / sec des poumons
      1. Après 24 h de modélisation, anesthésiez à nouveau les souris selon les étapes 1.4-1.5.
      2. Faites une incision longitudinale d’environ 1 cm sur le côté gauche de la ligne médiane de la clavicule de la souris et retirez la peau, le fascia et les couches musculaires pour exposer la cavité thoracique à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces.
      3. Retirez le poumon gauche et drainez le liquide de surface. Mesurez le poids humide puis séchez-le dans un four à 80 °C pendant 72 h jusqu’à un poids constant pour obtenir le poids sec.
      4. Calculer la teneur en eau des poumons comme suit :
        Teneur en eau pulmonaire = (Poids humide - Poids sec) / Poids humide x 100 %.
    3. Comparaison histopathologique des tissus pulmonaires
      1. À des moments précis, prélevez le poumon gauche comme décrit ci-dessus à l’étape 2.2. Fixez le poumon dans du formaldéhyde neutre à 10 %, incrustez-le dans de la paraffine et sectionnez-le à 5 μm d’épaisseur.
      2. Déparaffinez le poumon dans du xylène, 2x, pendant 5 à 10 min à chaque fois. Effectuez une réhydratation de l’éthanol en série avec 100 %, 95 %, 85 % et 75 %, pendant 3 minutes par gradient. Tremper dans de l’eau distillée pendant 2 min.
      3. Colorer avec environ 100 ml de solution d’hématoxyline pendant 10 min, puis rincer à l’eau distillée pour éliminer toute couleur flottante.
      4. Ajouter environ 70 mL de solution de différenciation et laisser tremper pendant 30 s. Ensuite, trempez dans l’eau du robinet 2 fois, à chaque fois pendant 3 à 5 minutes.
      5. Ajouter environ 100 mL de solution de colorant d’éosine goutte à goutte pendant 2 min. Versez l’excès de solution de colorant et déshydratez-vous rapidement comme décrit ci-dessous.
      6. Effectuez la déshydratation, la transparence et le scellement comme décrit ci-dessous.
        1. Faire tremper les échantillons dans de l’éthanol à gradient : 75 %, 85 %, 95 % et 100 % d’éthanol (I) pendant 2 à 3 s chacun. Faites tremper dans de l’éthanol à 100 % (II) pendant 1 minute et trempez dans du xylène 2 fois pendant 1 minute à chaque fois. À l’aide d’une paille ou d’un compte-gouttes, versez de la gomme neutre sur la surface des tranches de tissu et étalez-la uniformément autant que possible pour éviter la formation de bulles. Scellez et observez au microscope à 400x.
      7. Sélectionnez 10 champs aléatoires par section de poumon. Demandez à un pathologiste d’évaluer les changements pathologiques tels que l’œdème alvéolaire, l’hémorragie et l’infiltration de neutrophiles de 0 (normal) à 4 (dommages graves). Utilisez le score total pour l’évaluation.
    4. Transfert Western
      1. Extraire les protéines nucléaires du tissu pulmonaire selon les instructions de la trousse d’extraction de protéines nucléaires et mesurer la concentration des protéines à l’aide de la méthode BCA selon les instructions du fabricant.
      2. Préparez des échantillons de charge protéique avec 50 μg de protéine chargée par échantillon. Préparez le gel de séparation SDS-PAGE (10 %) et le gel d’empilage (3 %). Effectuer une électrophorèse à 80 V pendant 45 min, puis transférer la protéine sur une membrane PVDF à 110 V pendant 60 min après que les échantillons soient entrés dans le gel de séparation.
      3. Transférez les protéines sur une membrane et bloquez pendant 60 min. Incuber avec des anticorps primaires (voir le tableau des matières, 1:1000) pendant une nuit à 4 °C, suivi d’une incubation d’anticorps secondaires (voir le tableau des matériaux, 1:1000) à 37 °C pendant 2 h.
      4. Lavez la membrane avec du TBST et utilisez ECL pour la visualisation. Dans une pièce sombre, ajoutez les réactifs préparés sur une membrane PVDF et effectuez une imagerie par agitation et fluorescence. Les réactifs ECL interagissent avec les biomolécules sur la membrane, produisant de fortes réactions de chimiluminescence, qui sont enregistrées par des instruments d’imagerie par fluorescence.
      5. Analysez la valeur en niveaux de gris des bandes de protéines à l’aide d’un système d’analyse d’images, méthode de quantification de bande (pour plus d’informations sur le système utilisé pour l’analyse de la densitométrie de bande, voir l’image NIH).
    5. Analyse statistique
      1. Utilisez SPSS 26.0 pour l’analyse statistique. Utilisez l’ANOVA à un facteur pour comparer les moyennes de plusieurs groupes, et les tests LSD-t pour les comparaisons par paires. Considérons qu’une valeur p < 0,05 est statistiquement significative.

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Résultats

Pour évaluer le potentiel thérapeutique de la shikonine, nous avons d’abord évalué son effet sur la survie chez des souris septiques sur une période de 7 jours. Le traitement par la shikonine a amélioré les taux de survie de manière dose-dépendante (Figure 1).

Étant donné l’occurrence généralisée de lésions pulmonaires dans le sepsis, nous avons également évalué l’œdème pulmonaire chez la souris. L’œdème pulmonaire a été évalué en mesurant le rapp...

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Discussion

En tant que modèle de référence pour la recherche sur le sepsis, le modèle CLP est une étape clé de cette expérience, car il imite mieux la complexité du sepsis humain que de nombreux autres modèles. L’ALI associée à la septicémie reste un défi clinique critique en raison de ses taux de mortalité élevés et de l’efficacité limitée des traitements actuels14,15. Notre étude démontre, pour la première fois, que la shikonine améliore ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

L’étude a été soutenue par le Wenzhou Science and Technology Project (Y2020976).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
H& E stain kit kit colorationSolaibao TechnologyG1120HE
Centrifugeuse basse températureSigma3K15
Lecteur de microplaquesBio-RadModèle 680
monoclonal de lapin VEGF-receptor1anticorps Abcamab238632
polyclonal de lapin HIF-1&alpha ; anticorpsAbcamab51608
SDS-PAGE système d’électrophorèseBio-RadMINI Protean2
ShikoninMedChemExpressHY-N0822

Références

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