Effets neuroprotecteurs d’un analogue de l’octadécaneuropeptide administré par voie intranasale dans un modèle murin de la maladie de Parkinson induite par le MPTP

Résumé

L’administration intranasale permet l’administration directe de molécules bioactives au cerveau, offrant une alternative non invasive à la méthode intracérébroventriculaire. Cette étude démontre que l’administration intranasale de cyclo_(1-8)OP, un analogue de l’ODN, exerce de forts effets neuroprotecteurs contre les dommages oxydatifs induits par le MPTP et l’apoptose dans le striatum dans un modèle murin de la maladie de Parkinson, mettant en évidence le potentiel thérapeutique.

Résumé

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative pour laquelle les thérapies existantes sont principalement palliatives et manquent d’efficacité curative. L’octadécaneuropeptide (ODN) est un peptide produit exclusivement par les astrocytes qui protège les neurones contre les dommages cellulaires oxydatifs et l’apoptose dans des modèles in vitro et in vivo de la MP. Cependant, l’ODN ne peut pas traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) et nécessite une injection intra-ventriculaire pour atteindre le cerveau, ce qui présente un défi important pour l’application thérapeutique. Cette étude examine l’efficacité neuroprotectrice de la cyclo_(1-8)OP, un analogue de l’ODN, délivré par voie intranasale (IN) pour contourner la BHE dans un modèle in vivo de la MP. Des souris mâles C57BL/6J ont été utilisées pour les expériences et divisées en quatre groupes : simulacre, MPTP- (20 mg/kg de poids corporel, intrapéritonéale), cyclo_(1-8)OP- (10 ng/10 μL, IN), et les animaux traités par MPTP + cyclo_(1-8)OP. Le jour 0 (J0), les animaux ont reçu trois injections intrapéritonéales de 100 μL de solution MPTP à 2 heures d’intervalle (souris traitées au MPTP et MPTP + cyclo_(1-8)OP) ou d’une solution saline (souris simulées et souris traitées au cyclo_(1-8)OP). Une heure après l’injection finale, 10 μL d’instillation d’IN de cyclo_(1-8)OP (souris traitées au cyclo_(1-8)OP et MPTP + cyclo_(1-8)OP) ou d’une solution saline d’IN (souris fictives et souris traitées au MPTP) ont été administrées. Sur le D7, un test de cylindre a été effectué pour évaluer le fonctionnement moteur. Par la suite, des animaux ont été sacrifiés, et le striatum a été retiré et analysé par RT-qPCR pour évaluer l’expression du gène de la caspase-3. Des échantillons de tissus ont également été utilisés pour mesurer les activités enzymatiques antioxydantes, les espèces réactives de l’oxygène (ROS), le malondialdéhyde (MDA) et l’abondance des protéines carbonylées. Une dose unique de 10 ng de cyclo_(1-8)OP, administrée 1 h après la dose finale de MPTP, a empêché la neurotoxicité dans le striatum 7 jours après le traitement. La neuroprotection médiée par Cyclo_(1-8)OP a été associée à une forte inhibition de l’expression de la caspase-3 induite par le MPTP dans le striatum. De plus, le cyclo_(1-8)OP a restauré les activités des enzymes antioxydantes, empêchant l’accumulation de ROS, de produits de peroxydation lipidique et de carbonylation des protéines dans le striatum.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive de neurones dopaminergiques dans la substance noire, qui innerve le striatum. Cette perte entraîne des symptômes neurologiques importants, notamment des déficits moteurs sévères tels que la rigidité musculaire, l’akinésie et la bradykinésie¹. La prévalence des maladies neurodégénératives comme la MP continue d’augmenter, principalement en raison du vieillissement de la population, ce qui pose un défi de santé publique^{important 2}. Les traitements actuels de la MP reposent principalement sur des analogues dopaminergiques et une stimulation intracérébrale à haute fréquence ^3,4. Cependant, ces thérapies n’ont pas d’effets neuroprotecteurs et ne parviennent pas à arrêter la progression de la maladie, soulignant le besoin urgent de stratégies innovantes pour prévenir la perte neuronale, favoriser la régénération et atténuer la progression de la maladie⁵.

L’octadécaneuropeptide (ODN) est un peptide dérivé du traitement protéolytique de l’inhibiteur de liaison au diazépam (DBI)⁶, précurseur de 86 acides aminés, exprimé principalement par les cellules astrogliales du système nerveux central des mammifères. La conservation évolutive de la structure primaire d’ODN suggère ses rôles biologiques significatifs. Il a été démontré que l’ODN régule des fonctions clés telles que l’apport alimentaire, le sommeil, l’agressivité et les comportements liés à l’anxiété⁷. Au-delà de son rôle régulateur, des recherches approfondies ont démontré les propriétés neuroprotectrices de l’ODN dans divers troubles neurologiques associés à la dégénérescence neuronale. Par exemple, l’ODN protège les neurones dopaminergiques dans un modèle de⁸ et réduit la taille de l’infarctus tout en améliorant la récupération fonctionnelle après un AVC chez les rongeurs⁹. L’une des principales caractéristiques de l’ODN est sa capacité à contrer de nombreux processus délétères activés lors de lésions cérébrales grâce à ses activités anti-apoptotiques, anti-inflammatoires, antioxydantes et immunomodulatrices 10,11,12. De plus, l’ODN peut agir au-delà de la phase aiguë de l’AVC^en favorisant la neurogenèse et la plasticité neuronale 9. Pour les applications cliniques potentielles de peptides ou de leurs analogues en tant qu’agents thérapeutiques, le choix d’une voie d’administration optimale est crucial pour prévenir une dégradation rapide de la circulation sanguine et minimiser l’effet de premier passage. Parmi les différentes stratégies d’administration, l’administration intranasale (IN) est apparue comme une alternative non invasive prometteuse, permettant l’administration directe de certaines molécules bioactives au cerveau tout en contournant la barrière hémato-encéphalique (BHE)13,14,15. Cette voie élimine le besoin d’injections stéréotaxiques invasives et améliore la biodistribution du cerveau par rapport aux organes périphériques. Par exemple, le polypeptide activateur de l’adénylate cyclase hypophysaire (PACAP) a démontré une plus grande efficacité dans l’absorption cérébrale et la neuroprotection lorsqu’il est administré par instillation d’IN par rapport à l’injection intraveineuse, réduisant considérablement le volume de l’infarctus et améliorant la récupération fonctionnelle dans les modèles d’AVC⁹.

Bien que l’administration d’IN soit une technique peu invasive et efficace pour administrer des agents thérapeutiques directement au cerveau en contournant la BHE, son efficacité reste dépendante de plusieurs paramètres pratiques, notamment la dose et le volume total administré. Chez les rongeurs, le volume recommandé varie généralement de 10 à 25 μL par narine pour éviter l’aspiration ou le débordement dans le tractus gastro-intestinal^16,17. L’efficacité de l’absorption nasale est également affectée par la taille de l’animal, la surface de la cavité nasale, la clairance mucociliaire et les propriétés composées telles que la lipophilie et le poids moléculaire^18,19. Ces contraintes doivent être prises en compte lors de la conception du protocole pour assurer la reproductibilité et la pertinence translationnelle dans les modèles précliniques.

Une étude in vivo a montré que l’injection intracérébroventriculaire (ICV) de faibles doses d’ODN conférait des effets neuroprotecteurs significatifs, notamment en prévenant la dégénérescence des neurones dopaminergiques chez les souris traitées au MPTP8. L’étude actuelle vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité de l’administration par IN de l’analogue de l’ODN, le cyclo_(1-8)OP, en tant qu’alternative non invasive à l’injection ICV pour l’administration d’un analogue peptidique neuroprotecteur au cerveau, en particulier pour déterminer si cette voie peut prévenir la perte neuronale dopaminergique et améliorer les résultats moteurs chez les souris traitées par MPTP, un modèle bien établi de la MP.

Protocole

Toutes les expériences ont suivi les directives de l’American Veterinary Medical Association et ont été approuvées par le Comité d’éthique médicale de l’Institut Pasteur (numéro d’approbation : FST/LNFP/Pro 160220). Des souris mâles C57BL/6J âgées de dix semaines ont été obtenues de l’Institut Pasteur de Tunis. Les souris ont été logées dans trois par cage dans une pièce à température contrôlée (21 °C ± 1 °C) avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et ont eu accès gratuitement à la nourriture et à l’eau pendant 1 semaine d’acclimatation. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Procédure de traitement

1. Divisez les animaux en quatre groupes : simulacres (n = 9), MPTP- (n = 9), cyclo_(1-8)OP- (n = 9) et MPTP + cyclo_(1-8)OP-traités (n = 9).
2. Administrer trois injections intrapéritonéales (IP) de MPTP (20 mg/kg p.c.) dans 100 μL de NaCl à 0,9 % à 2 h d’intervalle le premier jour du traitement (J0). 1 h après l’injection finale de MPTP, administrer 10 μL par voie intranasale (IN) de cyclo_(1-8)OP (10 ng) ou de solution saline.
3. Injecter chez les animaux témoins une solution saline au lieu de MPTP, avec ou sans cyclo_(1-8)OP (figure 1).
4. Le septième jour (J7), soumettez les souris à l’essai du cylindre. Ensuite, anesthésie profondément les souris à l’aide d’une injection IP de pentobarbital et sacrifie-les (selon les protocoles approuvés par l’institution) pour prélever des cerveaux en vue d’analyses PCR et biochimiques en temps réel⁽Figure 20).

2. Procédure d’injection

1. Injection intrapéritonéale
   1. Positionnez la souris avec précaution et immobilisez sa tête pendant la procédure.
   2. Orientez la souris tête vers le bas pour permettre aux organes de se déplacer naturellement avec la gravité, minimisant ainsi tout contact avec l’aiguille.
   3. Insérez l’aiguille à un angle de 45 degrés dans le bas-ventre.
   4. Administrer trois injections de 100 μL du même côté, avec un intervalle de 2 heures entre chaque injection, toutes effectuées le même jour.
   5. Injecter une solution saline à 0,9 % pour les groupes placebo et cyclo_(1-8)OP, ou une solution MPTP (20 mg/kg p.c.) pour les groupes MPTP et MPTP + cyclo_(1-8)OP.
2. Administration intranasale
   REMARQUE : La dose choisie (10 ng) était basée sur une étude antérieure démontrant l’efficacité neuroprotectrice de l’administration d’ODN⁸ par ICV. Le volume total de 10 μL et la taille des gouttelettes (5 μL par narine) ont été choisis conformément aux protocoles d’administration d’IN établis^18,21. Ce volume est bien inférieur à la capacité moyenne de la cavité nasale de la souris (0,032 cm³), minimisant ainsi le risque d’obstruction des narines ou d’asphyxie et assurant une absorption nasale sûre et efficace²².
   1. Tenez fermement la souris par la peau de son cou, en vous assurant que son nez est orienté vers le haut pour faciliter un dosage précis tout en minimisant les mouvements de la tête.
   2. Retournez l’animal de manière à ce que sa face ventrale soit tournée vers le plafond, avec son cou parallèle au sol. Assurez-vous que la tête de la souris reste solidement immobilisée, empêchant tout mouvement vertical ou horizontal.
   3. Alignez la pointe de la pipette avec la narine de la souris et appuyez lentement sur le piston pour former une petite gouttelette.
   4. Placez une gouttelette de 5 μL (la moitié du volume) près de chacune des narines de la souris.
   5. Laissez la souris inhaler naturellement la solution.
   6. Répétez ces étapes pour assurer un dosage constant, avec 10 μL de cyclo_(1-8)OP (10 ng) administrés pour les groupes MPTP + cyclo_(1-8)OP et cyclo_(1-8)OP.
   7. Observez attentivement la bouche de la souris tout au long de la procédure. La présence de liquide dans la bouche peut indiquer une absorption nasale incomplète. Cela pourrait résulter d’une taille de gouttelettes inappropriée, d’une administration rapide ou d’une inhalation insuffisante, permettant à la solution de s’accumuler dans le nasopharynx et de sortir par la bouche.
   8. Minimisez ce risque en réduisant la taille des gouttelettes si nécessaire et en veillant à ce que le temps soit suffisant pour l’inhalation avant d’administrer des volumes supplémentaires.
   9. Évitez d’administrer immédiatement une dose supplémentaire pour éviter un volume excessif.
   10. Documentez toute dose égarée et notez soigneusement tout liquide expulsé.
   11. Assurez-vous que chaque souris inhale complètement les deux gouttelettes (une par narine) avant de procéder à une administration ultérieure.
   12. Confirmez le ciblage précis du bulbe olfactif en effectuant une injection IN de solution de bleu de méthylène.
   13. Évaluez la précision en inspectant visuellement le dépôt et la propagation de la coloration bleue.

3. Test du cylindre

1. Utilisez un cylindre transparent, de 20 cm de hauteur et 15 cm de diamètre, placé au centre de la table.
2. Placez trois panneaux de carton noir autour du cylindre (à 4-8 cm) pour minimiser les effets d’éclairage ambiant. Laissez un côté du cylindre ouvert pour l’enregistrement vidéo.
3. Placez l’appareil photo à 40-60 cm du cylindre pour capturer sa vue complète.
4. Placez la souris dans le cylindre et commencez immédiatement l’enregistrement pendant 5 min.
5. Une fois que chaque souris a terminé le test, nettoyez le cylindre avec de l’eau, vaporisez de l’éthanol à 70 % pour éliminer les odeurs et essuyez-le avant de tester la souris suivante.
6. Lisez l’enregistrement à mi-vitesse pour permettre une observation détaillée.
7. Comptez chaque fois que la souris lève ses pattes contre la paroi du cylindre pour évaluer le comportement exploratoire²³.

4. Préparation d’extraits de tissus cérébraux pour des expériences biochimiques

1. Anesthésier les animaux avec du pentobarbital (40 mg/kg, IP) puis les décapiter (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
2. Disséquer le striatum et homogénéiser dans 2 mL de TBS par gramme de tissu à l’aide d’un tampon de lyse (1 % de Triton X-100, 50 mM de Tris-HCl, 10 mM d’EDTA).
3. La centrifugeuse s’homogéne à 14 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
4. Mesurez la concentration en protéines à l’aide du kit de détermination colorimétrique Biuret et conservez les aliquotes à -20 °C pour une analyse ultérieure.

5. Mesure de la formation intracellulaire des ROS

1. Incuber un extrait de tissu cérébral avec 10 μM de DCFH_2-DA à 37 °C pendant 30 min dans l’obscurité.
2. Retirer le surnageant et laver deux fois avec du PBS (0,1 M, pH 7,4, 37 °C).
3. Mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 538 nm.

6. Mesure des marqueurs de stress oxydatif

1. Malondialdéhyde
   1. Mélanger 20 μL d’échantillon (~50 μg de protéines) avec 125 μL de TCA à 20 % et 50 μL d’ATB à 0,67 %.
   2. Incuber à 95 °C pendant 30 min, puis refroidir rapidement à 4 °C.
   3. Ajouter 800 μL de butanol, vortex et centrifuger à 3000 × g pendant 10 min à 4 °C.
   4. Mesurer l’absorbance à 532 nm et calculer les niveaux MDA à l’aide du coefficient d’extinction (1,65 × 10^{5 M-1 cm-1}).
2. Mesure des protéines carbonyles
   1. Mélangez 200 μL de DNPH avec 50 μL d’échantillon de protéines et incubez pendant 1 h.
   2. Ajouter 250 μL de TCA à 20 % et laisser refroidir 10 min sur de la glace.
   3. Centrifuger à 3000 × g pendant 10 min à 4 °C et laver la pastille avec 10 % de TCA, puis avec de l’éthanol : acétate d’éthyle (v/v).
   4. Remettre la pastille en suspension dans 250 μL de chlorhydrate de guanidine 6 M et mesurer l’absorbance à 370 nm.
   5. Calculer les niveaux de PCO à l’aide du coefficient d’extinction (22 000 ^{M-1 cm-1})²⁴.

7. Mesure de l’activité des enzymes antioxydantes

1. Dosage de la superoxyde dismutase
   1. Incuber l’échantillon (~50 μg) avec de la catalase bovine (0,4 U/L), de la DL-épinéphrine (5 mg/mL) et un tampon Na₂CO₃/NaHCO₃ (62,5 mM, pH 10,2).
   2. Mesurer l’oxydation de l’épinéphrine à 480 nm à l’aide d’un spectrophotomètre pendant 300 s à 60 s d’intervalle^{de 25}.
2. Dosage de la catalase
   1. Mélanger l’échantillon avec 90 mM H₂O₂ dans PBS.
   2. Surveiller la diminution de l’absorbance de H₂O₂ à 240 nm pendant 3 min à 30 s d’intervalle.
   3. Calculer l’activité CAT à l’aide du coefficient d’extinction (40 ^{M-1 cm-1}).

8. Analyse PCR en temps réel

1. Extraire l’ARN total du striatum de souris à l’aide de la méthode acide du thiocyanate-phénol-chloroforme du guanidinium.
2. Traitez l’ARN avec la DNase I pour éliminer l’ADN génomique et mesurer la concentration d’ARN à 260 nm.
3. Effectuez une RT-PCR quantitative en utilisant 1 μg d’ARN total avec un kit Q-RT PCR en une étape.
4. Amplifiez l’ADNc avec SYBR Green PCR Master Mix et des amorces (Tableau 1).
5. Calculer les niveaux relatifs d’ADNc à l’aide de la méthode 2^−ΔΔCt avec GAPDH comme contrôle interne²⁶.

9. Analyse statistique

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide du logiciel GraphPad.
2. Utilisez le test t de Student pour les comparaisons simples. Pour les comparaisons multiples, utilisez l’ANOVA à un facteur ou à deux facteurs suivie du test post hoc de Bonferroni, selon le cas. Dans tous les cas, considérez une valeur P de 0,05 ou moins comme statistiquement significative.

Résultats

Après l’administration de MPTP, les souris ont présenté des symptômes parkinsoniens caractéristiques, notamment une queue de Straub élevée et rigide, une piloérection, une immobilité et des anomalies posturales telles que la courbure de la colonne vertébrale, confirmant l’établissement réussi du modèle MPTP (Figure 3). La vérification de l’administration d’IN à l’aide de bleu de méthylène, avec des souris sacrifiées 10 minutes après l’injection, a montré une distribution eff...

Discussion

Des études antérieures ont démontré que l’administration d’ODN par ICV contrecarrait la dégénérescence des neurones dopaminergiques nigrostriatal, les dommages oxydatifs et la neuroinflammation^induite par le MPTP 8. La présente étude a évalué l’efficacité de l’administration d’IN de l’analogue de l’ODN, cyclo_(1-8)OP, pour prévenir les déficiences motrices, les dommages oxydatifs et la neurotoxicité induits par le MPTP dans un modèle de MP in vivo

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2', 7'-dichlorofluorescine DCFH2-DA	Sigma Aldrich	Référence 064M4008V
Spectrophotomètre Bio-Rad  ;	Bio-Rad Laboratories, Philadelphie, Pennsylvanie, États-Unis
Butanol
Caméra
Catalase du foie bovin	SIGMA sciences de la vie	SLBZ7596
cyclo(1-8)OP	INSERM U1239 NorDiC, Rouen
Essai de cylindre (bécher gradué)
DNPH  ;
EDTA plus	Thermo Scientic  ;	11836714
Éthanol 70 %
Solution d’éthanol-acétate d’éthyle
Logiciel GraphPad  ;	La Jolla, Californie, États-Unis
Chlorhydrate de guanidine	GeneON	5CCAE310
H2O2  ;	Pharmaghreb	AEQ10101-D
Seringue à insuline 2ml
L-épinéphrine  ;	MP Biomédical	151065
Bleu de méthylène  ;	Produits chimiques Thermo Scientific	10455081
Micropipette  ;
Lecteur de microplaques Synergy LX-Agilent	Synergie LX-Agilent
Le MPTP	MedChemExpress	HY-15608
Le MPTP
Na2CO3/NaHCO3 tampon  ;
NaCl 0,9
kit Q-RT PCR en une étape  ;	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre
Pentobarbital  ;	Sigma Aldrich
Spectrophotomètre Synergy LX Nanodrop 2000	Biotek Agilent
Acide thiobarbiturique (TBA, 0,67 %)  ;	LOBA CHEMIE PVT. LTÉE	626500025
Conseils
Acide trichloracétique (TCA, 20 %)	Sisco Research laboratories SRL	6740608
Tri-réactif  ;	Sigma Aldrich	MFCD00213058
Tris-HCl	Thermo Scientic  ;	J22638. K2
Triton X-100	Thermo Scientic  ;	A16046.AE