Une tâche de motricité fine pour étudier la cinématique articulaire dans un modèle préclinique de maladie neurodégénérative

Résumé

La présente étude décrit un test de comportement moteur fin pour examiner les déficits moteurs dans des modèles de rongeurs, y compris le rat TgF344-AD, à l’aide de l’apprentissage automatique.

Résumé

La dysfonction motrice est une composante essentielle, mais souvent sous-estimée, des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer (MA) et les démences associées. De nouvelles recherches ont montré que les tâches impliquant la motricité fine, la capacité visuospatiale et la fonction exécutive chez l’homme peuvent avoir un potentiel dans la détection précoce des maladies. Cependant, on sait peu de choses sur les mécanismes exacts par lesquels ces tâches prédisent le déclin cognitif et fonctionnel associé à la MA. Dans la méthode actuelle, une tâche de motricité fine, Kinematic Motor Ability Task (KINEMAT), a été créée pour examiner les changements dans la capacité motrice au cours de la progression de la maladie dans des modèles précliniques de la MA par rapport à d’autres maladies neurodégénératives et au vieillissement normal à l’aide d’un logiciel d’apprentissage automatique gratuit et open source. Ici, la preuve de concept a été établie avec la conception, les tests et la mise en œuvre de la tâche de motricité fine dans une étude pilote de rats Fisher 344 CDF avec et sans déficiences motrices induites par l’harmaline. Une validation supplémentaire, avec un modèle de rat de la maladie d’Alzheimer (TgF344-AD), a démontré la faisabilité du modèle et la sensibilité à la tâche. Avec plus ou moins de difficulté, des rats ont été entraînés à passer par une petite fente à l’avant de la chambre pour récupérer une pastille de sucre dans l’un des trois bols. La récupération des granulés a été notée à l’aide de l’une des trois classifications suivantes : succès (attraper et manger avec succès la pastille de sucre), chute (attraper mais laisser tomber la friandise lors de la saisie) ou échec (portée dans laquelle aucune pastille n’est obtenue, ou les granules sont projetées hors du bol en tentant de saisir). Des différences significatives dans les capacités motrices ont été observées entre les rats témoins et les rats traités à l’Harmaline, démontrées par une réduction des portées totales et une variabilité accrue de la pose des pattes. Les rats TgF344-AD ont également montré une réduction des portées totales, ainsi que des succès réduits dans tous les bols. En validant cette tâche en tant que tâche de motricité fine chez les rongeurs, il a le potentiel d’étudier le vieillissement normal et les modèles précliniques de maladies neurodégénératives, y compris la MA, à mesure que la pathologie et les symptômes apparaissent au fil du temps.

Introduction

Il a été démontré que la fonction motrice est altérée chez les personnes atteintes de démence due à la maladie d’Alzheimer (MA) ou à d’autres sous-types (par exemple, la démence à corps de Lewy). La force de préhension et la vitesse de marche permettent de distinguer les personnes âgées atteintes de troubles cognitifs^et celles qui ne le sont ^pas1,2, mais ne peuvent pas nécessairement faire la différence entre les différents sous-types de démences (c’est-à-dire à faible spécificité)^1,2. Ainsi, il reste nécessaire de disposer de nouveaux outils de diagnostic de la démence précoce, éventuellement associés à l’apprentissage automatique, pour évaluer des modèles complexes et des relations entre le comportement et l’état de la maladie ^3,4. Les modèles animaux sont précieux pour étudier la progression des maladies neurodégénératives afin d’offrir des informations sur l’apparition précoce de la maladie, les corrélats comportementaux et l’intégration de l’apprentissage automatique dans les pipelines d’analyse pour distinguer la gravité de la présentation ^5,6,7.

De nouvelles méthodes comportementales chez l’homme ont identifié des tâches qui impliquent la motricité fine ainsi que le traitement cognitif, comme la capacité visuospatiale et la fonction exécutive ^8,9,10. Par exemple, une tâche fonctionnelle du membre supérieur peut suivre les schémas de neurodégénérescence et peut distinguer les troubles cognitifs légers (TCL) de la MA. Dans cette tâche, les humains déplacent des haricots rouges crus (deux à la fois) d’une tasse centrale à une tasse cible à l’aide d’une cuillère. La phase de la tâche dans laquelle les haricots sont acquis avec la cuillère montre des associations plus fortes avec la cognition (en particulier, la mémoire visuospatiale) que la phase dans laquelle les haricots sont transportés vers la tasse cible^11,12. Lorsque la cuillère entre dans la tasse, elle peut perturber les grains dans la tasse, ce qui signifie que les mouvements du participant peuvent rendre la tâche plus difficile. De plus, à mesure que l’essai progresse et que le nombre de haricots dans la tasse d’habitation diminue, la tâche devient plus difficile (c’est-à-dire que le temps d’acquisition des haricots avec la cuillère augmente)¹³. Il a été démontré que cette tâche est corrélée à une pathologie spécifique à la MA (amyloïde)^9,14 et à une neurodégénérescence (atrophie de l’hippocampe)^10,15, ce qui suggère que sa performance peut dépendre des circuits neuronaux et des processus comportementaux qui sont affectés tôt dans le processus de la maladie. Il est connu que l’initiation, la planification, l’exécution et la correction du mouvement sont contrôlées par un réseau diversifié traversant le cerveau, y compris le cortex moteur, avec des corps cellulaires des motoneurones supérieurs situés dans le cortex cérébral synapsant sur les motoneurones inférieurs de la moelle épinière¹⁶. Ces motoneurones inférieurs communiquent directement avec les muscles pour contrôler le mouvement à la jonction neuromusculaire. Les voies ascendantes transportent des informations sensorielles de la périphérie à la moelle épinière, tandis que les voies descendantes dans le cerveau communiquent des informations directionnelles sur comment et où revenir aux muscles^17,18. Comprendre comment ces voies sont sélectivement affectées par la pathologie de la MA est essentiel pour comprendre la progression de la maladie, d’autant plus que des modèles animaux génétiques, y compris la souris 3xTg-AD et le rat TgF344-AD, ont déjà été utilisés pour étudier l’impact des gènes de la MA sur la locomotion, la coordination et d’autres déficiences motrices 19,20,21 . En règle générale, ces tâches se concentrent sur les déficiences motrices globales liées aux mouvements du corps entier, mais les déficits moteurs chez l’homme sont beaucoup plus variables, ce qui peut être difficile à identifier chez les rongeurs²². De nouvelles tâches sont donc nécessaires pour combler le fossé entre les modèles humains et animaux afin de capturer cette variabilité.

Une région du cerveau qui est couramment impliquée dans les déficiences motrices et les tremblements est le cervelet²³. Le cervelet est un régulateur important des mouvements précis et coordonnés et agit comme un processeur d’informations sensorielles pour fournir une rétroaction par des voies descendantes afin de corriger et d’adapter ce mouvement volontaire^24,25. Il est important de noter que l’atrophie cérébelleuse a été reconnue chez les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer, mais, contrairement à d’autres régions comme l’hippocampe, l’augmentation des dépôts amyloïdes dans le cervelet n’est pas corrélée à l’augmentation de l’atrophie²⁶. Bien que la progression de la pathologie de la MA soit différente dans le cervelet, il existe des connexions bidirectionnelles multi-synaptiques entre le cervelet et l’hippocampe qui sont probablement perturbées en^{27, 28 et 29}. Notamment, il existe des connexions fonctionnelles entre le cervelet et l’hippocampe, car des déficits de mémoire ont été documentés pour se produire après la résection d’une tumeur cérébelleuse 30,31,32,33,34,35,36,37. Chez les rongeurs, les cellules de l’hippocampe sont perturbées par une perturbation cérébelleuse³⁸. Ces déficits superposés de la mémoire, de la sociabilité et du contrôle moteur soulignent l’importance de découvrir les changements précoces potentiels dans les voies motrices qui se produisent avant le déclin cognitif 30,31,38,39. Avec la mise en œuvre de tâches de motricité fine dans la recherche précoce sur la MA, nous pourrions commencer à remodeler la compréhension traditionnelle de la MA comme étant simplement un trouble cognitif et réorienter les efforts de diagnostic vers les changements moteurs précoces qui peuvent prédire la progression de la maladie et peuvent être plus facilement distinguables entre les personnes vieillissantes cognitivement déficientes et non altérées.

Pour comprendre comment le comportement de la motricité fine peut être indicatif de changements dans la structure du cerveau, une version rongeur de la tâche humaine décrite ci-dessus a été créée et testée. Cette tâche de rongeur a été nommée KINEMAT (KINEmatic Motor Ability Task), et elle s’écarte des tâches d’atteinte précédentes qui nécessitent la récupération d’une seule pastille d’un piédestal ou d’un escalier et de la notation plus simpliste résultant d’un placement cohérent des pastilles à toutes les étapes de la tâche 40,41,42,43,44,45,46^{, 47 et 48}. Cette tâche d’atteinte de la motricité fine comprend de nouvelles méthodes de notation, des bols avec diverses difficultés et des caractéristiques d’auto-perturbation pour imiter l’homologue humain, avec le mouvement des billes et les ajustements ultérieurs de la stratégie des participants au cœur de la conception. Cette tâche utilise les outils d’apprentissage automatique, Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) et keypoint-MoSeq^49,50, permettant une mesure impartiale et quantitative de la motricité fine et des comportements d’atteinte. Alors que d’autres modèles informatiques notables ont été développés pour des tâches d’atteinte habiles chez les rongeurs ^44,45,51, keypoint-MoSeq élimine le bruit pour permettre une quantification précise du mouvement et des poses de préhension⁵⁰. La performance des tâches et la stratégie d’apprentissage moteur ont été reconstruites à l’aide d’une caméra de vision industrielle haute performance chez des rats typiques et des rats à moteur perturbé à l’aide d’Harmaline⁵². L’harmaline hyperactive le noyau olivaire inférieur et perturbe la fonction cérébelleuse par le biais des fibres grimpantes glutamatergiques^53,54. De plus, la motricité fine a été examinée chez un sous-ensemble de rats TgF344-AD. Ainsi, on s’attendait à ce que la tâche de motricité fine trouve des déficiences mesurables chez les rats traités à l’harmaline et TgF344-AD par rapport à leurs homologues typiques en tant que preuve de concept. Ce protocole décrit la construction de la tâche de motricité fine, l’entraînement et le test des animaux, et la quantification du comportement d’atteinte à l’aide de SLEAP et keypoint-MoSeq.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université d’État de l’Arizona.

1. Conception et construction de la chambre

1. Préparez les panneaux acryliques transparents. Les schémas de la boîte se trouvent à https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask. Découpez des panneaux acryliques transparents aux dimensions suivantes (tous les panneaux ont une épaisseur de 1 cm) :
   1. Découpez deux panneaux latéraux : 26 cm × 22 cm.
   2. Découper un panneau supérieur : 27 cm × 12 cm.
   3. Découpez le premier panneau inférieur : 26 cm x 10 cm
   4. Découpez le deuxième panneau inférieur : 26 cm x 11 cm
   5. Coupe d’un panneau avant : 20 cm × 11 cm.
   6. Découper un panneau arrière : 20 cm x 12 cm
   7. Découper une fente pour le panneau avant (140 mm x 12 mm). Positionnez la fente au centre, avec son bord inférieur aligné avec le bas du panneau.
   8. Découper une rainure intérieure : 1 cm. Sur les bords intérieurs des panneaux latéraux, créez une encoche ou une rainure pour permettre au panneau avant de glisser en toute sécurité.
      REMARQUE : Si la fonction de glissement n’est pas requise, le panneau avant peut être collé de manière permanente pour simplifier la construction.
   9. Percez des trous régulièrement espacés (5 mm de diamètre) dans le deuxième panneau inférieur pour permettre aux granules de tomber à travers en cas de chute. Espacez les trous de 1 cm selon un quadrillage.
2. Assemblez la chambre à l’aide d’un adhésif (Figure 1A).
   REMARQUE : Utilisez un adhésif puissant et transparent conçu explicitement pour les matériaux acryliques.
   1. Panneaux latéraux : Appliquez une ligne continue d’adhésif le long des bords du panneau inférieur. Positionnez les panneaux latéraux verticalement et appuyez fermement. Laissez l’adhésif durcir conformément aux instructions de fabrication.
   2. Panneau arrière : Appliquez de l’adhésif sur les bords arrière des panneaux latéraux et inférieurs. Positionnez le panneau arrière et appuyez dessus pour le mettre en place.
   3. Panneau supérieur : Appliquez de l’adhésif sur les bords supérieurs des panneaux latéraux et arrière. Positionnez le panneau supérieur et appuyez fermement.
   4. Panneau avant : faites glisser délicatement le panneau avant dans les rainures des panneaux latéraux, en assurant un ajustement parfait mais en douceur, ou appliquez de l’adhésif le long des bords du panneau avant et fixez-le aux panneaux latéraux, supérieur et inférieur.
      1. Testez le mouvement du panneau et confirmez qu’il s’aligne précisément avec le reste de la chambre.
3. Éclairage de configuration
   1. Placez la lumière infrarouge (IR) à l’extrémité opposée de la chambre d’essai, en pointant vers la chambre. Placez une feuille de papier de construction blanc sur le dessus de la chambre pour refléter la lumière vers le bas.
      REMARQUE : L’éclairage est essentiel pour un suivi correct, et tous les enregistrements doivent être effectués sous une lumière IR dans une pièce sombre.
4. Préparez le bol d’entraînement.
   1. Fabriquez le bol d’entraînement avec un rayon de 31 mm et une extension de 32 mm à l’aide d’une imprimante 3D. Fichier STL disponible sur https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask (Figure 1B : en haut)
   2. Fixez le bol d’entraînement au fond de la chambre directement devant la fente. Positionnez le bol de manière à ce que son bord supérieur soit à peu près au-dessus du niveau des yeux du rat dans la chambre, à l’aide d’un support de soutien, tel qu’un bloc de bois.
5. Préparez les bols d’essai (Figure 1B : milieu et bas).
   1. Imprimez les bols à l’aide des fichiers STL fournis. Deux modèles de bols distincts sont proposés : « Plain-Less » et « Plinko ». (https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask)
      1. Inspectez la précision dimensionnelle et la durabilité (dimensions : 50 mm de profondeur x 40 mm de largeur).

2. Matériel informatique et appareil photo

1. Utilisez un trépied pour monter l’appareil photo en toute sécurité.
2. Positionnez la caméra à environ 15-20 cm du panneau avant de la chambre.
   1. Ajustez la hauteur et l’angle du trépied pour que l’appareil photo capture une vue isométrique à 45° de la fente et du bol.
      REMARQUE : Assurez-vous que le champ de vision de la caméra englobe la patte de rat et la portée complète, la fente et le bol d’entraînement ou de test. Testez différents angles et distances si nécessaire pour obtenir une visibilité optimale.
3. Téléchargez le logiciel pour l’associer à la caméra pour les enregistrements comportementaux (https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk) et ouvrez le logiciel pour utiliser la caméra pour enregistrer le comportement.
   1. Utilisez les paramètres suivants de l’appareil photo : mode d’acquisition : continu, fréquence d’images : 216 Hz, mode d’exposition : temporisé, exposition automatique : désactivée, temps d’exposition : 4430 μs, gain automatique : désactivé, gain : 16,85 dB, gamma : 0,8.
   2. Les paramètres d’enregistrement sont les suivants : type de fichier H264, débit binaire de 5 millions (5 000 000).
   3. Pour enregistrer pendant 10 min, entrez 130 000 images et utilisez le mode de diffusion en continu pour sauvegarder.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser une machine dédiée avec un minimum de 16 Go de RAM et un disque dur SSD interne de 1 To pour le stockage des données.

Figure 1 : Schéma de la tâche de motricité fine. (A) Représentation caricaturale de la tâche de motricité fine par laquelle un rat passe par une fente pour obtenir une pastille de sucre. Les portées sont enregistrées pour l’analyse de l’apprentissage automatique. Trois bols distincts sont utilisés : un bol d’entraînement (en bas à gauche), un bol Plain/Less (en bas au milieu) et le bol Plinko (en bas à droite) avec des obstructions entourées en rouge. (B) Schémas de chaque conception de bol, y compris le bol d’entraînement (en haut), le bol Plain/Less (au milieu) et le bol Plinko (en bas). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Préparation des animaux

1. Hébergez (au minimum) des rats Fisher 344 CDF (mâles et femelles, âgés de >3 mois) selon un cycle lumière/obscurité inversé pour permettre les tests lorsque les animaux sont les plus actifs.
2. Pesez tous les rongeurs 1 semaine avant le début de l’accoutumance et fournissez ~30 g de nourriture pour un rongeur pesant plus de 300 g et ~15 g pour un rongeur 100-300 g pour maintenir les animaux à 90 % du poids corporel.
   1. Pesez quotidiennement les rats et ajustez la nourriture en conséquence, réduisant la quantité de nourriture fournie de 1 à 2 g par jour jusqu’à ce que le rongeur atteigne 90 % de son poids corporel. La manipulation quotidienne aidera également à habituer les animaux à l’expérimentateur.
   2. Tout au long de l’habituation et des tests, continuez cette procédure en ajustant les aliments de +/- 0,5 g lorsque le poids tombe en dessous ou dépasse le seuil.
   3. Pendant les essais, peser les animaux avant de commencer la tâche, puis leur fournir la nourriture allouée immédiatement après leur retour dans la cage une fois la tâche terminée.
      REMARQUE : Toute perte de poids soudaine (>15 %) sur 1 à 2 jours pourrait signaler un problème sous-jacent, et un vétérinaire doit être consulté.

4. Habituation (2 jours)

1. Allumez la lumière infrarouge, l’appareil photo et l’ordinateur.
2. Placez le bol d’entraînement avec des granulés au niveau de la fente d’ouverture, en veillant à ce que la pointe du bol s’étende légèrement dans l’appareil (environ 2 cm au départ).
3. Transférez les cages dans la salle d’essai et laissez les rats s’acclimater pendant 5 min.
4. Jour 1 : Ajoutez des rats logés en couple dans la chambre et laissez-les explorer pendant 20 min. Placez 3 à 5 granules de sucre dans la cage familiale après le test pour permettre aux rats de se familiariser avec les granulés.
   REMARQUE : La taille des granulés de 45 mg permet de récupérer un seul granulé.
5. Nettoyez la chambre avec une lingette désinfectante entre les rats. En fin de journée, vaporisez de l’éthanol pour désinfecter.
6. Jour 2 : Habituer les rongeurs individuellement à l’appareil en utilisant la même procédure (20 min). Si les rongeurs semblent craintifs ou évitent l’avant de l’appareil et le bol, continuez à vous habituer jusqu’à ce que ce comportement disparaisse. Continuez à donner des granulés comme friandises dans la cage domestique (3-5 granulés).
   1. Pour favoriser la familiarité et l’approche du bol, déplacez le tube allongé plus loin dans l’obturateur de l’appareil progressivement tout au long de l’habituation, en rapprochant la pointe de 0,5 cm à la fois du rongeur pour faciliter l’atteinte.
      REMARQUE : L’habituation, les tests et la formation doivent tous être effectués au même endroit sous un éclairage rouge afin d’éliminer l’impact d’un nouvel environnement.

5. Mise en forme (10 jours)

1. Allumez la lumière infrarouge, l’appareil photo et l’ordinateur.
2. Transférez les cages dans la pièce et laissez les rats s’acclimater pendant 5 min.
3. À l’aide du bol d’entraînement, fournissez 1 à 5 pastilles le long de l’extension, avec l’extension placée complètement à l’intérieur de l’appareil le premier jour. Dressez les animaux en séances de 10 minutes. L’enregistrement pendant le façonnage est facultatif.
   REMARQUE : Pour familiariser les rongeurs avec les granulés, il est important de fournir quelques granules de sucre dans l’appareil lui-même pour réduire l’aversion pour les granulés dans le bol. Les rongeurs mangeront probablement les granulés à l’intérieur de l’appareil parce qu’ils sont facilement disponibles et reconnaîtront ces granulés dans le bol. Il est important de les habituer à faire face à la bonne direction de l’appareil et de s’habituer à toucher le bol.
4. Les jours suivants d’entraînement, commencez à rétracter l’extension du bol de l’appareil. Cela obligera les rongeurs à s’approcher de l’ouverture de l’appareil à l’avant et encouragera l’interaction avec l’extension juste à l’extérieur de l’appareil.
   1. La conception permet un placement spécifique des granulés. Par exemple, placez les granulés à l’extrémité du bol le plus proche du rongeur et éloignez-vous progressivement pour encourager le rongeur à sortir de l’appareil.
5. Au fur et à mesure que les rongeurs deviennent plus à l’aise pour prendre des granulés sur le bord des extensions, même si ce n’est que par la bouche, commencez à introduire des granulés via la pince à épiler pour encourager le comportement d’étirement.
   1. Tenez une pastille dans la pince à épiler juste à l’extérieur de l’appareil, permettant aux rongeurs de simplement toucher la pince à épiler. Récompensez immédiatement ce comportement pour l’encourager à aller plus loin.
   2. Au fur et à mesure que les rongeurs deviennent plus à l’aise pour toucher la pince à épiler, permettez-leur de sortir un peu plus de l’appareil pour toucher ou saisir la pastille en tenant la pince à épiler un peu plus loin de l’ouverture de l’appareil.
      REMARQUE : Prenez des notes sur tous les comportements des animaux, en particulier si les animaux ont peur du bol ou ne l’atteignent pas. Ces animaux peuvent avoir besoin de jours de façonnage supplémentaires.
6. Une fois que les rongeurs atteignent continuellement et indépendamment pendant au moins 3 jours (figure 2A), passez au bol Plain jusqu’à ce que le comportement d’atteinte soit établi (portée continue pendant 3 jours avec au moins 10 portées indépendantes par jour).
   1. Lorsque vous introduisez les rongeurs dans le bol Plain, assurez-vous que le bol est rempli autant que possible de granulés afin que les rongeurs puissent visualiser les granulés sur le côté du bol.
      REMARQUE : Il peut être nécessaire d’encourager les portées à l’aide d’une pince à épiler à ce stade.
7. Nettoyez la chambre avec une lingette désinfectante entre les rats. En fin de journée, vaporisez de l’éthanol pour désinfecter.

6. Préparez-vous pour les tests :

1. Les tests sont effectués sur une période de 9 jours (figure 2A), chaque rongeur effectuant 3 essais par bol, chaque essai de 10 minutes se déroulant sur des jours consécutifs.
   REMARQUE : Il est préférable d’effectuer les tests le matin.
2. Chaque jour de test, pesez les rats. Une fois terminé, les rats sont laissés dans des cages domestiques pendant 30 à 60 minutes avant le test, car la pesée peut induire du stress et inhiber le comportement d’atteinte.
3. Allumez l’ordinateur et installez le bol. Branchez l’appareil photo et allumez-le. Ouvrez le logiciel d’enregistrement et ajustez les paramètres de l’appareil photo comme indiqué dans la section 2 du protocole.
   REMARQUE : Il est recommandé d’enregistrer au moins 200 images par seconde (fps) pour capturer tous les mouvements de la patte.
4. Alignez le bol dans le cadre de l’appareil photo et visualisez-le dans le logiciel d’enregistrement en appuyant sur le bouton de lecture. Placez le bol au ras de l’appareil et de la caméra à un angle de 45° par rapport au côté du bol.
   1. Déplacez l’appareil photo pour capturer l’atteinte directement de face afin d’étudier le mouvement individuel des doigts et de la paume, ainsi que le mouvement lié à la hauteur de la paume au-dessus du bol pendant l’étirement.
   2. Placez l’appareil photo directement perpendiculairement au bol pour capturer les mouvements des bras et des mains vers et depuis le bol, mais pas le placement des doigts ou les détails sur le comportement de préhension.
      REMARQUE : Bien qu’un angle de 45° soit recommandé pour capturer le mouvement le long des plans x, y et z, d’autres configurations peuvent capturer plus facilement des informations pour l’étude souhaitée.

7. Tests (9 jours)

1. Placez les rats dans la pièce pour qu’ils s’habituent pendant 1 h.
2. Placez le premier bol sur la plate-forme du bol, en le fixant avec de la cire dentaire. Assurez-vous que l’avant du bol est aligné et centré avec l’ouverture de l’appareil.
3. Nommez le fichier vidéo dans Spinview avec le numéro d’identification du rat, la date d’enregistrement et l’heure d’enregistrement.
4. Placez le rat dans l’appareil. Fermez le couvercle et placez le papier cartonné blanc sur le dessus pour dévier la lumière.
5. À ce stade, vérifiez l’angle de la caméra pour vous assurer que la scène appropriée est capturée et ajustez le bol s’il n’est pas centré.
6. Versez la bonne quantité de granulés dans le bol et appuyez sur Démarrer l’enregistrement.
   Jour 1-3 Bol nature : ~100 granulés
   Jour 4-6 Moins de bol : ~50 granulés
   Jour 7-9 Bol Plinko : ~50 granulés
7. Restez dans la pièce tout au long des tests pour surveiller en permanence le rat, prendre des notes sur les performances et le comportement d’atteindre, et ajouter des granulés si nécessaire pour maintenir la bonne quantité.
   1. Pour le bol ordinaire, assurez-vous que les rongeurs peuvent voir les granulés par-dessus le bord du bol et que les granulés peuvent toujours être obtenus (c’est-à-dire en remplissant le bol tout au long de l’essai à mesure que les granulés diminuent, les granulés sont stratifiés).
   2. Pour le bol Less : vérifiez que les granulés ne sont pas empilés les uns sur les autres et qu’il y a de la place entre les granulés, ce qui leur permet de se disperser lorsque le rat tente de les atteindre.
   3. Pour le bol Plinko : assurez-vous qu’il y a suffisamment de granulés pour être accessible entre les obstacles.
8. Remettez l’animal dans sa cage d’origine et fournissez-lui la nourriture allouée. Nettoyez la chambre avec une lingette désinfectante entre les rats.
9. En fin de journée, vaporisez de l’éthanol pour désinfecter toute la chambre afin de préparer le lendemain.
   REMARQUE : Si vous testez à la fois des rongeurs mâles et femelles, assurez-vous de contrebalancer les sexes avec des femelles et des mâles testés plus tôt le matin, et un mélange similaire testé plus tard. Maintenez l’ordre des testeurs tout au long de l’expérience.

Figure 2 : Entraînement et tests de rats effectuant la tâche de motricité fine. (A) Chronologie de l’expérience. Les rats ont été habitués à l’appareil pendant deux jours, puis ont subi des procédures de mise en forme pendant 10 jours. Les animaux ont été testés pour leur motricité fine dans les trois bols pendant trois jours chacun. Ensuite, des animaux ont été injectés avec de l’Harmaline et testés à nouveau sur chaque bol pendant trois jours. (B) Les rats (n = 6) ont subi deux bols différents (bol d’entraînement et Plain) pendant les procédures de façonnage, et le type de bol a été changé le jour 5 pour améliorer les portées. Il y a eu une augmentation significative du façonnage sur 10 jours pour atteindre les critères (F(9, 45) = 13,5, p < 0,001). La barre grise désigne l’interrupteur entre le bol d’entraînement à tube allongé d’origine et le bol d’entraînement à tube allongé actuel. (C) Pour l’essai des trois bols, il y avait une différence significative dans les portées totales au cours des 9 jours d’essai (F(8, 32) = 3,74, p = 0,003). Remarque : Le rat 2 a été retiré après la mise en forme. Le bol Plinko a entraîné des différences significatives entre le bol Less (p = 0,001) et le bol Plain (p = 0,027). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

8. Modélisation de la perturbation de la motricité fine à l’aide d’Harmaline

REMARQUE : Pour identifier les effets des troubles moteurs sur la motricité fine et les performances dans la tâche de motricité fine, des rats ont reçu une injection d’Harmaline (10 mg / kg), un alcaloïde β-carboline qui est un inhibiteur réversible de la monoamine oxydase-A et cible l’olive inférieure 52,55,56,57. L’harmaline chez les modèles de rongeurs affecte la posture et l’équilibre, limite la coordination motrice fine et induit une perturbation motrice dans les membres supérieurs.

1. Pesez les rats pour calculer la dose appropriée d’Harmaline.
2. Laissez les rats s’habituer à la salle d’essai pendant 1 h.
3. Allumez l’ordinateur et installez le bol. Branchez l’appareil photo et allumez-le. Ouvrez le logiciel d’enregistrement et ajustez les paramètres de l’appareil photo comme indiqué dans la section 2 du protocole.
4. Injecter chez les rongeurs de l’Harmaline (10 mg/kg, i.p.).
5. Après 15 min, versez les granulés dans le bol approprié et commencez à enregistrer. Testez le rat sur chaque bol pendant 3 jours.
   Jour 1 Bol nature : ~100 granulés
   Jour 2 Moins de bol : ~50 granulés
   Jour 3 Bol Plinko : ~50 granulés
   REMARQUE : Surveillez le site d’injection pour détecter des anomalies, y compris une irritation cutanée, des comportements douloureux, une ataxie, une hypothermie et des changements posturaux jusqu’à 3 heures après l’injection. Après les fenêtres de 3 heures, continuez à surveiller tout changement de comportement, y compris les latences pour manger ou boire, ou tout tremblement résiduel.

9. Analyse vidéo à l’aide de l’apprentissage automatique

REMARQUE : À la suite de la collecte de données et de l’enregistrement vidéo, les portées ont été comptées à la main et notées comme suit : Succès (récupérer et consommer la pastille), Lâcher (récupérer la pastille mais laisser tomber la pastille avant de la consommer), Échec (impossible de récupérer la pastille). Ces données notées à la main ont été utilisées comme données de vérité terrain pour l’analyse de l’apprentissage automatique.

1. À l’aide de code Python personnalisé à https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask, des comparaisons ont été effectuées entre les animaux traités à l’Harmaline et à l’Harmaline afin d’identifier les changements dans la performance de la portée (figure 3, figure 4, figure 5 et figure 6).
2. Pour analyser la cinématique articulaire du comportement d’atteinte, y compris la trajectoire de portée, la conformation et la position de la patte, et les changements de stratégie de portée entre les différents types de bols, utilisez le logiciel d’apprentissage automatique gratuit et open source Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) (voir https://sleap.ai/ pour une explication plus détaillée et un guide étape par étape pour utiliser le programme open source⁴⁹).
   REMARQUE : SLEAP⁴⁹ peut être téléchargé à l’adresse https://github.com/talmolab/sleap.
3. Ouvrez un nouveau projet et ajoutez 3 vidéos de la tâche d’atteindre.
4. Créez un squelette composé de 15 nœuds : 1 bras, 1 poignet, 1 centre de la paume, 4 base, 4 articulations et 4 nœuds du bout des doigts (téléchargez le squelette sur https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask).
5. Ajoutez des bords entre les nœuds de sorte que le haut du bras se connecte au poignet, puis au centre de la paume. À partir du centre de la paume, connectez la base, l’articulation et le bout des doigts de sorte que le centre de la paume soit toujours le nœud de départ (Figure 7A).
6. Étiquetez un minimum de 50 images avant de vous entraîner à la course. Ici, on peut entraîner un nouveau modèle ou utiliser les modèles pour centered et centroid sur le github : https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask.
7. Une fois le modèle entraîné, ouvrez une nouvelle vidéo et exécutez l’inférence : trackin.match : greedy, n_instances :1, tracking.clean_instance_count : 1, tracking.target_instance_count : 1, tracking.pre_cull_to_target : 1.
   REMARQUE : L’inférence peut être exécutée en tant que script bash sur un cluster local. Les vidéos suivies peuvent nécessiter une relecture (voir https://sleap.ai/ pour les instructions de relecture).
8. Pour analyser plus en détail les nœuds et comprendre les différences entre les groupes dans la cinématique conjointe, utilisez le keypoint-MoSeq⁵⁰, gratuit et open-source (voir https://github.com/dattalab/keypoint-moseq pour plus de détails sur le téléchargement et les instructions d’utilisation).
9. Créez des syllabes discrètes de comportement à l’aide de keypoint-MoSeq⁵⁰ (Figure 7B). Effectuer une analyse supplémentaire pour cartographier la fréquence de transition, la probabilité et les changements dans la fréquence des transitions entre l’harmaline et les conditions de base par bol (figures 7C, D). Voir https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask pour le code d’analyse.

Figure 3 : Changements dans l’atteinte des bols et le traitement. (A) Pour les tests de base (n = 5), dans les 3 bols, il y avait une différence significative dans les tronçons totaux (H(df) = 8,48, p = 0,014, Kruskal-Wallis), avec plus de tronçons avec le type de bol Plinko (p = 0,011, test de Dunn post-hoc avec correction de Bonferroni). (B) La perturbation par l’harmaline (n = 5) n’a pas entraîné de différences entre les types de bols. Les erreurs sont signalées sous la forme S.E.M. *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Comparaison des performances entre les conditions et entre les types de bols. (A) Il y avait une différence significative entre le bol (F(2) = 5,78 et p = 0,007) et les résultats (F(2) = 3,92, p = 0,029) lors des tests de base. Les tentatives de portée augmentaient à mesure que le type de bol devenait plus difficile, bien que les portées aient été réduites par rapport à la ligne de base dans tous les bols en condition harmaline. (B) Aucune différence n’a été observée chez les rats traités à l’Harmaline pour le comptage des portées dans les bols. (C) Il y avait une différence significative entre les résultats (F(2) = 2,07, p < 0,001) lors des tests de référence lorsqu’ils étaient analysés en fonction du rendement. (D) Aucune différence n’a été observée chez les rats traités à l’Harmaline pour les performances au bol ou au résultat. Les erreurs sont signalées comme S.E.M. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Comparaison des conditions de référence et des conditions Harmaline. (A) Il n’y avait aucune différence dans le succès de performance entre les conditions. (B) Pour le comptage des échecs, il y avait une différence significative entre les conditions de base et les conditions d’Harmaline (H(df) = 4,85, p = 0,028, Kruskal-Wallis) avec un effet significatif trouvé dans la condition d’Harmaline (p = 0,028, test de Dunn post-hoc avec correction de Bonferroni). Les erreurs sont signalées comme S.E.M. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Taux d’apprentissage et d’atteinte. (A) Les animaux harmalines avaient un taux d’apprentissage perturbé par rapport à la condition de base (t-stat = 2,833, p = 0,022). (B) Pour le nombre total de portées par minute, il y avait une interaction significative entre le bol (moins) et l’état (harmaline) (F(1,5) = 9,83, p = 0,002, modèle linéaire mixte) et le bol (plinko) et l’état (harmaline) (F(1,5) = 22,67, p < 0,001, modèle linéaire mixte). Harmaline a réduit le nombre total de portées par minute sur tous les types de bols (Less : p = 0,01, Plinko : p < 0,001) par rapport à la ligne de base. Les erreurs sont signalées sous la forme S.E.M. *p < 0,05, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : L’apprentissage automatique identifie des poses et une stratégie de tâche uniques. (A) Emplacements des nœuds sur la patte du rat étiquetés à l’aide de SLEAP. (B) Exemples de syllabes identifiées par keypoint-MoSeq lors de l’atteinte. (C) Matrice des fréquences de transition de bigramme entre les syllabes consécutives. Les probabilités de transition sont normalisées par le nombre total de bigrammes. (D) Un graphique de transition comparant les différences de transition de syllabe entre Harmaline et Baseline. Les nœuds du graphique représentent les syllabes, et les bords indiquent les transitions entre elles. Les bords plus proéminents indiquent les transitions de syllabes avec des fréquences plus élevées. Les connexions rouges indiquent une transition régulée à la hausse, tandis qu’une connexion bleue indique une transition régulée à la baisse chez les animaux traités à l’Harmaline. Les cercles rouges indiquent une utilisation régulée à la hausse, tandis qu’un cercle bleu indique une utilisation régulée à la baisse de la syllabe indiquée chez les animaux traités à l’harmaline. Les paires de syllabes avec des fréquences inférieures à 0,005 ont été exclues. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Après avoir atteint une restriction alimentaire de 90 % de leur poids corporel, les rats ont été habitués à la chambre pendant 2 jours, puis ont subi des procédures de mise en forme pendant 1 à 2 semaines. Le nombre de tronçons réussis, abandonnés et échoués a été noté par un observateur formé aveugle à chaque condition. Pendant 9 jours (ligne de base), les rats ont été testés pour leur motricité fine sur 3 configurations de bols différentes (Plain, Less et Plinko). Ensuite, les mêmes ra...

Discussion

Les tâches d’atteinte pour les rongeurs sont généralement limitées à des granules simples et n’incluent pas d’obstructions ou de caractéristiques d’auto-perturbation, qui sont des difficultés courantes pour les patients atteints de pathologie neurodégénérative. La méthode présentée ici, qui utilise à la fois une tâche d’atteinte de granulés réinventée et l’apprentissage automatique, peut détecter à la fois la coordination et la stratégie grâce à l’analyse des caractéristiques de pose et ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériau d’impression 3D	Amazon (Ouverture)	B07PGY2JP1	Filament PLA 1,75 mm Filament d’imprimante 3D PLA, précision dimensionnelle +/- 0,03 mm
Caméra	Edmond Optics	BFS-U3-13Y3M-C	1,3 MP, Mono, 170 FPS, ON Semi PYTHON 1300 x2
Câbles de caméra	Edmond Optics	ACC-01-2300	USB 3.1, 3 m, câble de type A vers Micro-B (verrouillage)
Objectif de l’appareil photo	Thor Labs	MVL5WA	Objectif à vision automatique format 4,5 mm EFL, F/1.4, format 1/2"
Connexion caméra au trépied	Edmond Optics	88-210	Connexion de l’appareil photo au trépied
Lingettes nettoyantes	Amazone (Sani-Cloth)	B00KMZ7KMO	Nettoyant désinfectant AF3 Conserve Doux, Odeur Douce 160 Ct P13872
Ordinateur	Dell	Précision	Intel Core i7-13700 @ 2,1 GHz, NVIDIA T1000 8 Go, RAM 16 Go
Lumière infrarouge	Amazone (Serlium)	B0BJFDBT44	Caméra Lumière IR 48 LED Lumières Lumières Infrarouges étanches Vision nocturne infrarouge Lumière pour la sécurité Caméra CCTV   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
Colle pour panneaux	Amazon (Sdintar)	B0B1DLRPNZ	Colle à verre
Plexiglas	Amazon (TOOLINHAND  ; États-Unis)	B0BRJ1L8TR	12 et plus de fois ; Feuilles d’acrylique/plexiglas coulées transparentes de 12 » - transparentes 1/8 » Épaisse (3 mm) et non bsp ;
Python	; Fondation Python Software	Python 3.7
Spinview	Teledyne Technologies	Version 3.1.0.79  ;
Granulés de sucre (45 mg)	Bioserv	F0023	45 mg, non aromatisé 50 000/boîte ; Ingrédients : Saccharose, Dextrose, Stéarate de magnésium, Silicate de calcium, Huile minérale
Trépied	Amazon (YOUYI)	B086PYJF9D	Trépied de webcam flexible Amazon pour bureau flexible
Pince à épiler	Outils scientifiques finement	11064-07	Pinces d’iris
Cire	Amazon (Orthomécanique)	B00FKDC0UU	Orthowax authentique & nbsp ;