En face Cryosectionnement de la rétine de souris pour l’analyse moléculaire spatiale de haute dimension

Résumé

La rétine présente une organisation spatiale complexe à travers sa structure laminaire. Les techniques modernes de transcriptomique spatiale et de séquençage nécessitent des coupes de tissus < 20 μm d’épaisseur, ce qui limite leur applicabilité à la recherche rétinienne. Cette méthode de cryosectionnement fraîchement congelée produit de fines sections de la rétine de la souris tout en préservant les relations spatiales planes, permettant une cartographie moléculaire complète à travers les lames.

Résumé

La structure laminaire complexe de la rétine présente des défis importants pour une cartographie moléculaire spatiale complète. Les techniques actuelles d’étude de l’architecture tissulaire et des interactions moléculaires sont limitées par des contraintes techniques qui compromettent les relations spatiales ou restreignent le profilage moléculaire. Les méthodes existantes telles que la coupe transversale, les préparations de montage entier, les dissociations chimiques ou mécaniques et les coupes épaisses en face perturbent l’intégrité des tissus, perdent leur contexte spatial critique ou, le plus souvent, sont tout simplement incompatibles avec les plateformes de séquençage spatial de grande dimension.

Cette étude introduit une technique de cryosection qui permet de produire des coupes minces (<20 μm) en face tout en préservant les relations spatiales essentielles à la cartographie de la distribution des cellules rétiniennes. La méthode maintient l’intégrité de l’ARN et l’architecture tissulaire tout en générant des sections compatibles avec les plateformes d’analyse moléculaire à haut débit. L’intégrité de l’ARN est maintenue parce que cette technique coupe des tissus fraîchement congelés, ce que les fabricants de plates-formes transcriptomiques spatiales soutiennent officiellement par rapport aux tissus postfixés. Nous validons cette approche à l’aide de plusieurs méthodes de profilage moléculaire, démontrant une intégration réussie avec l’hybridation manuelle in situ de l’ARNASCOPE (12 cibles) et le séquençage spatial du xenium (300 cibles). La technique préserve de manière cohérente l’architecture tissulaire des échantillons tout en maintenant la qualité de l’ARN adaptée à ces applications moléculaires sensibles.

Cette avancée méthodologique permet de nouvelles investigations sur la distribution des types de cellules rétiniennes, les gradients moléculaires entre les lames et les aspects spatiaux de la pathologie rétinienne. La polyvalence de la technique et sa compatibilité avec les plateformes modernes de biologie spatiale constituent la base d’une cartographie moléculaire complète de l’organisation cellulaire complexe de la rétine.

Introduction

Les neurones rétiniens ont développé des topographies spatiales qui facilitent le traitement de l’information, ce qui, chez de nombreuses espèces, entraîne des spécialisations grossières telles que les fovéas, les zones centrales et les stries ^1,2,3. Contrairement à la diversité bien comprise de la distribution des photorécepteurs, la spécialisation spatiale de la production rétinienne, formée par les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR), est moins claire. Pour la plupart des espèces, la distribution spatiale des CGR est totalement inconnue. Même pour la souris, sans doute l’un sinon le modèle de fonction visuelle des vertébrés le mieux étudié, moins d’un tiers des sous-types de RGC ont été cartographiés avec des techniques traditionnelles comme l’immunohistochimie de l’ensemble du monticule². Ces techniques échouent parce que la plupart des sous-types de CGR n’ont pas de marqueur génétique spécifique. Au lieu de cela, des informations moléculaires de plus grande dimension sont nécessaires pour une classification précise du RGC⁴ via le séquençage de l’ARN unicellulaire ^5,6,7.

L’information sur la distribution du CGR est importante, car les topographies observées chez la souris montrent des corrélats écologiques clairs entre le placement du CGR et la fonction visuelle. L’exemple le plus frappant est l’organisation spatiale des CGR ɑON-S, qui se regroupent dans la rétine temporale. Cette région reçoit l’image de la proie⁸ lors des comportements de chasse⁹. Il est également bien connu que les sous-types RGC sont différemment sensibles à la maladie¹⁰, et que certaines maladies courantes comme le glaucome ont une composante spatiale à leur progression^11,12. Ainsi, une question importante à laquelle le domaine est confronté est la suivante : quelle est l’organisation spatiale des sous-types de CGR lorsqu’ils tuilent la rétine¹ ? Ce manque de connaissances limite actuellement les connaissances sur d’autres comportements et maladies guidés visuellement.

L’objectif de la présente méthode est de combler ces lacunes dans les connaissances moléculaires grâce à une approche de cryosection en face qui préserve les relations spatiales tout en permettant une analyse moléculaire à haute résolution. Les plateformes modernes de séquençage spatial comme le Xenium de 10X représentent une avancée transformatrice dans le profilage moléculaire, offrant des informations sans précédent sur l’organisation des tissus et les interactions cellulaires. Cependant, ces plateformes, ainsi que les techniques de plexage inférieur comme le RNAscope et les méthodes de séquençage à code-barres spatial comme Visium, partagent une contrainte technique critique : elles nécessitent des coupes de tissus plus minces que 20 μm. Cette exigence présente un défi particulier pour le tissu rétinien, qui mesure généralement 200 μm d’épaisseur.

Jusqu’à présent, les chercheurs se sont principalement appuyés sur des coupes transversales pour appliquer ces technologies au tissu rétinien¹³. Bien que les coupes efficaces révèlent efficacement les relations moléculaires au sein des couches nucléaires et plexiformes dans le contexte des circuits verticaux, elles sont moins adaptées pour capturer les distributions spatiales plus larges des cellules rétiniennes que les préparations de montures entières ont traditionnellement révélées⁸. Les tentatives récentes de sectionnement en face ont été limitées par des contraintes d’épaisseur de section, les études n’atteignant que des sections de 50 μm¹⁴ fois trop épaisses pour les plateformes modernes d’analyse moléculaire à haut plex. D’autres approches historiques qui ont été déployées pour étudier la lame rétinienne individuelle mais qui ne sont pas compatibles avec les techniques modernes de séquençage spatial comprennent la digestion enzymatique, combinée à la dissociation mécanique^15,16, ou les dissociations mécaniques seules 17,18,19,20. Ici, nous présentons une nouvelle technique de cryosectionnement spécialement conçue pour les tissus rétiniens minces et incurvés qui surmonte ces limitations. En bref, notre méthode consiste à extraire la chambre postérieure de l’œil, à créer des coupures en relief à travers la rétine et la sclérotique, à aplatir le tissu avec la rétine interne contre un couvre-verre, à intégrer le tissu dans l’OCT et, enfin, à cryosectionner de l’externe à l’intérieur de la rétine (Figure 1). Notre méthode maintient les relations spatiales tout en produisant des sections suffisamment fines (<20 μm) pour les outils de biologie spatiale de grande dimension, comme validé par une mise en œuvre réussie avec un RNAscope manuel (12 cibles) et la plateforme automatisée Xenium (300 cibles), démontrant la compatibilité entre différentes échelles de complexité de l’analyse moléculaire.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément et avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) et des directives institutionnelles pertinentes approuvant ces méthodes supervisées par l’Université du Colorado. Toutes les étapes liées à l’utilisation d’animaux et à l’euthanasie doivent respecter les réglementations locales et les permis expérimentaux. Toutes les souris ont été hébergées avec des soins standard dans un établissement vétérinaire accrédité avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau. Cette technique de cryosectionnement en face s’appuie sur les techniques standard de dissection rétinienne optimisées pour les souris C57BL/6. Pour développer cette technique, environ 150 souris des deux sexes, âgées de 6 semaines à 2 ans, ont été utilisées. La technique finale communiquée ici a un taux de réussite d’environ 95 %, quelles que soient les caractéristiques démographiques de la souris. Notez que si une température n’est pas indiquée pour une étape, une température ambiante d’environ 20-25 °C est prévue. Les solutions sans température indiquée fonctionneront si elles sont réfrigérées et la plage de température de fonctionnement des solutions est donc de 4 à 25 °C.

1. Dissection

1. Anesthésie la souris avec de l’isoflurane et valide l’anesthésie avec pincement des orteils, ou suivez les règles et réglementations locales pour induire et confirmer l’anesthésie, car d’autres méthodes sont tout aussi appropriées.
2. Euthanasier la souris par luxation cervicale : fixez la tête de la souris d’une main et la base de la queue de l’autre, puis tirez dans des directions opposées. Effectuer l’euthanasie secondaire par décapitation.
3. Marquez le pôle temporal du globe sur la cornée pour maintenir l’orientation et créer un point faible pour la dissection (Figure 2B et Figure 3A).
4. Immergez le globe dans la solution d’Ames dans une parabole contenant un morceau de papier filtre (plus grand que le globe mais plus petit que la parabole).
   REMARQUE : L’utilisation de solutions autres qu’Ames entraînera une détérioration de la rétine (Figure 4A).
5. À l’aide d’une pince #5 tranchante et de ciseaux à iris, retirez soigneusement toute la musculature, le fascia, le système vasculaire et les nerfs du globe (figures 2E, F et 3B) sans percer la sclérotique (figure 2D).
   REMARQUE : La perforation de la sclérotique au cours de cette étape (Figure 4B) entraînera une hernie tissulaire (Figure 4C).
6. Positionnez la pointe d’une lame de ciseau d’iris perpendiculairement à la marque cornéenne, avec des ciseaux parallèles à la tête du nerf optique. Percez le globe à cette position (Figure 3C,D).
7. Faites une seule incision nette à travers la cornée et le limbe, en continuant dans la sclérotique et la rétine vers la tête du nerf optique (Figure 3E).
   REMARQUE : Ne coupez pas la tête du nerf optique ou la sclérotique et la rétine se sépareront. La longueur exacte de cette incision variera en fonction de la taille du globe, qui peut varier considérablement entre les animaux âgés et les jeunes animaux, ainsi que dans certaines lignées Cre par rapport aux animaux de type sauvage. Nous recommandons de laisser environ 1 mm de tissu entre l’étendue la plus profonde de cette incision et la tête du nerf optique.
8. Positionnez la lame perpendiculairement à la coupe initiale (figures 3F, G), à environ 1 mm en arrière du limbe (figure 2C). Commencez à couper radialement à travers la sclérotique et la rétine.
   1. Maintenez une ligne de coupe cohérente en arrière et parallèle au limbe en utilisant des pinces tranchantes pour guider et faire pivoter le globe. Bien qu’il soit idéal de minimiser les coupes, privilégiez le maintien d’une trajectoire radiale propre. Si la rétine et la sclérotique se séparent, repositionnez la lame de ciseau de l’iris pour les couper ensemble.
      REMARQUE : La coupe dans le limbe peut provoquer une séparation rétinienne de la sclérotique lors de l’extraction du cristallin. Les petites cisailles et rotations sont acceptables. Évitez d’appliquer une force pour le fixer, car cela risque de provoquer une hernie rétinienne.
   2. Estimez la distance postérieure de 1 mm à l’aide de la largeur médiane de la lame de ciseaux de l’iris. En cas d’incertitude, optez pour une position plus postérieure, car la connexion de la rétine au limbe se courbe vers l’intérieur. Une coupe plus postérieure facilite l’extraction rétinienne plate.
9. Après avoir terminé la coupe radiale parallèle au limbe, inspectez les connexions rétiniennes restantes. Coupez-les soigneusement avec des ciseaux à iris jusqu’à ce que les sections antérieure et postérieure du globe soient séparées.
10. À l’aide de deux paires de pinces #5 tranchantes, séparez doucement les parties antérieure et postérieure du globe (figure 3H). Chez les souris plus âgées, des fibres transparentes peuvent relier le cristallin à la cupule rétinienne ; Séparez-les soigneusement avec des ciseaux à iris tout en minimisant la séparation rétinienne-sclérale.
    REMARQUE : La lentille doit rester attachée au limbe et à la cornée.
11. À l’aide du papier filtre comme plate-forme de support, découpez la rétine en forme de feuille de trèfle (également connue sous le nom de croix de fer) avec des ciseaux à iris (Figure 3I-K).
    REMARQUE : Les incisions de la feuille de trèfle doivent être plus courtes que l’incision d’orientation primaire initialement pratiquée à travers le limbe si l’orientation de l’enregistrement avec cette tranche est souhaitée. Nous recommandons de réduire la taille de ces trois nouvelles incisions radiales pour qu’elle soit d’environ 1 à 2 mm plus courte que l’incision primaire. Si une caractéristique différente, comme le gradient d’opsine, est utilisée pour l’orientation, il convient que toutes les incisions soient de la même longueur tout en conservant toujours environ 1 mm de tissu entre la partie la plus profonde de l’incision et la tête du nerf optique pour éviter la séparation de la rétine et de la sclérotique.
12. Répétez la dissection avec le deuxième œil. Pour minimiser la nécrose, ablation complète de la chambre antérieure du deuxième œil dans les 10 minutes suivant l’euthanasie.

2. Cryoconservation

1. Préparez une pipette de transfert en plastique jetable en coupant l’extrémité pour créer une ouverture plus grande que la rétine et la sclérotique disséquées (ci-après appelées rétine).
2. Aspirez doucement la rétine dans la pipette et déposez-la sur une lame de microscope en verre. À l’aide d’une lingette de laboratoire, retirez soigneusement l’excès de solution Ames autour de la rétine jusqu’à ce qu’il ne puisse plus flotter librement et puisse être aplati.
3. À l’aide de deux pinces #5 tranchantes, dépliez la rétine et positionnez-la à plat avec l’œilleton intérieur vers le haut. Selon la taille du tissu, faites des coupes en relief de 0,5 à 2 mm dans chaque segment de trèfle pour aplatir davantage la rétine, en ajustant soigneusement le tissu pour éviter le pliage (Figure 5A). Retirez la solution d’Ames supplémentaire jusqu’à ce que le liquide reste uniquement adjacent à la rétine.
4. À l’aide d’une lamelle, appuyez rapidement sur la rétine et transférez-la (figure 5B) avec le liquide qui l’entoure de sorte que la sclérotique externe soit tournée vers le haut et que l’œilleton interne entre en contact avec la lamelle, c’est-à-dire que les cellules ganglionnaires de la rétine soient orientées vers le haut (figure 5C).
5. Vérifiez que la rétine n’est pas pliée et effectuez les ajustements nécessaires ; ajoutez la solution Ames pour faciliter la manipulation. Comme l’excès de liquide provoquera la courbure du tissu, utilisez une lingette de laboratoire pour enlever tout excès de solution Ames et laissez la rétine sécher à l’air libre pendant 5 à 10 secondes.
   REMARQUE : Le fait de ne pas permettre un bref séchage à l’air peut entraîner de manière aléatoire la séparation des tissus et de l’OCT pendant la cryosection. Un séchage excessif à l’air peut entraîner des lésions tissulaires liées aux cristaux de sel.
6. Appliquez un milieu OCT pour couvrir la rétine et utilisez une pince pour répartir cette couche uniformément sur la lamelle, empêchant ainsi la flottaison rétinienne. Attendez 30 s pour que le milieu OCT pénètre dans la rétine.
7. Congeler la rétine en OCT (Figure 5D) à l’aide d’une plaque métallique refroidie indirectement avec de la vapeur d’azote liquide ou en la mettant en contact direct avec de la glace sèche.
8. Conservez les rétines sur de la glace sèche si vous l’utilisez immédiatement, ou dans un congélateur à -80 °C dans un sac en plastique ou un récipient contenant des déshydratants si vous le stockez à long terme.

3. Cryosectionnement

1. Réglez la chambre du cryostat à -18 °C et la platine à -12 °C. Placez la rétine dans la chambre pour l’équilibrer en fonction de la température.
2. Créez un dôme OCT sur le mandrin d’échantillon. Si vous utilisez le même modèle de cryostat, assurez-vous que ce dôme occupe les 2-3 anneaux intérieurs. Une fois congelé, coupez le dôme OCT pour créer une surface de scène plane parallèle à la lame sur le mandrin afin de conserver la planéité laminaire (Figure 6A).
3. Créez ou notez le guide d’orientation reliant le mandrin à l’étage du cryostat.
   REMARQUE : Sur le modèle de cryostat que nous recommandons, le guide d’orientation est une ligne centrale gravée en position 12 heures au-dessus du support de mandrin, tandis que le mandrin lui-même a une découpe triangulaire sur l’anneau le plus externe. Ensemble, nous nous référons à ces caractéristiques comme le guide d’orientation. Si votre cryostat n’a pas de telles caractéristiques, nous vous recommandons d’utiliser un marqueur permanent pour fabriquer le vôtre.
4. Préparez la rétine pour le transfert à l’aide d’une lame de rasoir en enlevant l’excès d’OCT entourant la rétine latéralement, puis en séparant soigneusement la rétine de la lamelle pour la rendre mobile.
5. Retirez le mandrin de la platine et appliquez une petite goutte de liquide OCT sur la surface plate de la platine OCT préparée.
6. À l’aide d’une lame en verre pré-refroidie (-18 °C), appuyez et maintenez la rétine contre la platine OCT pendant 10 à 30 s jusqu’à ce qu’elle soit congelée.
7. Appliquez un OCT supplémentaire sur la rétine et la platine pour assurer une liaison complète. Congelez sur la zone de congélation rapide du cryostat. Incuber l’étage rétinien/OCT dans le cryostat pendant au moins 30 minutes pour assurer une liaison complète.
8. Commencer la coupe :
   1. Coupez soigneusement l’excès d’OCT jusqu’à ce que la rétine devienne visible (Figure 6B). Utilisez la lame de rasoir pour enlever l’excès d’OCT sur les bords des blocs.
      REMARQUE : Rétractez toujours la platine avant de reprendre le sectionnement après tout rognage radial manuel. Pour couper les tranches en face, nous recommandons d’utiliser la même épaisseur de coupe que celle utilisée pour les sections souhaitées ; Cependant, l’épaisseur de coupe peut être comprise entre 10 μm et 100 μm selon les préférences de l’utilisateur.
   2. Continuez à tailler tout en inspectant les sections pour détecter la présence de sclères. Lorsque la sclérotique est visible, ajustez l’angle de la platine au besoin. Continuez à tailler jusqu’à ce que les sections présentent une distribution égale de la sclérotique, ce qui assure une planéité optimale et une surface maximale de trèfle dans chaque section.
   3. Prélever des coupes de tissus (figure 6C).
      REMARQUE : L’épaisseur optimale dépendra de l’essai final effectué et doit respecter ce protocole en aval. Par exemple, si l’on utilise du xenium 10X, nous recommandons des sections de 20 μm d’épaisseur. Alors que pour le Visium 10X, des sections de 15 μm d’épaisseur sont plus appropriées.
   4. Utilisez des lames pré-refroidies et manipulez les sections en position à l’aide de deux pinceaux.
   5. Placez un doigt sous la section jusqu’à ce que l’OCT fonde et que le tissu adhère (environ 5 s).
   6. Remettez la lame sur une surface froide pour la recongélation des tissus.
      REMARQUE : Lors de la collecte de sections dans de petites zones (p. ex., pour le xenium), plusieurs cycles de gel-dégel peuvent être nécessaires. Bien que cela n’affecte pas les techniques basées sur des sondes, cela peut avoir un impact sur la qualité de l’ARN pour les approches de séquençage non biaisées.
9. Stockez les lames sur de la glace carbonique pour une utilisation immédiate, à -20 °C pour le RNAscope le lendemain et à -80 °C pour un stockage à long terme.

4. Détection de cible et microscopie

REMARQUE : Bien que la technique soit compatible avec d’autres méthodes de profilage moléculaire, nous détaillons le RNAscope à titre d’exemple validé.

1. Préparation de l’échantillon :
   1. Retirez les lames de l’entreposage à -80 °C et réchauffez-les à -20 °C pendant 1 h.
      REMARQUE : Les lames peuvent être conservées à -20 °C jusqu’à 12 h avant de commencer le reste de cette procédure, mais ne doivent pas être laissées à -20 °C trop longtemps pour minimiser la dégradation de l’ARN.
2. Chauffez rapidement les lames à 37 °C pendant 10 s.
3. Fixez le tissu en immergeant les lames dans du PFA frais à 4 % pendant 30 min à température ambiante.
4. Lavez soigneusement les lames avec 1x PBS.
5. Déshydratation tissulaire par la série d’éthanol : 50 % d’éthanol pendant 5 min, 70 % d’éthanol pendant 5 min, 100 % d’éthanol pendant 5 min, 100 % d’éthanol frais pendant 5 min.
   REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique de contrôle de la qualité pour le montage des tissus. Si le décollement des tissus se produit pendant la déshydratation, cela indique un chevauchement des OCT avec les sections adjacentes pendant le montage. Une coupe soigneuse de l’excès d’OCT lors du sectionnement et du montage permet d’éviter ce problème.
6. Préparation barrière :
   1. Faites sécher les lames à l’air libre sur la paillasse pendant 5 minutes à température ambiante.
   2. À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, tracez une barrière autour de chaque section de tissu. Laissez la barrière sécher complètement pendant 5 minutes à température ambiante.
7. Détection moléculaire :
   1. Appliquez le traitement Protéase IV pour la perméabilisation des tissus.
   2. Procéder avec le protocole du fabricant pour l’hybridation de la sonde cible (2 h à 40 °C), les étapes d’amplification du signal (trois amplificateurs séquentiels), la détection des fluorophores (quatre tours séquentiels pour la coloration triple-plex).
8. Imagerie:
   1. Effectuez une contre-coloration nucléaire DAPI avant chaque montage de verre de couverture.
   2. Montez le couvre-objet à l’aide d’un support de montage anti-évanouissement.
   3. Image à l’aide de la microscopie à fluorescence avec des jeux de filtres appropriés.
   4. Pour la détection multiplex, capturez le même champ sur les quatre cycles de détection pour le recalage informatique.
   5. Maintenez des paramètres d’exposition cohérents entre les tours pour une comparaison précise des signaux.
      REMARQUE : Pour plus de détails sur la mise en œuvre du RNAscope, reportez-vous aux protocoles du fabricant (voir le tableau des matériaux). Pour les plates-formes entièrement automatisées comme Xenium, suivez exactement toutes les étapes de protocole du fabricant comme indiqué. Pour tous les protocoles, il faut s’attendre à ce qu’une défaillance due au décollement des tissus se produise très probablement lors d’une déshydratation précoce ou d’une étape de lavage, en raison du chevauchement de l’OCT, comme indiqué dans cet exemple de protocole.

Résultats

La mise en œuvre réussie de ce protocole produit des coupes rétiniennes intactes adaptées à de multiples approches de profilage moléculaire tout en maintenant des relations spatiales à travers la surface rétinienne. Nous démontrons l’utilité du protocole par une approche de validation systématique, allant de l’immunohistochimie conventionnelle au profilage moléculaire automatisé à haut débit en passant par la détection manuelle d’ARN multiplex.

La validation initiale de notre protocol...

Discussion

La méthode présentée ici s’attaque à un obstacle technique critique en biologie spatiale rétinienne en permettant la production de fines sections en face adaptées aux technologies modernes de profilage moléculaire. Les étapes les plus critiques du protocole concernent la manipulation des tissus lors de la dissection initiale et le contrôle précis de la température et de l’hydratation pendant la cryoconservation et la section. La réussite de la mise en œuvre repose en particulier...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ames&prime ; Moyen	Sigma-Aldrich	A1420-10X1L	Marque spécifique non importante
Beadsmith Thread Zap, Thread Burner	The Beadsmith Store	7.90524E+11	D’autres cautériseurs peuvent être utilisés
Cryostat	Leica	cm1950	Les considérations importantes sont le volume contrôlable séparément par rapport à la température de la scène.
Glace sèche	NA	NA	NA Fine
Science Tools Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools 1129500	NC9889584	Marque spécifique non importante
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Marque spécifique non importante
Fisherbrand Pince à épiler / pince haute précision droite mince à pointe fine	Fisher Scientific	12-000-127	Marque spécifique non importante
Fisherbrand Ciseaux de dissection standard	Fisher Scientific	08-951-20	Marque spécifique non importante
Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscope	Fisher Scientific	22-037-246	Marque spécifique non importante
Integra Miltex Noyes Ciseaux à iris	Integra Miltex 181510	12-460-278	Marque spécifique non importante
Olympus IX81 microscope			Pour Figure 7
RNAscope HiPlex	ACDBio
Lunettes de couverture rectangulaires	Fisher Scientific	12-541-033	Marque spécifique non importante
Bicarbonate	de sodium Sigma-Aldrich S6014-25G		Marque spécifique non importante
Thermo Scientific Nunc Plats à fond en verre	Fisher Scientifique	12-567-400	Marque spécifique non importante
World Precision Instrument Microscope trinoculaire stéréo de précision (IV) sur support de perche	World Precision Instrument PZMTIVBS	50-253-8607	Marque spécifique non importante
Zeiss Axio Imager.M2 microscope à épifluorescence  ;			Section optique activée (pour la figure 8)