Méthode simple et efficace pour tester des agents immunomodulateurs pour la génération de cellules dendritiques tolérogènes à partir de monocytes CD14+ humains

Summary

Nous décrivons une procédure pour évaluer la capacité des agents pharmacologiques à générer des cellules dendritiques tolérogènes à partir de cellules dendritiques naïves dérivées de monocytes in vitro et à valider leur puissance par génération autologue de cellules T régulatrices.

Abstract

Les cellules dendritiques tolérogènes (tolDC) sont un sous-ensemble de cellules dendritiques (DC) connues pour influencer les lymphocytes T naïfs vers un phénotype de lymphocytes T régulateurs (Treg). Les TolDC sont actuellement à l’étude en tant que thérapies pour l’auto-immunité et la transplantation, à la fois en tant que thérapie cellulaire et méthode pour induire des TolDC à partir de DC endogènes. À ce jour, cependant, le nombre d’agents connus pour induire des tolDC à partir de DC naïfs est relativement faible et leur capacité à générer des Tregs in vivo a été incohérente, en particulier les thérapies qui induisent des tolDC à partir de DC endogènes. Cela offre l’occasion d’explorer de nouveaux composés pour générer une tolérance.

Nous décrivons ici une méthode pour tester de nouveaux composés immunomodulateurs sur des CD dérivés de monocytes (moDC) in vitro et valider leur fonctionnalité pour générer des Tregs autologues. Tout d’abord, nous obtenons des PBMC et isolons les monocytes CD14⁺ et les lymphocytes T CD3⁺ à l’aide de kits de séparation magnétique disponibles dans le commerce. Ensuite, nous différencions les monocytes en moDC, les traitons avec un immunomodulateur établi, tel que la rapamycine, la dexaméthasone, l’IL-10 ou la vitamine D3, pendant 24 heures et testons leur changement de marqueurs tolérogènes comme validation du protocole. Enfin, nous co-cultivons les tolDC induits avec des lymphocytes T autologues en présence d’une stimulation anti-CD3/CD28 et observons les changements dans les populations de Tregs et la prolifération des lymphocytes T. Nous envisageons que ce protocole soit utilisé pour évaluer l’efficacité de nouveaux agents immunomodulateurs pour reprogrammer des CD déjà différenciés vers des tolDC.

Introduction

Les cellules dendritiques (DC) sont des médiateurs essentiels entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. Les DC, qui résident principalement dans les muqueuses, la peau et les tissus lymphoïdes, sont les cellules présentatrices d’antigènes primaires (^APCs)1. Les DC absorbent les protéines étrangères et les traitent et les présentent sur les principales protéines d’histocompatibilité (CMH) aux lymphocytes T naïfs. Les DC expriment spécifiquement des protéines du CMH de classe II, telles que l’antigène leucocytaire humain (HLA-DR) chez l’homme. L’état d’activation des DC lors de l’exposition à l’antigène es....

Protocol

Tous les échantillons de cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) ont été prélevés auprès de la centrale d’immunologie humaine de l’Université de Pennsylvanie auprès de donneurs anonymisés, avec l’approbation préalable de l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de Pennsylvanie et avec le consentement du patient.

Facultatif : Alors que dans cette méthode, nous avons utilisé des PBMC fraîchement isolés obtenus d’un laboratoire universitaire, les PBMC peuvent être isolés à partir de sang total ou de produits sanguins enrichis en leucaphérèse. Nous recommandons d’util....

Results

Nous avons décrit un protocole pour les PBMC humains, isolé à la fois les lymphocytes T CD3⁺ et les monocytes CD14⁺ à l’aide de kits de séparation magnétique disponibles dans le commerce, différencié les monocytes en moDC CD14^-, HLA-DR⁺, CD141⁺, CD1c⁺ à l’aide de GM-CSF et IL-4, les traitons pendant 24 h, et co-cultivons avec des lymphocytes T autologues avec stimulation anti-CD3/CD28 pendant 72 h. Un schéma expérimental est illustré à

Discussion

Nous décrivons ici une méthode fiable et polyvalente pour évaluer la fonctionnalité des agents immunomodulateurs pour induire des tolDC à partir de moDC et valider leur fonctionnalité pour générer des Tregs à partir de cellules T autogènes ex vivo. Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, les monocytes sont des cellules notoirement sensibles et doivent être obtenus à partir de PBMC frais, qui n’ont pas encore été congelés, pour obtenir les meilleurs résult.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 à 10 et micro ; L Pointes de pipette filtrées	VWR	76322-158	Culture cellulaire générale
1,5 mL Tube à centrifuger	VWR	77508-358	Culture cellulaire générale
10 mL Pipettes sérologiques	VWR	414004-267	Culture cellulaire générale
100-1000 & micro ; L Pointes de pipette filtrées	VWR	76322-164	Culture cellulaire générale
15 mL Tube conique	VWR	77508-212	Culture cellulaire générale
20-200 & micro ; L Pointes de pipette filtrées	VWR	76322-160	Culture cellulaire générale
2-Mercaptoethanol	MP Biomedical	194834	T Culture cellulaire
50 mL Tube conique	VWR	21008-736	cellulaire générale
Plat 60 x 15 mm, Nunclon Delta	Thermo Fischer	150326	Culture cellulaire générale
96 Plaque inférieure conique (V), surface non traitée	Thermo Fischer	277143	Culture cellulaire générale
Plaque à fond plat 96 puits	Thermo Fischer	161093	Culture cellulaire générale
APC/Cyanine7 anti-humain CD272 (BTLA)	Biolégende	des anticorps 344518	Cytométrie en flux
Attune NxT (laser rouge/bleu, 7 canaux)	Thermo Fischer	A24863	Cytométrie en flux
BSA	Thermo Fischer	15260-037	Cellule générale Culture
CD14 Anticorps monoclonal (61D3), PE	Thermo Fischer	12-0149-42	Cytométrie en flux
CD1c Anticorps monoclonal (L161), PE-Cyanine7	Thermo Fischer	25-0015-42	Cytométrie en flux
CD209 (DC-SIGN) Anticorps monoclonal (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5	Thermo Fischer	45-2099-42	Cytométrie en flux
CD25 Anticorps monoclonal (CD25-4E3), APC	Thermo Fischer	17-0257-42	Cytométrie en flux
CD274 (-L1, B7-H1) Anticorps monoclonal (MIH1), PE	Thermo Fischer	12-5983-42	Cytométrie en flux
CD4 Anticorps monoclonal (RPA-T4), Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	53-0049-42	Cytométrie en flux
CD40 Anticorps monoclonal (5C3), APC	Thermo Fischer	17-0409-42	Cytométrie en flux
CD40 Anticorps monoclonal (5C3), APC-eFluor 780	Thermo Fischer	47-0409-42	Cytométrie en flux
Anticorps monoclonal CD69 (FN50), PE	Thermo Fischer	MA1-10276	Cytométrie en flux
CD86 Anticorps monoclonal (BU63), FITC	Thermo Fischer	MHCD8601	Cytométrie en flux
Anticorps monoclonal CD8a (RPA-T8), PE-Cyanine7	Thermo Fischer	25-0088-42	Cytométrie
en fluxPlaque à 96 puits à fond conique (puits en V)	Thermo Fischer	2605	Cytométrie en flux
Flacons cryogéniques, 2 mL	Thermo Fischer	430488	T Culture cellulaire
Diméthylsulfoxyde (DMSO), grade de séquençage	Thermo Fischer	20688	Culture cellulaire générale
DPBS	Thermo Fischer	14200166	Culture cellulaire générale
EasySep Kit d’isolement de	monocytes humainsStem Cell Technologies	19359	Séparation cellulaire
EasySep Kit d’isolement de cellules T humaines	Stem Cell Technologies	17951	Séparation cellulaire
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000	Séparation cellulaire
EDTA	Thermo Fischer	AIM9260G	General Cell Culture
Falcon Tubes en polystyrène à fond rond, 5 mL	Technologies des cellules	souches38025	Séparation cellulaire
Inhibiteur de liaison au récepteur Fc Anticorps polyclonal	Thermo Fischer	14-9161-73	Cytométrie en flux
fœtal bovin	Thermo Fischer	A5670701	Culture cellulaire générale
Viabilité fixable Colorant eFluor 780	Thermo Fischer	65-0865-18	Cytométrie en flux
Foxp3 / Facteur de transcription Ensemble de tampons de coloration	Thermo Fischer	00-5523-00	Cytométrie en flux
FOXP3 Anticorps monoclonal (PCH101), PE-Cyanine5.5	Thermo Fischer	35-4776-42	Cytométrie
en flux HBSS	Thermo Fischer	14170-112	Culture cellulaire générale
veau fœtal inactivé par la chaleur	Thermo Fischer	A5670801	Culture cellulaire générale
HEPES (1 M)	Thermo Fischer	15630106	moDC Cell Culture
HLA-DR Anticorps monoclonal (L243), Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	A51009	Cytométrie
en flux Activateur de cellules T humaines CD3/CD28/CD2 StemCell	Technologies	10970	Culture de cellules T
Protéine recombinante humaine GM-CSF	Thermo Fischer	300-03	moDC Culture cellulaire
humaine IL-10 Kit ELISA, haute sensibilité	Thermo Fischer	BMS215-2HS	Test ELISA
IL-4 humaine, protéine recombinante exempte d’animaux	Thermo Fischer	AF-200-04	moDC Culture cellulaire
humaine PBMC (fraîchement isolée)	UPenn HIC	N/A	Cells
Human TNF alpha ELISA Kit	Thermo Fischer	BMS223-4	ELISA
Microscope optique (DMi1)	Lucia	391240	Culture cellulaire générale
Lipopolysaccaride (LPS)	Invivogen	tlrl-eblps	moDC CELL CULTURE
LIVE / DEAD Kit de coloration à cellules mortes fixable dans le proche infrarouge	Thermo Fischer	L34975	Cytométrie en flux
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)	Thermo Fischer	11140050	T Cell Culture
Pénicilline-Streptomycine (100x)	Thermo Fischer	15140122	General Cell
Culture Pipette Controller	VWR	77575-370	Culture cellulaire générale
Rapamycine, 98+ %	Thermo Fischer	J62473. MF	moDC Culture
cellulaire RPMI 1640 avec Glutamax	Thermo Fischer	61870-036	de séparation de culture cellulaire générale
	Stem Cell Technologies	20144	Séparation cellulaire
Cocktail de stimulation des cellules T (500x)	Thermo Fischer	00-4970-93	Culture cellulaire
T UltraComp eBead Plus Perles de compensation	Thermo Fischer	01-3333-41	Flow Cytométrie
Jeu de pipettes variables	Fischer Scientific	05-403-152	Culture cellulaire générale