Method Article

Méthode simple et efficace pour tester des agents immunomodulateurs pour la génération de cellules dendritiques tolérogènes à partir de monocytes CD14+ humains

DOI:

10.3791/68159

⸱

April 11th, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons une procédure pour évaluer la capacité des agents pharmacologiques à générer des cellules dendritiques tolérogènes à partir de cellules dendritiques naïves dérivées de monocytes in vitro et à valider leur puissance par génération autologue de cellules T régulatrices.

Abstract

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Les cellules dendritiques tolérogènes (tolDC) sont un sous-ensemble de cellules dendritiques (DC) connues pour influencer les lymphocytes T naïfs vers un phénotype de lymphocytes T régulateurs (Treg). Les TolDC sont actuellement à l’étude en tant que thérapies pour l’auto-immunité et la transplantation, à la fois en tant que thérapie cellulaire et méthode pour induire des TolDC à partir de DC endogènes. À ce jour, cependant, le nombre d’agents connus pour induire des tolDC à partir de DC naïfs est relativement faible et leur capacité à générer des Tregs in vivo a été incohérente, en particulier les thérapies qui induisent des tolDC à partir de DC endogènes. Cela offre l’occasion d’explorer de nouveaux composés pour générer une tolérance.

Nous décrivons ici une méthode pour tester de nouveaux composés immunomodulateurs sur des CD dérivés de monocytes (moDC) in vitro et valider leur fonctionnalité pour générer des Tregs autologues. Tout d’abord, nous obtenons des PBMC et isolons les monocytes CD14+ et les lymphocytes T CD3+ à l’aide de kits de séparation magnétique disponibles dans le commerce. Ensuite, nous différencions les monocytes en moDC, les traitons avec un immunomodulateur établi, tel que la rapamycine, la dexaméthasone, l’IL-10 ou la vitamine D3, pendant 24 heures et testons leur changement de marqueurs tolérogènes comme validation du protocole. Enfin, nous co-cultivons les tolDC induits avec des lymphocytes T autologues en présence d’une stimulation anti-CD3/CD28 et observons les changements dans les populations de Tregs et la prolifération des lymphocytes T. Nous envisageons que ce protocole soit utilisé pour évaluer l’efficacité de nouveaux agents immunomodulateurs pour reprogrammer des CD déjà différenciés vers des tolDC.

Introduction

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Les cellules dendritiques (DC) sont des médiateurs essentiels entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. Les DC, qui résident principalement dans les muqueuses, la peau et les tissus lymphoïdes, sont les cellules présentatrices d’antigènes primaires (APCs)1. Les DC absorbent les protéines étrangères et les traitent et les présentent sur les principales protéines d’histocompatibilité (CMH) aux lymphocytes T naïfs. Les DC expriment spécifiquement des protéines du CMH de classe II, telles que l’antigène leucocytaire humain (HLA-DR) chez l’homme. L’état d’activation des DC lors de l’exposition à l’antigène est essentiel pour la réponse des lymphocytes T en aval2. Les DC immatures expriment divers récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) qui reconnaissent des classes de molécules appelées motifs moléculaires associés à des agents pathogènes (PAMP), tels que le composant de la paroi bactérienne, le lipopolysaccharide (LPS)3. Lors de la stimulation PRR, les DC deviennent des DC matures et régulent à la hausse d’importantes protéines de co-stimulation des lymphocytes T, telles que CD80, CD86 et CD40, et sécrètent des cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα), facilitant la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T effecteurs ou auxiliaires conventionnels2. Au contraire, si la maturation des DC est interrompue ou si les DC se développent dans un environnement tolérogène, les DC peuvent générer un état DC tolérogène (tolDCs)4. Les TolDC régulent à la baisse les récepteurs de co-stimulation classiques des lymphocytes T et régulent à la hausse les récepteurs de tolérance tels que le ligand de mort cellulaire programmée 1 (-L1) et l’atténuateur de lymphocytes B et T (BTLA) et génèrent des cytokines suppressives telles que l’interleukine 10 (IL-10) et le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β)4. Il ne s’agit pas d’une liste exhaustive de marqueurs de tolérance et, en fait, il y a un consensus limité quant aux marqueurs tolDC appropriés pour définir l’état tolDC5. Compte tenu de cela, nous proposons la génération de lymphocytes T régulateurs (Treg) comme marqueur fonctionnel qui devrait être utilisé pour comparer l’efficacité de divers agents d’induction tolDC.

En plus des états d’activation tolDC/matured DC, les DC peuvent également être classés en fonction de leur lignée ou de leur emplacement tissulaire, chaque sous-ensemble affichant des fonctionnalités légèrement différentes. Alors que la division tolDC/DC mature est moins définitive et existe davantage comme un continuum, les divisions de lignée ont des marqueurs bien définis chez l’homme et la souris. Les précurseurs de DC se forment dans la moelle osseuse, mais il existe deux sous-types principaux de DC en fonction de leur lignée : 1) les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), qui dérivent des lignées lymphoïdes et 2) les cellules dendritiques conventionnelles (cDC), qui dérivent des lignées myéloïdes. Chez l’homme, les pDC sont matures dans les organes lymphoïdes, expriment CD303 et répondent très bien aux infections virales6. Les cDC exprimant CD11c, quant à eux, sont matures dans les tissus périphériques et existent en deux sous-types distincts, les CD1c+ cDC1 et CD141+ cDC2, qui génèrent chacun des réponses distinctes des lymphocytes T7. De plus, tous les cDC peuvent exister dans lessous-états 8 des tissus résidents (CD103-) ou migratoires (CD103+). Enfin, dans certaines conditions, les cellules issues de lignées de monocytes (CD14+) peuvent être induites vers un phénotype de cellules dendritiques et sont identifiées comme CD14-, CD141+, CD1c+ 9. Ces cellules, connues sous le nom de DC dérivées de monocytes (moDC), sont les plus couramment utilisées pour l’analyse ex vivo chez l’homme, car les monocytes constituent environ 10 à 30 % des cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC), tandis que les pDC n’en constituent que 1 à 3 %10. Cela fait des moDC un choix attrayant, mais on sait également que les moDC sont plus inflammatoires que les cDC typiques isolés du tissu primaire9.

Il existe actuellement deux grandes catégories d’efforts visant à utiliser les tolDC pour générer une tolérance clinique. Tout d’abord, les tolDC sont générés à partir de monocytes pour être utilisés comme thérapie cellulaire. Dans ce paradigme, les moDC sont généralement différenciées à l’aide de l’IL-4/GM-CSF en même temps que des immunomodulateurs tels que la vitamine D3, la rapamycine (rapa), l’IL-10, la dexaméthasone ou des combinaisons de ces11,12. Ces tolDC ont été explorés en tant que thérapies cellulaires autologues pour l’auto-immunité et les greffes13. L’autre utilisation des tolDC consiste à reprogrammer des DC endogènes vers des tolDC en utilisant des médicaments gratuits ou des nanotransporteurs pour délivrer à la fois l’immunomodulateur et l’antigène d’intérêt 14,15,16. L’induction de DC déjà différenciées est cependant plus difficile en raison du développement de phénotypes métaboliques robustes des DC qui contrastent généralement avec le métabolisme des tolDC17,18. Il s’agit d’une barre haute pour la plupart des immunomodulateurs pharmacologiques ; pour cette raison, la plupart des études de reprogrammation endogène des DC font état d’une suppression efficace des DC et souvent d’une certaine induction des Tregs, mais manquent de succès clinique, souvent en raison d’un manque de persistance des lymphocytes T 15,19,20. Cela souligne la nécessité de stratégies pour identifier les agents d’induction potentiels de tolDC à partir de CD existants.

Ici, nous présentons une méthode d’évaluation in vitro d’agents immunomodulateurs contre des moDC différenciés avec la métrique finale de l’induction autologue des Treg. Ce protocole est conçu pour évaluer l’efficacité des agents immunomodulateurs pour reprogrammer des moDC humains déjà différenciés vers la tolérance. De plus, ce protocole valide la fonctionnalité des tolDC reprogrammés pour générer des Tregs contre des lymphocytes T autologues isolés à partir du même échantillon PBMC. Cela contraste avec d’autres protocoles qui induisent une tolérance lors de la différenciation et/ou promettent des tolDC avec des lymphocytes T de donneurs allogéniques21. Dans ce protocole, nous utilisons l’agent tolérant commun rapa comme exemple, mais nous démontrons également l’efficacité limitée des moDC traités par rapa pour générer des Tregs. Dans nos résultats représentatifs, nous montrons également l’efficacité d’autres traitements immunomodulateurs courants tels que l’IL-10, la dexaméthasone et la vitamine D3. Nous prévoyons que ce protocole sera utilisé pour dépister des agents inducteurs de tolDC potentiellement plus efficaces par rapport à des moDC22 déjà établis.

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Protocol

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Tous les échantillons de cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) ont été prélevés auprès de la centrale d’immunologie humaine de l’Université de Pennsylvanie auprès de donneurs anonymisés, avec l’approbation préalable de l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de Pennsylvanie et avec le consentement du patient.

Facultatif : Alors que dans cette méthode, nous avons utilisé des PBMC fraîchement isolés obtenus d’un laboratoire universitaire, les PBMC peuvent être isolés à partir de sang total ou de produits sanguins enrichis en leucaphérèse. Nous recommandons d’utiliser la méthode de centrifugation par gradient de densité, car il s’agit d’une méthode bien établie et fiable qui est décrite ailleurs23.

1. Isolement des monocytes/lymphocytes T et différenciation des moDC

  1. Isolement des monocytes et des lymphocytes T des PBMC-Jour 1
    1. Obtenez 200 millions de PBMC humains d’un donneur sain. Conservez les cellules dans un tube de 15 ml et transférez-les sur de la glace.
    2. Aliquote 50 mL de tampon de séparation (fourni dans les kits de séparation disponibles dans le commerce) dans un tube conique.
      REMARQUE : Le tampon de séparation peut également être remplacé par du DPBS avec 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
    3. Retirez le tube PBMC de la glace et remplissez-le de tampon de séparation. Centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
    4. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 4 mL de milieu recommandé à l’aide d’une pipette sérologique.
    5. Divisez la suspension en deux tubes différents de 15 ml, en ajoutant 2 ml par tube (5 × 107 cellules/ml par tube). Étiquetez un tube « T » et l’autre « Monocytes ».
    6. Récupérez la trousse d’isolement des monocytes humains et suivez le protocole du fabricant pour isoler les monocytes du tube marqué aux monocytes.
    7. Récupérez le kit d’isolement des lymphocytes T humains et suivez le protocole du fabricant pour le deuxième tube afin d’isoler les lymphocytes T.
  2. Placage de monocytes pour la différenciation et la congélation des lymphocytes T - Jour 1
    1. Préchauffer 50 mL de milieu de culture moDC (tableau 1) à 37 °C pendant au moins 10 min.
    2. Centrifuger les tubes de 15 mL avec des monocytes enrichis et le tube de 15 mL avec des lymphocytes T de l’étape 1.1 à 250 × g pendant 5 min.
    3. Aspirez le surnageant. Réinjectez les monocytes en suspension dans 1 mL de milieu de culture moDC et les lymphocytes T dans le milieu de culture de cellules T (Tableau 1) en pipetant de haut en bas. Assurez-vous que la pastille est correctement dispersée.
    4. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémacytomètre manuel à l’aide de la coloration au bleu trypan.
      REMARQUE : Pour les données représentatives, 10 millions de lymphocytes T et 3 millions de monocytes ont été isolés.
    5. Prenez le tube avec les monocytes et ajoutez 9 mL de milieu de culture moDC chaud à la suspension pour un volume final de 10 mL. Ensuite, ajouter 100 μL de GM-CSF et 10 μg/mL d’IL-4 pour obtenir une concentration finale de 100 ng/mL de GM-CSF et d’IL-4 dans le milieu. Transvaser la suspension dans une boîte de Pétri et étiqueter comme « moDC » (Jour 1) et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2.
    6. Prenez le tube de cellules T et mélangez 1 mL de milieu de congélation pour cellules T (tableau 1) avec 1 mL de suspension de cellules T. Diviser en deux flacons cryogéniques de 2 mL (1 mL/flacon) ; Fermer hermétiquement (concentration finale de 5 millions de cellules par flacon). Placez les cryoflacons dans une chambre de congélation avec des tubes d’équilibrage dans les puits inutilisés. Conservez la chambre à −80 °C pendant la nuit, puis transférez les cryoflacons dans un réservoir cryogénique.
    7. Le jour 4, rafraîchir le milieu avec l’ajout de 5 ml de milieu de culture moDC frais et ajouter 100 μL chacun de GM-CSF et d’IL-4. Les moDC différenciés seront prêts le jour 7.

2. Ajout de médicaments immunomodulateurs pour générer des moDC tolérogènes

  1. Configurez la plaque moDC.
    1. Le jour 7, récupérez les moDC différenciés de l’incubateur et transférez la suspension de cellules moDC dans un tube de 50 ml.
    2. Centrifuger la suspension à 250 × g pendant 5 min. Aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture moDC chaud en pipetant de haut en bas. Compter les cellules à l’aide d’un hémacytomètre et diluer les cellules à une concentration de 3 × 10 à5 cellules/mL dans un milieu de culture chaud contenant 100 ng/mL DE GM-CSF et d’IL-4.
    3. Ajouter 3 × 104 cellules/puits dans 100 μL au nombre désiré de puits dans une plaque de culture tissulaire à fond plat de 96 puits.
      REMARQUE : Pour des résultats représentatifs, nous avons utilisé un total de 48 puits (quatre conditions faites en trois exemplaires préparées pour quatre analyses différentes dans les sections 3 et 4), mais cela peut être ajusté pour un maximum de 60 puits. Remplissez tous les puits restants avec 100 μL/puits PBS pour éviter le dessèchement, en particulier les puits extérieurs. Nous recommandons de préparer différentes plaques pour chaque méthode d’analyse.
    4. Ajouter 1 μL/puits de médicaments immunomodulateurs dans les puits souhaités (ici 10 ng/mL de rapa). Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Si vous incluez l’immunostimulation le 8e jour, préparez des puits pour le médicament immunomodulateur avec et sans immunostimulation. L’utilisation de l’immunostimulation chez les moDC matures est facultative.
  2. Redécongeler les lymphocytes T.
    1. Le jour 8, récupérez deux cryoflacons du réservoir cryogénique et décongelez-les dans un bain de billes chaudes ou un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que le contenu commence à fondre (en <3 min).
    2. Lorsque le contenu commence à fondre, transférez les flacons dans une hotte de culture cellulaire et placez 1 mL de milieu de culture de cellules T chaud dans le flacon pour décongeler rapidement. Transférez tout le contenu du flacon dans un tube de 50 ml. Rincez les cryoflacons avec 1 mL de milieu de culture de cellules T pour vous assurer que toutes les cellules sont transférées dans le tube.
    3. Complétez la suspension avec la solution de coloration par écoulement (tableau 1) à 15 ml. Centrifuger à 200 × g pendant 10 min et aspirer le surnageant. Ensuite, mettez la pastille en suspension dans 5 mL de solution de coloration par écoulement et centrifugez-la à nouveau.
    4. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture de cellules T chaudes. Comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre.
      REMARQUE : La viabilité doit être de >70 % à ce stade ; s’il reste de grandes quantités de cellules mortes, transférer dans un tube frais, ajouter 10 ml de solution de coloration cellulaire, centrifuger à 200 × g pendant 5 min, remettre en suspension dans 1 ml de milieu à cellules T et recompter.
    5. Ajouter 9 mL de milieu de culture de cellules T chaud pour obtenir un volume final de 10 mL. Transférez la suspension dans une boîte de Pétri. Étiquetez-le comme « lymphocytes T décongelés » et incubez toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO2 pour laisser reposer les cellules.
  3. Lavez la plaque moDC et ajoutez l’immunostimulateur si vous le souhaitez.
    1. Le jour 8, centrifugez la plaque moDC (à partir du jour 7) à 300 × g pendant 5 min.
    2. Aspirer le surnageant, laver avec du HBSS chaud, répéter la centrifugation, aspirer à nouveau et remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture chaud moDC contenant du GM-CSF et de l’IL-4 (100 μL/puits).
      REMARQUE : Veillez à ne pas déranger les cellules. Inclinez la plaque pendant l’aspiration. Environ 10 μL peuvent rester dans le puits.
    3. Si vous utilisez l’immunostimulation, ajoutez 1 μL/puits de LPS 100x stock (ou un autre agent immunostimulant) dans les puits souhaités. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.

3. Analyse de flux pour moDC (Validation + Tolérance)

  1. Analyse de flux pour la validation de moDC
    1. Le jour 8, préparer des cocktails d’anticorps pour le panel de validation, en ciblant les marqueurs suivants : HLA-DR, CD14, lectine de type C spécifique des cellules dendritiques (DC-SIGN), CD1c et CD40, comme décrit dans le tableau 2. Diluez tous les anticorps avec une solution de coloration d’écoulement.
      REMARQUE : Le panneau a été conçu pour un cytomètre de flux laser rouge / bleu à 7 canaux.
    2. Récupérez la plaque moDC de l’incubateur. Centrifuger la plaque à 300 × g pendant 5 min. Retirez les surnageants. Facultatif : Conservez les surnageants pour l’analyse ELISA des cytokines IL-10 et TNFα à l’aide de kits disponibles dans le commerce conformément aux instructions du fabricant.
    3. Ajouter 200 μL/puits de solution de coloration d’écoulement. Centrifuger la plaque à 300 × g pendant 5 min.
    4. Aspirer le surnageant et ajouter 50 μL/puits d’anticorps inhibiteur de liaison au récepteur Fc dilué 1:200 dans une solution de coloration en flux pour bloquer la liaison non spécifique. Incuber à température ambiante (RT) pendant 30 min.
    5. Ajouter 50 μL/puits du cocktail d’anticorps du panel de validation préparé.
    6. Préparez des témoins de compensation dans la plaque ou dans des tubes de 1,5 mL en mélangeant 50 μL de billes de compensation avec 50 μL de chaque anticorps dilué. Incuber la plaque à 4 °C pendant 1 h.
      REMARQUE : Les billes de compensation sont utilisées ici plutôt que les cellules pour la compensation en raison de l’expression potentiellement faible des marqueurs sur les moDC.
    7. Laver par centrifugation à 300 × g pendant 5 min, en éliminant le surnageant et en remettant en suspension dans 200 μL de solution de coloration par écoulement. Effectuez deux lavages.
    8. Après le lavage final, centrifuger à nouveau et remettre les cellules en suspension dans 110 μL/puits de solution de coloration en flux. Les échantillons sont maintenant prêts pour l’analyse par cytométrie en flux.
  2. Analyse de flux pour moDC tolérogène (Tolerance Panel)
    1. Comme à l’étape 3.1 du jour 8, préparer des cocktails d’anticorps pour le panel de tolérance, en ciblant les marqueurs suivants : CD86,-L1, DC-SIGN, CD1c, BTLA et CD40 (tableau 2).
    2. Répétez les étapes 3.1.2 à 3.1.8 en remplaçant le cocktail d’anticorps par le cocktail du panel de tolérance .

4. Analyse de l’écoulement des lymphocytes T

  1. Combinez les lymphocytes T avec des moDC tolérogènes traités.
    1. Le 9e jour, récupérez la boîte de Pétri des lymphocytes T redécongelés de l’incubateur et transférez tous les lymphocytes T dans un tube de 50 ml. Complétez avec la solution de coloration Flow.
    2. Facultatif : Si vous effectuez une analyse de la prolifération des lymphocytes T, divisez les lymphocytes T en deux tubes.
      1. Avec le premier tube, tournez à 250 × g pendant 5 min et retirez le surnageant. Teignez ce tube avec un colorant de prolifération cellulaire selon les instructions du fabricant.
        REMARQUE : Nous avons utilisé le colorant de viabilité fixable eFluor 670, qui nécessite une étape d’incubation de 30 minutes, suivie de deux étapes de lavage. Nous suggérons d’utiliser des tubes coniques de 50 ml pour éviter la perte de cellules et d’utiliser du HBSS avec 10 % de HIFBS pour laver après la coloration.
      2. Utilisez le deuxième tube contenant des cellules T non colorées pour l’analyse des Treg. De même, essorez à 250 × g pendant 5 min, retirez le surnageant, remettez-le en suspension dans un milieu de culture cellulaire chaud et conservez-le dans l’incubateur pendant le processus de coloration. Si aucune prolifération de lymphocytes T n’est nécessaire, faites tourner tous les lymphocytes T et remplacez-les par des milieux de culture de lymphocytes T chauds.
    3. Comptez les cellules et obtenez au moins 4 millions (pour l’analyse des Tregs uniquement) ou 8 millions (pour l’analyse de la prolifération des Treg et des T).
    4. Récupérez la plaque moDC de l’incubateur avec les puits restants, centrifugez à 300 × g pendant 5 min et apiratez les surnageants. Ajouter 200 μL/puits de cellules T à 1,6 × 105 cellules/puits. Ajoutez des lymphocytes T non colorés pour les plaques d’analyse Treg et des lymphocytes T colorés pour les plaques de prolifération des lymphocytes T.
      REMARQUE : Cela maintiendra un rapport cellule T/moDC de 5:1, car les 3 ×10 initiaux4 moDC se dilatent généralement légèrement.
    5. Ajouter 25 μL/mL de cocktail d’anticorps anti-CD3/CD28 à tous les groupes, à l’exception des puits de contrôle négatifs, pour stimuler les lymphocytes T. Incuber la plaque pendant 72 h à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu’au 12e jour.
      REMARQUE : Assurez-vous d’utiliser des lymphocytes T colorés pour l’analyse de la prolifération et non colorés pour l’analyse des Treg.
  2. Analyse de l’écoulement Treg
    1. Coloration au marqueur de surface
      1. Le 12e jour, préparez des cocktails d’anticorps pour le panel Treg (tableau 2).
      2. Transférez toutes les suspensions cellulaires de la plaque de culture à 96 puits dans une plaque à fond en V avec une solution de coloration par écoulement. Conservez les surnageants pour l’analyse des cytokines.
      3. Laver les cellules 2 fois par centrifugation (200 × g pendant 5 min suivi de 200 μL de solution de coloration Flow). Réservez certaines cellules pour les contrôles de compensation. Mettez-en un de côté pour la coloration FOXP3 et pour les témoins non colorés.
        REMARQUE : Nous suggérons de peigner 10 μL de tous les échantillons avant l’essorage final à l’étape 4.2.1.3 pour obtenir les contrôles de compensation nécessaires. Cela fournit un échantillon représentatif de toute l’expression au niveau de la surface de chaque marqueur sur les cellules.
      4. Après le deuxième lavage, centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer, puis ajouter 50 μL/puits d’anticorps inhibiteur de liaison au récepteur Fc (dilué 1:200 dans une solution de coloration en flux). Incuber à température ambiante pendant 10 min.
      5. Ajouter 50 μL/puits du cocktail d’anticorps Treg Panel préparé.
      6. Pour les contrôles de compensation, mélanger 50 μL de cellules de compensation non colorées avec 50 μL de chaque anticorps coloré.
      7. Incuber la plaque et les commandes de compensation à 4 °C pendant 1 h. Lavez la plaque une fois avec Flow Stain Solution et centrifugez-la à 300 × g pendant 5 min.
      8. Coloration avec un colorant proche infrarouge vivant/mort dilué dans HBSS (1:1 000) à 200 μL/puits. Incuber à 4 °C pendant 30 min.
      9. Lavez la plaque une fois avec la solution de coloration Flow (200 μL/puits) à 300 × g pendant 5 min.
    2. Colorer avec FoxP3 selon les instructions du fabricant, ce qui nécessitera une incubation d’une nuit. Un bref aperçu du protocole de coloration FoxP3 est décrit ci-dessous.
      1. Préparez la solution de travail de fixation/perméabilisation FoxP3 selon les instructions du fabricant. Mélangez 1 partie de concentré de fixation/perméabilisation FoxP3 avec 3 parties de diluant de fixation/perméabilisation FoxP3. Préparez 200 μL de la solution de travail par échantillon.
      2. Incuber tous les échantillons dans 200 μL/puits de la solution de fixation/perméabilisation en état de marche. Laisser à 4 °C pendant 1 h.
      3. Préparez 1x tampon de perméabilisation : Mélangez 1 partie de 10x tampon de perméabilisation (obtenu à partir d’un kit commercial) avec 9 parties d’eau distillée.
      4. Lavez la plaque 2x avec 1x tampon de perméabilisation (200 μL/puits) à 300 × g pendant 5 min.
      5. Coloration avec anticorps FoxP3 (PE-Cy5.5, dilution 1:300 dans 1x tampon de perméabilisation) : Ajouter 100 μL/puits de l’anticorps FoxP3 dilué et incuber à 4 °C pendant la nuit.
      6. Lavez la plaque 2x avec 1x tampon de perméabilisation (200 μL/puits) à 300 × g pendant 5 min.
      7. Remettre les cellules en suspension dans 110 μL/puits de solution de coloration par écoulement.
      8. Effectuer une analyse par cytométrie en flux.
  3. Analyse de la prolifération des lymphocytes T
    1. Préparer des cocktails d’anticorps pour le panel sur la prolifération T (tableau 2).
    2. Transférez toutes les suspensions cellulaires de la plaque de culture à 96 puits dans une plaque à fond en V avec une solution de coloration par écoulement. Conserver les surnageants pour l’analyse des cytokines.
    3. Laver les cellules 2 fois par centrifugation (200 × g pendant 5 min suivi de 200 μL de solution de coloration Flow). Réservez certaines cellules pour les contrôles de compensation. Mettez-en un de côté pour la coloration FOXP3 et pour les témoins non colorés.
      REMARQUE : Nous suggérons de peigner 10 μL de tous les échantillons avant l’essorage final à l’étape 4.3.3 pour obtenir les contrôles de compensation nécessaires. Cela fournit un échantillon représentatif de toute l’expression au niveau de la surface de chaque marqueur sur les cellules.
    4. Après le deuxième lavage, centrifuger (200 × g pendant 5 min à température ambiante) et aspirer, puis ajouter 50 μL/puits d’anticorps inhibiteur de liaison au récepteur Fc (dilué 1:200 dans une solution de coloration en flux). Incuber à température ambiante pendant 10 min.
    5. Ajouter 50 μL/puits du cocktail d’anticorps du panel de prolifération T préparé.
    6. Pour les contrôles de compensation, mélanger 50 μL de cellules de compensation non colorées avec 50 μL de chaque anticorps coloré.
    7. Incuber la plaque et les commandes de compensation à 4 °C pendant 1 h. Lavez la plaque une fois avec Flow Stain Solution et centrifugez-la à 300 × g pendant 5 min.
    8. Coloration avec un colorant proche infrarouge vivant/mort dilué dans HBSS (1:1 000) à 200 μL/puits. Incuber à 4 °C pendant 30 min.
    9. Lavez la plaque une fois avec la solution de coloration Flow (200 μL/puits) à 300 × g pendant 5 min.
    10. Effectuer une analyse par cytométrie en flux.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons décrit un protocole pour les PBMC humains, isolé à la fois les lymphocytes T CD3+ et les monocytes CD14+ à l’aide de kits de séparation magnétique disponibles dans le commerce, différencié les monocytes en moDC CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ à l’aide de GM-CSF et IL-4, les traitons pendant 24 h, et co-cultivons avec des lymphocytes T autologues avec stimulation anti-CD3/CD28 pendant 72 h. Un schéma expérimental est illustré à

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici une méthode fiable et polyvalente pour évaluer la fonctionnalité des agents immunomodulateurs pour induire des tolDC à partir de moDC et valider leur fonctionnalité pour générer des Tregs à partir de cellules T autogènes ex vivo. Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, les monocytes sont des cellules notoirement sensibles et doivent être obtenus à partir de PBMC frais, qui n’ont pas encore été congelés, pour obtenir les meilleurs résult...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier le Human Immunology Core (HIC) de l’Université de Pennsylvanie d’avoir fourni de nouveaux PBMC humains provenant de donateurs. Le HIC est soutenu en partie par les AI045008 P30 et P30 CA016520 des NIH.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1 à 10 et micro ; L Pointes de pipette filtréesVWR76322-158Culture cellulaire générale
1,5 mL Tube à centrifugerVWR77508-358Culture cellulaire générale
10 mL Pipettes sérologiquesVWR414004-267Culture cellulaire générale
100-1000 & micro ; L Pointes de pipette filtréesVWR76322-164Culture cellulaire générale
15 mL Tube coniqueVWR77508-212Culture cellulaire générale
20-200 & micro ; L Pointes de pipette filtréesVWR76322-160Culture cellulaire générale
2-MercaptoethanolMP Biomedical194834T Culture cellulaire
50 mL Tube coniqueVWR21008-736cellulaire générale
Plat 60 x 15 mm, Nunclon DeltaThermo Fischer150326Culture cellulaire générale
96 Plaque inférieure conique (V), surface non traitéeThermo Fischer277143Culture cellulaire générale
Plaque à fond plat 96 puitsThermo Fischer161093Culture cellulaire générale
APC/Cyanine7 anti-humain CD272 (BTLA)Biolégendedes anticorps 344518Cytométrie en flux
Attune NxT (laser rouge/bleu, 7 canaux)Thermo FischerA24863Cytométrie en flux
BSAThermo Fischer15260-037Cellule générale Culture
CD14 Anticorps monoclonal (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Cytométrie en flux
CD1c Anticorps monoclonal (L161), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42Cytométrie en flux
CD209 (DC-SIGN) Anticorps monoclonal (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42Cytométrie en flux
CD25 Anticorps monoclonal (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Cytométrie en flux
CD274 (-L1, B7-H1) Anticorps monoclonal (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Cytométrie en flux
CD4 Anticorps monoclonal (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Cytométrie en flux
CD40 Anticorps monoclonal (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Cytométrie en flux
CD40 Anticorps monoclonal (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Cytométrie en flux
Anticorps monoclonal CD69 (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Cytométrie en flux
CD86 Anticorps monoclonal (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Cytométrie en flux
Anticorps monoclonal CD8a (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42Cytométrie
en fluxPlaque à 96 puits à fond conique (puits en V)Thermo Fischer2605Cytométrie en flux
Flacons cryogéniques, 2 mLThermo Fischer430488T Culture cellulaire
Diméthylsulfoxyde (DMSO), grade de séquençageThermo Fischer20688Culture cellulaire générale
DPBSThermo Fischer14200166Culture cellulaire générale
EasySep Kit d’isolement demonocytes humainsStem Cell Technologies19359Séparation cellulaire
EasySep Kit d’isolement de cellules T humainesStem Cell Technologies17951Séparation cellulaire
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000Séparation cellulaire
EDTAThermo FischerAIM9260GGeneral Cell Culture
Falcon Tubes en polystyrène à fond rond, 5 mLTechnologies des cellulessouches38025Séparation cellulaire
Inhibiteur de liaison au récepteur Fc Anticorps polyclonalThermo Fischer14-9161-73Cytométrie en flux
fœtal bovinThermo FischerA5670701Culture cellulaire générale
Viabilité fixable Colorant eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Cytométrie en flux
Foxp3 / Facteur de transcription Ensemble de tampons de colorationThermo Fischer00-5523-00Cytométrie en flux
FOXP3 Anticorps monoclonal (PCH101), PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42Cytométrie
en flux HBSSThermo Fischer14170-112Culture cellulaire générale
veau fœtal inactivé par la chaleurThermo FischerA5670801Culture cellulaire générale
HEPES (1 M)Thermo Fischer15630106moDC Cell Culture
HLA-DR Anticorps monoclonal (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Cytométrie
en flux Activateur de cellules T humaines CD3/CD28/CD2 StemCellTechnologies10970Culture de cellules T
Protéine recombinante humaine GM-CSFThermo Fischer300-03moDC Culture cellulaire
humaine IL-10 Kit ELISA, haute sensibilitéThermo FischerBMS215-2HSTest ELISA
IL-4 humaine, protéine recombinante exempte d’animauxThermo FischerAF-200-04moDC Culture cellulaire
humaine PBMC (fraîchement isolée)UPenn HICN/ACells
Human TNF alpha ELISA KitThermo FischerBMS223-4ELISA
Microscope optique (DMi1)Lucia391240Culture cellulaire générale
Lipopolysaccaride (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC CELL CULTURE
LIVE / DEAD Kit de coloration à cellules mortes fixable dans le proche infrarougeThermo FischerL34975Cytométrie en flux
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)Thermo Fischer11140050T Cell Culture
Pénicilline-Streptomycine (100x)Thermo Fischer15140122General Cell
Culture Pipette ControllerVWR77575-370Culture cellulaire générale
Rapamycine, 98+ %Thermo FischerJ62473. MFmoDC Culture
cellulaire RPMI 1640 avec GlutamaxThermo Fischer61870-036de séparation de culture cellulaire générale
Stem Cell Technologies20144Séparation cellulaire
Cocktail de stimulation des cellules T (500x)Thermo Fischer00-4970-93Culture cellulaire
T UltraComp eBead Plus Perles de compensationThermo Fischer01-3333-41Flow Cytométrie
Jeu de pipettes variablesFischer Scientific05-403-152Culture cellulaire générale
Culture SérumSérum de Tampon

References

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