Fractionnement innovant du tissu adipeux pour transformer la graisse en composants spécialisés

Résumé

Ici, nous présentons un protocole qui peut transformer le tissu adipeux autologue en diverses substances constitutives adipeuses avec différentes propriétés et fonctions physico-chimiques.

Résumé

La greffe de tissu adipeux autologue traditionnelle est couramment utilisée pour l’augmentation du volume et la régénération des tissus. Cependant, les propriétés physiques et biologiques uniformes des greffes de graisse conduisent souvent à des performances sous-optimales dans divers scénarios de patients et à des exigences multiformes. En s’appuyant sur les bases de la transplantation de graisse autologues, nous introduisons une approche pionnière appelée transplantation autologue de composants adipeux. Ce concept innovant intègre un protocole méticuleusement conçu visant à convertir le tissu adipeux autologue en un large éventail de composants adipeux, chacun caractérisé par des propriétés physicochimiques uniques adaptées pour répondre à des applications spécifiques dans des contextes cliniques variés. Grâce à une série de méthodes physiques, le tissu adipeux peut être transformé en un complexe de matrice adipeuse (AMC) fournissant un support rigide suffisant, en graisse à haute densité (HDF) pour un remplissage supplémentaire, en gel de fraction vasculaire stromale (SVF) pour des injections petites et/ou précises, et en fragment de collagène adipeux (ACF) pour les rides fines et/ou les besoins de rajeunissement du visage. Ces composants adipeux distincts possèdent des caractéristiques inhérentes qui se prêtent à des stratégies de transplantation précises et ciblées, répondant aux exigences nuancées des besoins individuels des patients. Le nouveau protocole de fractionnement du tissu adipeux montre un grand potentiel pour révolutionner la greffe de tissu adipeux. Il offre une nouvelle perspective et une nouvelle méthodologie pour une transplantation plus raffinée et adaptée.

Introduction

La greffe de tissu adipeux autologue est une technique largement utilisée pour l’amélioration volumétrique et la régénération des tissus, stimulée par les progrès de la préparation du site donneur, de l’extraction de la graisse, du traitement et de l’implantation 1,2,3,4. Cependant, les propriétés physiques et biologiques uniformes des greffes de graisse traditionnelles limitent souvent leur efficacité à répondre à divers besoins cliniques⁵. Pour surmonter ces limitations, notre équipe de recherche a mis au point un protocole innovant de fractionnement du tissu adipeux, transformant la graisse autologue en composants spécialisés dotés de propriétés et de fonctions physicochimiques distinctes.

L’objectif principal du protocole est de fractionner le tissu adipeux autologue en composants spécialisés - complexe de matrice adipeuse (AMC), gel de fraction vasculaire stromale (SVF) et fragment de collagène adipeux (ACF), chacun conçu pour relever des défis cliniques spécifiques. En fournissant des composants dotés de propriétés uniques, telles qu’une rigidité accrue, une densité cellulaire élevée et des formulations riches en collagène, le protocole permet des stratégies de transplantation précises et ciblées 6,7,8,9,10,11.

La greffe de graisse traditionnelle, bien qu’efficace pour l’augmentation du volume, ne parvient souvent pas à répondre aux exigences nuancées de scénarios cliniques complexes. Son absorption imprévisible des graisses conduit à une restauration instable du volume. De plus, en raison des propriétés physiques et biologiques uniformes des greffes de graisse traditionnelles, elles ne peuvent pas fournir un remplissage ciblé pour les zones nécessitant une transplantation spécifique, telles que le soutien structurel, la réalisation d’injections précises sur de petites surfaces et la réalisation d’une stimulation ciblée du collagène. Ces problèmes nécessitent souvent plusieurs interventions chirurgicales, ce qui augmente la douleur et le fardeau financier des patients ^1,2,5. Ce protocole de fractionnement répond à ces limitations en enrichissant spécifiquement le tissu adipeux avec un contenu de valeur particulière provenant du tissu adipeux traditionnel. Grâce à ce processus, nous formons des composants de tissu adipeux avec des propriétés sur mesure, offrant ainsi aux cliniciens une boîte à outils polyvalente pour un traitement personnalisé. Par rapport aux charges synthétiques ou à la greffe de graisse traditionnelle, l’approche utilise des tissus autologues, éliminant le risque de rejet immunitaire et assurant la biocompatibilité³. De plus, le processus de fractionnement crée des composants aux propriétés uniques, tels que l’AMC, qui fournit un support structurel et présente un faible taux d’absorption ; SVF-gel, qui fournit des injections précises et se caractérise par une forte densité de cellules de fraction vasculaire stromale ; et ACF, un échafaudage de protéines de collagène capable de libérer de manière contrôlée des facteurs de graisse, qui présente un potentiel d’applications cliniques dans le rajeunissement de la peau ^7,9,11. Cette approche réduit également le besoin de procédures répétées en améliorant la rétention du greffon et la satisfaction du patient^10,12.

Le concept de fractionnement des tissus biologiques pour optimiser les résultats thérapeutiques est bien établi, comme en témoigne la séparation du sang en plasma, en globules rouges et en plaquettes pour des applications médicales ciblées. Au cours des dernières années, la recherche et les applications cliniques des composants du tissu adipeux ont également progressé progressivement 13,14,15,16,17,18. Ce protocole de fractionnement adipeux s’appuie sur ce principe, isolant des composants aux propriétés distinctes pour une utilisation clinique sur mesure. Les cliniciens peuvent déterminer la pertinence de cette méthode en tenant compte des besoins anatomiques du patient, des résultats souhaités (par exemple, augmentation du volume, soutien structurel ou rajeunissement de la peau) et de l’équipement disponible. Ce protocole est particulièrement efficace dans les cas nécessitant un contrôle précis des propriétés du greffon, tels que le rajeunissement facial, la révision de cicatrices ou les procédures reconstructives complexes ^7,10,12.

Protocole

Cette recherche a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital Nanfang, à Guangzhou, en Chine. Du tissu adipeux a été prélevé sur des donneurs sains qui ont donné un consentement éclairé écrit pour participer à l’étude. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’hôpital Nanfang et effectuées conformément aux directives du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (Chine).

1. Préparation des matières grasses

1. Anesthésie générale et infiltration de liquide tumescent
   1. Placez le patient sous anesthésie générale. Au cours de la phase d’induction intraveineuse, administrer une combinaison de propofol (2 mg/kg), de fentanyl (1,5 μg/kg) et de rocuronium (0,6 mg/kg), suivie d’un maintien de la profondeur de l’anesthésie à l’aide de sévoflurane (1,5 %) et de rémifentanil (0,1 μg/kg/min). Tout au long de la procédure, ajustez dynamiquement le plan d’anesthésie en fonction de la surveillance BIS (valeur cible 40-60), des paramètres circulatoires (MAP >65 mmHg) et de l’EtCO₂ (35-45 mmHg).
   2. Placez le patient en position couchée avec un rembourrage protecteur aux points de pression et désinfectez rigoureusement le site chirurgical avec de la chlorhexidine-alcool. Respectez les protocoles d’asepsie pour minimiser le risque d’infection.
   3. À l’aide d’une seringue de 20 ml, infiltrez le tissu sous-cutané de la région de la liposuccion (comme l’abdomen ou la cuisse) avec du liquide tumescent contenant 0,06 % de lidocaïne et 0,001 % d’épinéphrine. Maintenir un rapport de 2:1 entre l’infiltrat et le volume prévu d’extraction de graisse, en ajustant le volume total d’injection en fonction des caractéristiques anatomiques spécifiques du patient et de la taille de la zone de traitement.
   4. Vérifiez l’effet anesthésique pour confirmer l’infiltration complète de liquide tumescent. Avant l’étape suivante, piquez ou pincez la zone de liposuccion. Si le patient ne ressent qu’une légère pression, l’infiltration est suffisante, ce qui permet de collecter la graisse avec moins d’inconfort.
2. Récolte des graisses
   1. Utilisez une canule multiport de 3 mm avec des trous latéraux pointus de 1 mm de diamètre pour la collecte des graisses. Effectuez l’opération à une pression d’aspiration de −0,75 atm pour minimiser les dommages au tissu adipeux et assurer l’intégrité et la viabilité des cellules graisseuses collectées.
3. Préparation de la graisse Coleman
   1. Laisser reposer la graisse recueillie, qui est placée dans une seringue de 60 ml, pendant 10 minutes pour laisser les composants liquides se déposer au fond du récipient.
   2. Jetez soigneusement la portion liquide au bas et récupérez la couche de graisse supérieure, relativement pure, pour éliminer les impuretés telles que le sang et le liquide tumescent.
   3. Conservez la graisse recueillie dans la seringue de 60 millilitres et centrifugez à 1 200 x g pendant 3 min à température ambiante pour stratifier davantage les composants.
   4. Après la centrifugation, jetez à nouveau la portion liquide au fond. Conserver la couche supérieure de graisse, qui est définie comme la graisse de Coleman, dans les 60-
      seringue d’un millilitre.
4. Prélèvement d’échantillons de graisses à haute et basse densité
   1. Transférez les 2/3 supérieurs de la graisse Coleman dans un tube à essai de 20 ml, en la définissant comme une graisse de faible densité (LDF).
   2. Transférez le 1/3 inférieur restant de la graisse Coleman dans un autre tube à essai de 20 ml, en le définissant comme de la graisse à haute densité (HDF).

2. Extraction des composants

1. Préparation du complexe de matrice adipeuse (AMC)
   1. Faites passer le HDF à travers un dispositif de filtrage avec un manchon et trois tamis internes (espacement de l’écran du filtre de 1,5 mm).
   2. Récupérez le tissu attaché et déshydratez-le dans un sac filtrant de 100 mailles entouré de gaze. Déterminer le point final en observant le tissu lorsqu’il est prélevé à l’aide d’une pince ; Lorsqu’aucune gouttelette de liquide évidente ne tombe lors du ramassage par force, cela indique que la déshydratation a atteint l’effet souhaité. Le produit final a été identifié comme étant AMC. Stockez le HDF restant pour une utilisation future.
2. Extraction par gel de fraction vasculaire stromale (SVF)
   1. Émulsification mécanique du LDF : Émulsionner mécaniquement le LDF en le faisant passer entre deux seringues reliées par un connecteur Luer-Lok femelle à femelle d’un diamètre intérieur de 1,4 mm à raison de 10 mL/s pendant 1 min.
   2. Centrifuger le LDF émulsionné à 1 600 x g pendant 3 min. Récupérez la couche intermédiaire, qui ressemble à une substance semblable à un gel, sous forme de gel SVF.
3. Production de fragments de collagène adipeux (ACF)
   1. Pulvérisation du LDF : Pulvérisez le LDF dans un extracteur ACF spécialisé à 30 000 tr/min pendant 60 s pour obtenir une suspension de graisse.
   2. Filtrage : Transvaser la suspension de graisse dans des seringues de 20 ml. Connectez-le à un filtre unidirectionnel de 0,25 mm, poussez le piston et recueillez le filtrat dans une autre seringue de 20 ml. Ensuite, connectez cette seringue à un filtre unidirectionnel de 0,15 mm, poussez à nouveau le piston et recueillez le filtrat final dans une troisième seringue de 20 ml. Ensuite, centrifugez la suspension de graisse à 3 000 x g pendant 3 min.
   3. Récupérez la partie solide en bas sous forme d’ACF.

3. Test des composants de la graisse

1. Essai de rigidité
   1. Utiliser un appareil doté d’un capteur de mesure de force ayant une plage de 0 N à 225 N et d’un actionneur électromagnétique permettant une course axiale de 6 mm.
   2. Clampez chaque échantillon de tissu (AMC et graisse Coleman) et appliquez une précharge de 25 à 30 N pour éliminer le mou et provoquer un allongement. Réglez la charge sur rampe à 8 mm/s et enregistrez électroniquement la force la plus élevée obtenue avant la rupture de l’échantillon. L’appareil calcule ensuite la rigidité des tissus.
2. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) et Masson
   1. Fixez les échantillons dans du paraformaldéhyde à 4 % pour préserver leur structure. Déshydrater en gradient d’éthanol pour éliminer l’eau, qui est nécessaire pour le processus d’enrobage ultérieur.
   2. Incorporez les échantillons dans de la paraffine, un processus qui facilite la coupe des échantillons en sections minces. Ensuite, sectionnez les échantillons enrobés de paraffine.
   3. Teindre les sections avec des teintures HE et trichromes de Masson. Examinez les échantillons à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB).
3. Etudes de transplantation
   1. Sélectionnez 70 souris nues de niveau SPF Santé, pesant 15 à 18 g et âgées de 4 à 6 semaines (quel que soit le sexe). Gardez les souris conformément aux directives de l’établissement, logées dans des cages individuelles avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures, et fournies avec de la nourriture et de l’eau standard à volonté.
   2. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (50 mg/kg). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie à l’aide du réflexe de pincement des orteils. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse.
   3. Injectez 0,3 ml d’AMC préparé ou de tissu adipeux (graisse de Coleman dans le groupe témoin) dans les tissus sous-cutanés de chaque souris, servant de base de référence pour le greffon de graisse. Surveiller les animaux jusqu’à ce qu’ils reprennent conscience, puis les transférer dans leurs cages.
   4. Les jours 7, 14, 30, 60 et 90 après la greffe, récoltez les greffons en les séparant soigneusement des tissus environnants. Mesurez leurs volumes. Le taux de rétention des greffons a été défini comme suit :
      taux de rétention ( %) = volume du greffon au moment de la récolte/volume de matière grasse d’injection (0,3 mL ici) x 100 %.

Résultats

Grâce à diverses procédures mécaniques effectuées pendant le processus chirurgical, nous avons réussi à transformer le tissu adipeux en composants adipeux distincts avec des caractéristiques différentes. Il s’agit, dans l’ordre, de l’AMC qui fournit un support robuste et suffisant (Figure 1A), du HDF pour un remplissage supplémentaire (Figure 1B), du gel SVF pour des injections précises dans de petites zones (Figure 1C) et de l’ACF ...

Discussion

Ce protocole de fractionnement du tissu adipeux implique plusieurs étapes critiques qui assurent l’isolement réussi des composants spécialisés. Tout d’abord, la centrifugation du tissu adipeux récolté le sépare en graisse de haute densité (HDF) et en graisse de basse densité (LDF), chacune avec des compositions de matrice cellulaire et extracellulaire (ECM) distinctes^23,24. Le HDF, riche en adipocytes viables et en cellules de fr...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,001 % d’épinéphrine	Sigma-Aldrich	E4375
0,06 % de lidocaïne	Sigma-Aldrich	L5647
Canule multiport de 3 mm	Tulip Medical Products, San Diego, Californie, États-Unis	/
Tubes à centrifuger de 50 ml	Corning	430829
Dispositif d’essai de charge BOSE ElectroForce	Bose Corporation	/
Collagénase	Worthington	LS004176
biochimique femelle à femelle Luer-Lok Connecteur	BD Biosciences	309628
filtrage avec manchon et tamis	sur mesure (Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.)	/
gaze	Medline Industries	MDS093944
Hématoxyline/Kit de coloration à l’éosine	Sigma-Aldrich	HT110116
Kit de coloration trichrome de Masson	Sigma-Aldrich	HT15
	Université médicale du Sud	/
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Thermo Fisher Scientific
Écran filtrant rond en acier inoxydable (0,15 mm)	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Écran filtrant rond en acier inoxydable (0,25 mm)	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Sac filtrant stérilisé de 100 mailles	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Extracteur de gel à fraction vasculaire stromale (SVF)	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Trypsine	Thermo Fisher Scientific	25200056
Western Blot Analysis Kit	Bio-Rad	1705061

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