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Réglage des modes de contractilité et de déformation des assemblages à base d’actine active in vitro : des réseaux actifs bidimensionnels aux gouttes à cristaux liquides

DOI:

10.3791/68127

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July 11th, 2025

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1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

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Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons des méthodes pour préparer des assemblages d’actine quasi-bidimensionnels (2D) intriqués, réticulés et à cristaux liquides à partir de protéines purifiées.

Abstract

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Les matériaux à base de cytosquelette d’actine sont largement étudiés en tant que matériaux cellulaires modèles pour élucider les mécanismes physiques de la mécanique cellulaire, tels que la régulation de forme et la production de force, ainsi que des matériaux polymères mous intrigants. Dans cette méthode, nous détaillons la création d’assemblages à base d’actine in vitro en utilisant des protéines purifiées pour des études de microscopie à fluorescence. Nous polymérisons de longs filaments d’actine dans une chambre d’échantillonnage et utilisons un appauvrissant en polymère pour entasser les filaments dans un réseau bidimensionnel (2D) enchevêtré contre une surface passivée par une couche de tensioactif. L’ajout de filaments de myosine II dans le muscle squelettique en présence d’adénosine triphosphate (ATP) induit la contraction du réseau d’actine. En regroupant des filaments d’actine avec un réticulant, nous ajustons la contractilité de l’assemblage, passant d’un matériau qui se déforme à un matériau qui glisse à l’échelle microscopique. En réduisant la longueur des filaments d’actine en copolymérisant l’actine en présence de protéine de coiffage, nous réglons le matériau d’un réseau 2D à un cristal liquide. La réticulation de filaments d’actine courts dispersés entraîne la formation de gouttelettes de cristaux liquides tridimensionnelles (3D).

Introduction

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Les matériaux biologiques actifs sont à la base de processus mécaniques dans divers processus physiologiques, notamment le transport intracellulaire, la migration cellulaire, la régulation de la forme cellulaire et la génération de force biologique 1,2,3. Les assemblages in vitro de systèmes cytosquelettiques, construits à partir de composants protéiques purifiés et modifiés auto-assemblés dans un tampon, constituent un outil établi pour caractériser les processus biophysiques et biochimiques fondamentaux 4,5,6,7. Ces systèmes modèles simplifiés permettent d’étudier les protéines sans la complexité des environnements cellulaires, ce qui permet d’identifier les rôles des composants individuels. En plus de soutenir les études biologiques fondamentales, les assemblages cytosquelettiques in vitro sont également largement développés en tant que systèmes expérimentaux pour étudier les matériaux à cristaux liquides et actifs ou hors équilibre 8,9,10,11,12,13,14,15.

L’actine est un biopolymère clé dans les assemblages cytosquelettiques, régulant la mécanique et la dynamique cellulaires par le biais de forces motrices et de polymérisation3,16. Les expériences de microscopie à fluorescence permettent de visualiser les changements structurels du réseau d’actine au cours de processus tels que la contraction motrice et le regroupement d’actine par réticulation des protéines. L’imagerie des réseaux d’actine tridimensionnels tels qu’ils sont remodelés par des protéines motrices intégrées a mis en lumière le rôle des réticulants d’actine dans la contraction du réseau et la formation de motifs 12,17,18,19. Cependant, les réseaux d’actine quasi bidimensionnels surmontent les défis de l’imagerie avec une résolution spatio-temporelle suffisante pour capturer les changements structurels du réseau. De plus, les structures d’actine à haute densité et quasi bidimensionnelles sont une imitation plus proche des assemblages cellulaires tels que le cortex d’actine dense d’une cellule20. Les stratégies visant à produire des structures d’actine quasi bidimensionnelles ont inclus la fixation de protéines nucléantes d’actine à une lamelle21,22, le couplage de l’actine à une surface par des molécules de liaison 10,23,24, la formation de faisceaux d’actine denses attachés aux billes à une surface de lamelle 25,26 et la concentration de filaments d’actine à une surface de lamelle avec des agents d’encombrement moléculaires10,27.

Ici, nous détaillons une méthode pour créer des assemblages à base d’actine modèles reproductibles et comment la modifier pour préparer des variations allant de réseaux actifs à des cristaux liquides quasi-2D et des gouttelettes nématiques. Nous avons déjà utilisé des méthodes similaires pour étudier la formation de gouttelettes cristallines liquides séparées en phase de filaments d’actine courts avec l’ajout de réticulant11, les changements dans les modes de déformation du réseau d’actine générés par la myosine II (par exemple, le flambage du filament ou le glissement relatif) avec réticulation et connectivité des filaments28, les différences dans les forces générées par la myosine II sur les faisceaux d’actine avec un espacement et une conformité variables29, et transport de la myosine II30. L’utilisation de protéines de réticulation et de protéines de coiffage d’actine permet de varier systématiquement la longueur du filament d’actine et l’architecture d’assemblage.

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Protocol

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REMARQUE : Protéines et marquage : Aux fins de ce protocole, il est supposé que le chercheur commence avec des stocks de protéines purifiées, qui sont marquées par fluorescence lorsque cela est approprié pour l’investigation en microscopie à fluorescence. Ces protéines peuvent être achetées ou purifiées et marquées par fluorescence en laboratoire 31,32,33,34,35,36,37. Dans ce protocole, des stocks de protéines congelées dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C ont été utilisés. Les protéines peuvent généralement être marquées par des méthodes similaires. La protéine peut être étiquetée comme une étape de purification ou à partir d’un bouillon congelé. Décongelez les stocks de protéines congelés sur de la glace avant de procéder à l’étiquetage. Ce qui suit est une méthode de marquage fluorescent de la myosine II du muscle squelettique (myosine) avec un fluorophore fonctionnalisé par maléimide (adapté de38).

1. Préparez la myosine marquée par fluorescence

  1. Commencez avec ~2 mL de myosine à une concentration de 5 à 10 mg/mL.
    REMARQUE : Dans ce protocole, on a utilisé de la myosine II du muscle squelettique purifiée à partir du muscle de poulet à l’aide des méthodes publiées35 . La myosine est stockée dans un tampon de stockage de myosine (25 mM KPO4, 0,6 M KCl, 10 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 1 mM de dithiothréitol (DTT), pH 6,6), soit directement après la purification, soit à partir de stock congelé. Il est important de garder la myosine froide en tout temps pour éviter la perte d’activité motrice.
  2. Ajouter du DTT à la solution de myosine décongelée jusqu’à une concentration finale de 10 mM. Utilisez une solution mère de DTT de 1 M pour limiter le volume.
    REMARQUE : Le DTT réduit le groupe thiol sur les cystéines dans la protéine de myosine, les préparant à réagir avec le maléimide pour le marquage.
  3. Pour éviter toute interférence avec la réaction d’étiquetage, retirer le DTT par dialyse pendant la nuit dans 50 mM HEPES, 500 mM KCl, 1 mM EDTA, pH 7,6, à 4 °C.
  4. Après la dialyse, centrifuger la solution de myosine à 100 000 x g à 4 °C pendant 15 minutes pour granuler les agrégats. Récupérez le surnageant.
  5. Déterminer la concentration de myosine dans le surnageant à l’aide d’un spectrophotomètre. Estimez la concentration de myosine à l’aide d’un coefficient d’extinction à 280 nm de ~148 000 M-1 cm-1 pour la myosine38 du muscle squelettique. Ce coefficient d’extinction suppose qu’un « monomère » est constitué d’une chaîne lourde, d’une chaîne légère essentielle et d’une chaîne légère régulatrice.
  6. Préparez le fluorophore pour la réaction de marquage en remettant en suspension le fluorophore en poudre dans du diméthylsulfoxyde sec (DMSO) à une concentration de 5 mM de fluorophore.
    REMARQUE : Tout fluorophore avec un groupe réactif maléimide devrait fonctionner. Alexa 647 maleimide a été utilisé. Le DMSO est hygroscopique et accumule de l’eau. Le DMSO « sec » fait référence au DMSO qui a été stocké dans un environnement pour empêcher l’accumulation d’eau. Pour s’assurer que le solvant est du DMSO sec, une ampoule de DMSO fraîchement ouverte a été utilisée pour cette étape. Ne mettez pas les solutions DMSO sur la glace. Le DMSO a un point de fusion de 19 °C, il doit donc être à température ambiante (ou légèrement plus chaud) pour la pipette39.
    ATTENTION : Le DMSO peut pénétrer les gants, il est donc recommandé de porter des gants en nitrile double et de veiller à éviter les déversements.
  7. Pour préparer la myosine à ajouter du fluorophore, retirez brièvement la solution de myosine de la glace et laissez-la se réchauffer à température ambiante (RT).
    REMARQUE : Ne laissez pas la myosine à la RT plus longtemps que nécessaire. Effectuez cette étape après que le fluorophore est en suspension dans le DMSO.
  8. Dès que la solution de myosine est proche de la RT, ajoutez la solution de fluorophore à la myosine et mélangez rapidement de manière à ce qu’il y ait un rapport molaire de 5:1 entre fluorophore et myosine. Placez la solution de myosine sur de la glace dès qu’elle est mélangée au fluorophore.
  9. Incuber sur glace pendant 1 h, à l’abri de la lumière, puis stopper la réaction en ajoutant du DTT à une concentration de 1 mM. Utilisez un support TNT de 1 M pour minimiser le volume ajouté.
  10. Retirez les fluorophores n’ayant pas réagi. Utilisez l’une des deux méthodes décrites ci-dessous :
    1. Option 1 :
      1. Polymériser la myosine en la diluant lentement dans un tampon F (10 mM d’imidazole, 50 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM d’EGTA, 4 mM d’ATP, pH 7,5). Il s’agit d’une dilution d’environ 10x, en fonction du volume de colorant ajouté à l’étape 1.8.
      2. Incuber sur glace pendant 20 min. Essorer à 8 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 °C pendant 10 min jusqu’à granuler.
      3. Jetez le surnageant contenant le colorant libre et remettez en suspension/dépolymérisez la myosine avec le tampon de stockage de la myosine (à partir de l’étape 1). Pour éliminer tout colorant restant, dialysez en 5 mM d’acide 2-[4-(2-sulfoéthyl)pipérazine-1-yl]éthanesulfonique (GOUTTES), 0,45 M KCl, pH 7,0 (>excès de volume 100 fois) trois fois pendant 15 min chacune à l’aide d’une coupure de 10 kD.
    2. Option 2 :
      1. Utilisez une colonne de dessalage pour l’échange de tampon en tuyaux de 5 mM, 0,45 M KCl, pH 7,0, avec le protocole standard du fabricant de la colonne.
  11. Estimez le rapport fluorophore/protéine en mesurant la concentration de myosine et de fluorophore à l’aide d’un spectrophotomètre, à l’aide des coefficients d’extinction de la myosine à 280 nm et du fluorophore indiqués par le fabricant. Un rapport de 2-4 est typique.
    REMARQUE : La myosine étiquetée est maintenant prête pour la congélation instantanée des aliquotes dans l’azote liquide. Les aliquotes sont stockées à -80 °C pour un stockage à long terme.

2. Facultatif : Procédure d’élimination de la myosine inactive

REMARQUE : La myosine peut être utilisée directement à partir d’une aliquote décongelée dans les expériences, mais une fraction de la myosine sera inactive. La procédure suivante décrit comment éliminer la myosine inactive. Il s’agit d’une étape facultative, mais elle peut être cruciale pour la reproductibilité. Les aliquotes de myosine sont utilisées pendant environ 3 jours après la décongélation, stockées à 4 °C ou sur de la glace.

  1. Polymériser l’actine non marquée, stabilisée à la phalloïdine :
    1. Mélangez 10 μL de tampon 10xF, 1 μL d’ATP 100 mM et de ddH2O de sorte que le volume final (y compris l’actine à l’étape 2.1.2) soit de 100 μL dans un tube de microcentrifugation.
    2. Ajouter le monomère d’actine à une concentration finale de 20 μM et mélanger à la pipette.
    3. Pour stabiliser les filaments d’actine, ajoutez de la phalloïdine à une concentration finale de 6,7 μM en utilisant un stock de 100 μM de phalloïdine dans du méthanol et un mélange de pipettes.
      ATTENTION : La phalloïdine est une toxine40. Évitez les déversements et la contamination.
    4. Incuber sur glace pendant 20 min pour permettre à l’actine de polymériser. Après la polymérisation, stockez l’actine à 4 °C pour les futures baisses de dos.
  2. Mélangez 10 μL d’actine stabilisée à la phalloïdine, 3 μL de tampon 10x F, 0,3 μL de 100 mM d’ATP, 6 μL de 2 M KCl et ddH2O jusqu’à un volume final de 30 μL (y compris le volume associé à l’ajout de myosine à l’étape suivante) dans un tube de microcentrifugation sur glace.
  3. Ajouter de la myosine marquée au dimérique à partir du stock préparé à la concentration souhaitée, en maintenant un rapport molaire de la myosine à l’actine de ≤ 1:6.
  4. Centrifuger la solution obtenue à froid (4 °C) à 100 000 x g pendant 30 min. La myosine inactive se liera aux filaments d’actine et restera liée. Les filaments inactifs de myosine et d’actine formeront une pastille lors de la centrifugation.
  5. Retirez le surnageant (contenant de la myosine active) et stockez-le à 4 °C pour l’utiliser dans des expériences.
  6. Estimez la concentration de myosine à l’aide de la même méthode spectrophotométrique pour mesurer la concentration de myosine après le marquage.
    REMARQUE : Aux concentrations de protéines et d’ATP qui restent dans le surnageant, le pic d’absorbance de 280 nm est obscurci par le pic d’absorbance de l’ATP de 260 nm, de sorte que la mesure de la concentration à travers l’absorbance associée au fluorophore ou une mesure de fluorescence relative est plus précise.

3. Préparez une solution tensioactive

REMARQUE : La solution tensioactive peut également être achetée pré-mélangée et prête à l’emploi.

  1. Commencez avec un flacon en verre propre. Rincez le flacon à l’eau et à l’éthanol pour éliminer les contaminants potentiels dans l’huile, qui est un solvant pour le tensioactif. Utilisez des flacons en verre borosilicaté avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène (PTFE).
  2. Prélevez 5 à 20 mg de tensioactif fluoré à l’aide d’une pointe de pipette et déposez-le près du fond d’un flacon en verre. Mesurez la quantité de tensioactif en poids à l’aide d’une balance avec une précision inférieure au milligramme.
  3. Pipetez le volume approprié d’huile fluorée pour obtenir une solution à 2 % en poids et fermez le flacon.
    REMARQUE : L’huile est volatile, fermez donc le flacon immédiatement après la mesure.
  4. Vortex à basse vitesse pour mélanger.
    REMARQUE : La solution peut maintenant être conservée à 4 °C pendant quelques semaines. L’âge et la qualité du tensioactif peuvent influencer à la fois l’encombrement et l’apparence de l’actine. Une actine qui semble mouchetée, qui adhère à la surface ou qui ne s’accumule pas à la surface peut indiquer qu’une solution de surfactant fraîche est nécessaire. Le stockage sous azote gazeux peut améliorer la durée de conservation.

4. Préparez la chambre d’échantillonnage (trois options)

REMARQUE : Cette section fournit une procédure pour construire trois chambres d’échantillonnage standard utilisées pour la préparation des échantillons pour la microscopie. Les deux sections suivantes couvrent la préparation de l’échantillon proprement dit et la passivation de la chambre d’échantillonnage pour le chargement de l’échantillon.

  1. Option 1 : Cellule d’écoulement
    REMARQUE : Une simple cellule à flux est un moyen standard de fabriquer des échantillons de microscope dans de nombreux laboratoires. Pour ce protocole, il est particulièrement adapté aux échantillons enfermés dans des gouttes d’émulsion. Il peut être difficile d’obtenir de grands champs de vision plats avec le revêtement de surface tensioactif décrit dans ce protocole, de sorte que pour les échantillons 2D, les options 2 et 3 sont souvent plus reproductibles. La géométrie du canal peut également provoquer un mélange inégal de composants ajoutés ultérieurement, tels que la myosine.
    1. Placez 2 morceaux de ruban adhésif double face parallèles l’un à l’autre sur la largeur de la lame de microscope pour former les limites du canal de la cellule d’écoulement. Le canal formé entre les deux morceaux de ruban doit avoir une largeur d’environ 2 mm.
      REMARQUE : Des canaux plus petits aident à empêcher les émulsions de se coincer dans la partie initiale du canal. Pour faire une bonne étanchéité, utilisez des morceaux de ruban adhésif juste plus longs que la largeur de la lame de verre et coupez après avoir construit la cellule d’écoulement.
    2. Placez la lamelle sur le canal de bande. Assurez-vous que la lamelle est perpendiculaire à la lame du microscope. Utilisez une lamelle de 30 mm x 40 mm à cet effet, car elle offre un petit porte-à-faux lorsqu’elle est placée sur une glissière.
    3. Pour créer une bonne étanchéité et éliminer les poches d’air entre le ruban et la lamelle, appuyez sur la zone de la lamelle qui est en contact avec le ruban adhésif double face.
      REMARQUE : Veillez à ne pas casser la lamelle en appuyant sur les bords. Frotter la zone avec un objet arrondi, comme l’extrémité d’un marqueur bouché, fonctionne bien pour appuyer sur le ruban.
    4. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez tout excès de ruban adhésif sur la lame de microscope et la lamelle, de sorte que le seul ruban visible se trouve dans le canal d’échantillon.
      REMARQUE : Soyez prudent en complétant cette étape, car il est facile de casser accidentellement la lamelle en essayant de retirer le ruban.
  2. Option 2 : Cylindre sur lamelle non traitée
    REMARQUE : Cette option convient aux échantillons planaires 2D. Il est pratique d’ajouter des composants à différents moments pendant les expériences de microscopie. Cette chambre d’échantillonnage ne doit pas être utilisée pour des émulsions, qui crément plutôt que sédimentent, ce qui rend l’imagerie difficile.
    1. Rincez la lamelle et le cylindre de clonage du verre avec de l’eau, de l’éthanol et de l’eau. Sécher à l’air libre.
    2. À l’aide d’une fine couche d’époxy de 5 minutes, collez le cylindre de clonage de verre sur la lamelle.
      REMARQUE : Il est utile d’appliquer une force sur le cylindre pendant que l’époxy sèche en plaçant un objet propre sur le dessus du cylindre. Un petit couvercle de boîte de Pétri ou la boîte à lamelles peut bien fonctionner.
  3. Option 3 : Cylindre sur lamelle recouverte de silane
    REMARQUE : Cette option permet d’obtenir de manière reproductible une grande région plane au centre de la chambre et de réduire le débit en vrac de l’échantillon. Pour y parvenir, une région hydrophobe a été créée qui est entourée d’une région hydrophile sur la lamelle, ce qui donne un échantillon final qui a un réseau d’actine sur une région passivée et confinée où l’actine est ancrée aux régions hydrophiles au bord de la chambre. Cette chambre d’échantillonnage ne doit pas être utilisée pour les émulsions, qui crément plutôt que de sédimenter dans le tampon, ce qui rend l’imagerie difficile.
    1. Préparez des lamelles avec un revêtement de silane pour les rendre hydrophobes.
      1. Chargez les lamelles en verre propres dans un support en acier inoxydable. Prénettoyer le verre par sonication dans un détergent ou de l’éthanol si désiré.
      2. Dans une boîte de coloration en verre, diluer le triméthoxy(octyl)silane à une solution à 2 % d’isopropanol.
      3. Immerger les lamelles dans la solution pendant 10 min.
      4. Pour rincer, remplacez la solution par de l’eau. Soulevez et réimmergez six fois les supports de lamelles. Répétez le processus quatre fois de plus avec des échanges d’eau entre les deux.
      5. Couvrez les grilles avec du papier d’aluminium pour protéger les lamelles de la poussière et séchez-les à 25-30 °C.
    2. Placez une lamelle traitée à l’octyl-silane au fond d’une boîte de Pétri en verre ou de tout autre récipient en verre ouvert qui s’adaptera au nettoyant à l’ozone ultraviolet (UV).
    3. À l’aide d’une pince, placez un carré de PTFE de 2 mm x 2 mm (découpé dans une feuille) sur la lamelle qui servira de masque pour le traitement à l’ozone UV suivant.
    4. Traitez la lamelle avec de l’ozone UV pendant 10 min. Ce processus rend le verre hydrophile dans les zones exposées qui ne sont pas couvertes par le masque PTFE.
    5. Retirez délicatement le plat sans déranger la lamelle ou le carré de PTFE. Collez un cylindre de clonage de verre sur la lamelle à l’aide d’époxy de 5 minutes. Assurez-vous que le cylindre entoure le carré de PTFE, qui peut être retiré à l’aide d’une pince après le séchage de l’époxy.
      REMARQUE : Le carré de PTFE peut être réutilisé dans de futures expériences.

5. Assemblage du réseau d’actine

REMARQUE : Ce qui suit concerne la préparation d’un échantillon de 50 μL. Pour les échantillons en cylindre, un volume plus important peut réduire les effets du ménisque et augmenter la stabilité de l’échantillon.

  1. Dans un tube de microcentrifugation, ajouter 5 μL de tampon 10x F, ddH2O nécessaire pour porter le volume final à 50 μL, 1 μL de bêta-mercaptoéthanol à 25 % en volume, 1 μL de glucose à 225 mg/mL, 1 μL d’un mélange de glucose oxydase (135 mg/mL) et de catalase (85 000 unités/mL), 1 μL de 25 mM d’ATP, et 10 μL de méthylcellulose à 15 centipoises à 2 % en poids. Mélangez soigneusement à la pipette.
    REMARQUE : Le bêta-mercaptoéthanol est une toxine. Évitez les déversements et la contamination. Les réactifs glucose oxydase, catalase, glucose et bêta-mercaptoéthanol sont dans l’échantillon pour créer un système de piégeage de l’oxygène. La solution mère de méthylcellulose est préparée en agitant à 4 °C et peut être conservée à 4 °C pendant plusieurs semaines. La méthylcellulose peut précipiter hors de la solution et doit être préparée à nouveau s’il y a un précipité visible ou si l’encombrement de l’actine est faible.
  2. Facultatif : Ajouter une protéine de réticulation (0,1 à 1 protéine de réticulation pour 1 monomère d’actine). Mélange de pipettes.
    REMARQUE : Des protéines de réticulation peuvent également être ajoutées après la polymérisation de l’actine et laissées se lier pendant 10 à 20 minutes avant d’ajouter de la myosine. Ceci est préférable pour les concentrations de réticulant qui sont suffisamment élevées pour regrouper les filaments d’actine - les faisceaux sont répartis de manière plus uniforme et reproductible à l’interface tensioactif-eau. La chambre d’échantillonnage cylindrique peut être ajoutée à l’ajout d’un agent de réticulation après la polymérisation de l’actine.
  3. Ajouter de la phalloïdine (1 phalloïdine pour 1 à 3 monomères d’actine), si désiré. Mélange de pipettes.
  4. Dans un tube séparé, mélangez l’actine non marquée et l’actine marquée de sorte que lorsque le mélange d’actine est entièrement ajouté à l’échantillon de 50 μL, la concentration totale sera de 2,64 μM. Utilisez un rapport de 1 monomère d’actine marqué pour 9 monomères d’actine non marqués. Mélange de pipettes.
    REMARQUE : Les monomères d’actine commenceront à polymériser lors de l’ajout à la solution d’échantillon. L’ajout séparé de l’actine marquée et de l’actine non marquée peut entraîner une actine qui apparaît tachetée de régions sombres et fluorescentes le long du contour d’un seul filament. Les stocks de monomères d’actine sont mélangés pour assurer des filaments d’actine uniformément étiquetés. La purification et le marquage de l’actine sont décrits aupoint 31.
  5. Facultatif : Pour réaliser des cristaux liquides ou d’autres expériences en utilisant des filaments d’actine courts, ajoutez la protéine de coiffage au mélange d’actine à partir de l’étape 5.4. La quantité exacte de protéine de coiffage dépend de la fraction active de la protéine et de la longueur des filaments d’actine ciblés, mais généralement, environ 1 à 10 % molaire de protéine de coiffage (par rapport à l’actine) est suffisant pour créer des filaments courts pour les expériences à cristaux liquides. La purification des protéines de coiffage est décrite aupoint 36.
  6. Pour commencer à polymériser l’actine, ajoutez le mélange d’actine à la solution de tampon F et au mélange de pipettes.
  7. Laissez l’actine polymériser dans le tube de microcentrifugation à RT, puis ajoutez-la à la cellule d’échantillon après 10 à 30 min.
  8. Facultatif : Si vous préparez un échantillon en bouteille, aspirez toute la solution dans une pointe de pipette afin qu’elle soit prête à être pipée à l’étape 7.4 du chargement de la chambre d’échantillonnage en bouteille.

6. Facultatif : Préparez des émulsions

REMARQUE : Il est parfois pratique de préparer ces échantillons dans des émulsions, qui fournissent une chambre d’échantillonnage confinée. Les émulsions sont préparées à l’aide de réactifs similaires à ceux de Chowdhury et al., ce qui donne une phase continue d’huile qui a des gouttes d’émulsion aqueuse médiées par des tensioactifs41. En présence d’un agent d’appauvrissement, tel que la méthylcellulose, utilisé dans ce protocole, les échantillons d’actine se presseront vers l’interface aqueuse de cette émulsion. Pour les échantillons sur lesquels ce protocole est basé, une différence entre la polymérisation de l’actine avant ou après son ajout aux émulsions n’est pas observée ; Cependant, il a été rapporté que l’étape de polymérisation est importante à prendre en compte dans certaines expériences d’encapsulation42.

  1. Ajouter 3,5 μL d’huile tensioactive dans un tube de microcentrifugation. Utilisez un tube de microcentrifugation transparent, de couleur claire ou transparent pour cette étape.
  2. Sans mélanger, ajouter 5 μL de la solution d’actine sur le dessus de la couche d’huile-tensioactif. Fermez le tube de la microcentrifugeuse.
  3. Tout en tenant le haut du tube de microcentrifugation, effleurez le bord inférieur du tube pour créer une mousse avec des émulsions visibles au départ. Continuez à agiter le tube jusqu’à ce que la mousse n’affiche aucune caractéristique distincte lorsqu’elle est rétroéclairée, indiquant des microémulsions.
    REMARQUE : Lors de la préparation d’un échantillon dans des émulsions, une cellule d’écoulement ou une autre chambre d’échantillon doit être prête avant de préparer l’échantillon d’actine. La chambre d’échantillonnage du cylindre de verre ne fonctionne pas bien pour les émulsions car elles vont crémer à l’interface aérienne plutôt que de sédimenter à la surface du verre de couverture.

7. Chargez la chambre d’échantillonnage (chambres à cylindre)

  1. Pipette de 5 μL de solution d’huile tensioactive dans le fond de la chambre du cylindre en verre
    REMARQUE : Alternativement, des échantillons peuvent être faits en passivant la surface avec une bicouche lipidique supportée 11,29,30.
  2. Inclinez la lamelle et tournez-la lentement de sorte que la surface de la lamelle et le cylindre inférieur soient recouverts de la solution tensioactive.
  3. Retirez l’excès de solution de tensioactif d’huile à l’aide d’une pipette pour obtenir une couche d’huile aussi fine que possible sans permettre à l’huile, qui est volatile, de s’évaporer complètement.
  4. Ajoutez immédiatement la solution d’échantillon de l’étape 5.7 dans la chambre.
  5. Couvrez la chambre avec un petit morceau de ruban PTFE pour éviter l’évaporation et l’écoulement.

8. Alternez : Chargez la chambre d’échantillonnage (cellule d’écoulement)

  1. Pour préparer le chargement de la cellule d’écoulement, mélangez une petite quantité d’époxy de 5 min. Une chute d’une surface inférieure à 0,5cm2 est généralement suffisante.
  2. Pour placer l’échantillon dans la cellule d’écoulement, pipetez d’abord 1 à 3 μL de solution d’huile surfactante dans le canal d’échantillon de la cellule d’écoulement pour créer un petit bouchon de solution qui mouille le canal.
  3. Pipetez immédiatement un volume de solution d’échantillon ou de suspension d’émulsion lentement à l’entrée de la cellule d’écoulement pour remplir le canal. En règle générale, pour un canal d’environ 2 mm, le volume est d’environ 8 μL. L’entrée est le côté où la solution huile-tensioactif a été ajoutée.
    1. Si le volume de l’échantillon dépasse le volume de la cellule d’écoulement, évacuez l’échantillon à travers la cellule d’écoulement en plaçant une lingette non pelucheuse ou du papier filtre à l’autre extrémité du canal.
    2. Si le ménisque de la solution huile-tensioactif s’est retiré, ce qui entraîne un espace d’air, inclinez d’abord la cellule d’écoulement pour éliminer l’espace d’air à l’entrée avant d’ajouter l’échantillon.
  4. Si nécessaire, ajoutez une solution huile-tensioactif supplémentaire jusqu’à ce que l’air ne soit plus visible dans le canal ou pour pousser l’échantillon (en particulier pour les émulsions) plus loin dans le canal.
  5. Scellez chaque côté du canal avec de l’époxy 5 min (mélangé juste avant de charger la cellule d’écoulement).

9. Imagez et ajoutez de la myosine

  1. Montez l’échantillon sur le microscope et commencez l’imagerie timelapse de l’actine à l’aide d’un objectif 20x, 40x, 60x ou 100x avec immersion dans l’huile ou dans l’eau pour fournir une ouverture numérique suffisamment grande pour l’imagerie haute résolution. En cas de polymérisation dans la chambre d’échantillonnage, laisser polymériser pendant ~30 minutes ou jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’allongement ou de mouvement visible du filament.
  2. Facultatif : Ajouter un réticulateur.
  3. Ajoutez de la myosine à l’aide des options 1 ou 2 ci-dessous.
    1. Ajouter la myosine sous forme de dimère pipeté sur le dessus de l’échantillon (aucun mélange n’est nécessaire car le dimère de myosine va se diffuser).
    2. Ajouter de la myosine sous forme de filaments pré-polymérisés. La pipette mélange très lentement environ la moitié du volume total pour éviter de perturber l’actine encombrée.
      REMARQUE : La méthode idéale pour la myosine en plus d’obtenir la densité ou la taille de filament souhaitée à la surface de la lamelle peut varier pour différentes architectures d’actine et doit être déterminée expérimentalement.
  4. Démarrez l’imagerie en accéléré.

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Results

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Une large gamme d’assemblages d’actine peut être formée dans des systèmes modèles utilisant des protéines purifiées en suivant la stratégie générale décrite dans ces méthodes, où l’actine est polymérisée en filaments en présence de protéines accessoires qui modifient l’architecture d’assemblage (Figure 1). Lorsque l’actine est polymérisée en filaments sans réticulation ni protéine de coiffage, elle forme des réseaux de filaments enchevêtrés (Figure 1A). L’ajout ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il y a de nombreuses considérations à prendre en compte pour produire des assemblages d’actine reproductibles. L’un des éléments les plus critiques pour produire des données reproductibles et analysables est la surface en verre de protection de la chambre d’échantillonnage. Les protéines contenues dans les échantillons d’actine in vitro, en particulier la myosine, sont extrêmement collantes et adhèrent aux surfaces en verre non traitées ou mal traitées, rendant un échantillon in...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Todd Thorenson, Mike Murrell, Jennifer Ross, Patrick McCall et d’autres membres des laboratoires Gardel et Kovar (Université de Chicago) pour les discussions utiles lors de l’élaboration des méthodes. M.A.C. et S.R. ont été partiellement soutenus par les subventions d’opportunité de recherche de premier cycle du College of Engineering Computing and Applied Sciences de l’Université de Clemson, et V. J. A. a été soutenu par le Clemson Biophysics REU dans le cadre du NSF Award #2349368 avec un financement des programmes DBI et EPSCoR. Ce travail a également été soutenu en partie par le programme EPSCoR de la National Science Foundation dans le cadre de la bourse NSF #OIA-1655740, en partie par et en partie par le programme Clemson Creative Inquiry + Undergraduate Research.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tube de microcentrifugation de 0,6 mLFisher Scientific05-408-123
008-Tensioactif fluoréRAN Biotechnologies00115081361-6525Alternative à la solution prémélangée
008-FluoroSurfactant en HFE7500RAN Biotechnologies008-FluoroSurfactant-2wtH-50GSolution prémélangée
2-mercaptoéthanol (&beta ;-mercaptoéthanol)Sigma Aldrich63689Numéro CAS : 60-24-2
Solution mère : 25 mM dans de l’eau MilliQ, stockée à 4 ° ; Acide C
4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthane-sulfonique (HEPES)Sigma AldrichH3375Numéro CAS : 7365-45-9
5 min EpoxyDevcon14250
Cytosqueletted’actineAKL99-A>Muscle squelettique de lapin pur à 99 %
(alternatif à purifiant)
Actine (marquée à la rhodamine)Cytoskeleton, Inc.AR05-AMuscle squelettique du lapin
(alternatif à purifiant)
Adénosine 5&prime ;-triphosphate (ATP)Sigma AldrichA6419Numéro CAS : 34369-07-8
Solution mère : 25 mM dans de l’eau MilliQ, stocker à -20 ° ; C
Conserver congelé pour éviter l’hydrolyse
Chlorure de calcium (CaCl2)Sigma AldrichC5670Numéro CAS : 10043-52-4
Protéine de coiffage (souris)Purifié de la surexpression dans E.coli avec un HisTag
Solution mère : 20 mM dans un tampon de protéine de coiffage à -80 ° ; C
Catalase du foie bovinSigma AldrichC9322Numéro CAS : 9001-05-2
Solution mère : 85 ku/mL, stocker aliquote avec la glucose oxydase à -20° ; Verre
de couvertureen C Fisherbrand12544CBorosilicate, #1.5, 24 mm x 40 mm
Fisherbrand not Fisher Finest
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG8270Numéro CAS : 50-99-7
Solution mère : 225 mg/mL dans de l’eau MilliQ, conserver à -20 ° ; C
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich3860-OPNuméro CAS : 3483-12-3
Solution mère : 1 M dans de l’eau MilliQ, stocker à -20 ° ; C
Ruban adhésif double face3M3136
Ethyl alchohol 200 ProofPHARMCO111000200Numéro CAS : 64-17-5
200 proof
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétique (EGTA)Sigma AldrichE3889Numéro CAS : 67-42-5
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma AldrichE9884Numéro CAS : 60-00-4
Glucose oxydaseSigma Aldrich345386Numéro CAS : 9001-37-0
Solution mère : 135 mg/mL dans de l’eau MilliQ, stocker aliquote avec la catalase à -20 ° ; C
GlycérolSigma Aldrich356352MNuméro CAS : 56-81-5
ImidazoleFisher Bioreagents  ;BP305-50Numéro CAS : 288-32-4
Chlorure de magnésium (MgCl2)Fisher Bioreagents  ;BP214Numéro CAS : 7786-30-3, 7791-18-6
MéthylcelluloseSigma AldrichM0512Numéro CAS : 9004-67-5
15 centipoises
Lames de microscope Microscopie électronique simpleSciences/Gold Seal63710-05  ; 3"x1 », 1 mm
d’épaisseur EauMilliporeCUFBI001Eau ultrapure
Novec-7500 Fluide technique3M7100134816Alternative à la solution prémélangée
Chlorure de potassium (KCl)Sigma AldrichP3911Numéro CAS : 7447-40-7
Phosphate de potassium (KPO4)Sigma AldrichP3786Numéro CAS : 7758-11-4
Poudre d’acétone pour muscle squelettique de lapinPel-Freez Biologicals41995-1Utilisé pour purifier l’actine (alternative à l’achat)
Stocker environ 30 mM dans le tampon d’actine G à -80 ° ; C
Azoture de sodiumSigma Aldrich71289Numéro CAS : 26626-22-8
Tétraméthylrhodamine-C6-maleimideAnaSpecAS-81445Numéro CAS : 174568-68-4 Utilisé pour purifier l’actine (alternative à l’achat)
Stocker environ 30 mM dans le tampon d’actine G à -80 ° ;C. Utilisé lors de l’étiquetage de l’actine (en alternative à l’achat)
Acide chlorhydrique Tris (Tris HCl)Sigma Aldrich648317Numéro CAS : 1185-53-1
Bain à ultrasonsEmerson Branson  ;
, Inc.CPX2800H

References

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

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Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

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