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Article de méthode

Spatule Montevideo Dispositif pour la vitrification d’embryons de mammifères

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DOI :

10.3791/68176

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6 juin 2025

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1Laboratory Animal Biotechnology Unit, Institut Pasteur de Montevideo, 2Centro de Esterilidad Montevideo, 3Fundación IRAUy, Instituto de Reproducción Animal de Uruguay

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons le protocole Spatula Montevideo pour vitrifier les embryons préimplantatoires de souris et de moutons, composé d’une spatule faite maison et utilisant des solutions faites maison. Les embryons sont rapidement équilibrés dans deux solutions cryoprotectrices de concentration croissante, chargés sur la spatule, immergés dans de l’azote liquide et enfin scellés avec une paille de 0,5 ml.

Résumé

Cette étude décrit une méthode de vitrification efficace et rentable pour la cryoconservation d’embryons de souris et de moutons, connue sous le nom de Spatula Montevideo (MVD). Ce protocole utilise une spatule faite maison comme dispositif de transport, qui est préparé avec une pointe de chargement de gel. Les embryons sont rapidement équilibrés dans deux solutions cryoprotectrices faites maison de concentration croissante, chargées dans la spatule, puis directement immergées dans de l’azote liquide. Environ 30 à 40 embryons de souris au stade préimplantatoire peuvent être chargés sur la spatule, qui est ensuite scellée avec une paille de 0,5 ml. L’utilisation de spatules au lieu de cryotubes, qui sont fréquemment utilisés pour stocker des embryons vitrifiés, optimise l’espace dans les dewars d’azote liquide. De plus, le processus de réchauffement ne nécessite qu’une solution de saccharose maison de concentration décroissante pour réhydrater les embryons et restaurer leur morphologie. Depuis plus de 10 ans, notre laboratoire utilise avec succès la Spatule Montevideo pour les embryons préimplantatoires de souris et de moutons. La Spatula Montevideo a démontré un taux de récupération moyen (embryons récupérés/vitrifiés) de 84 % et un taux de survie (embryons viables/récupérés) de 97 % chez les embryons de souris. La vitrification des embryons murins a donné de meilleurs résultats que la congélation lente, bien qu’aucune différence n’ait été observée dans les résultats reproductifs (grossesse, accouchement et taux de natalité). Chez les embryons de mouton, des taux de survie et de développement embryonnaire similaires ont été obtenus avec Spatula Montevideo par rapport à un dispositif commercial. Bien que le taux de gestation ait été plus élevé pour le dispositif commercial, le taux de survie des agneaux n’était pas significativement différent entre les dispositifs. La méthode de vitrification Spatula Montevideo est une technique de cryoconservation simple qui peut être utilisée pour stocker des embryons surnuméraires, sauvegarder des lignées de souris génétiquement modifiées et des modèles de moutons, et faciliter leur échange entre les chercheurs du monde entier.

Introduction

L’efficacité de la génération d’animaux génétiquement modifiés (GM) a considérablement augmenté en raison du développement de méthodes basées sur l’endonucléase, en particulier CRISPR/Cas9. De nombreux laboratoires dans le monde produisent diverses lignées de souris et de rats génétiquement modifiés qui doivent être cryopréservées pour empêcher la dérive génétique et maintenir l’intégrité du phénotype1 d’origine. De plus, l’archivage élimine la nécessité d’un élevage constant, ce qui entraîne souvent un nombre excessif d’animaux. Certains laboratoires envoient des lignées de souris génétiquement modifiées sous forme d’embryons ou de spermatozoïdes cryoconservés à des dépôts internationaux, facilitant ainsi l’échange de ces modèles tout en évitant le transport d’animaux vivants. Cela garantit l’accessibilité aux lignes sans la génération répétitive de modèles d’animaux génétiquement modifiésidentiques 2. Pour ces raisons, la cryoconservation des embryons et des spermatozoïdes est primordiale dans toute animalerie génétiquement modifiée. En général, la cryoconservation d’embryons est préférée pour le stockage des lignées GM, car les embryons contiennent le génome diploïde complet avec des modifications et peuvent être facilement récupérés par transfert d’embryons.

La vitrification est un processus de non-équilibre caractérisé par un déséquilibre entre l’eau qui pénètre dans la cellule et l’eau qui forme des cristaux extracellulaires autour d’elle. Cette méthode empêche la formation de cristaux de glace intracellulaires, ce qui la distingue de la méthode de congélation lente (SLF)3 (voir Figure 1). La forte concentration de cryoprotecteurs et le contact direct avec l’azote liquide (LN2) permettent un refroidissement ultra-rapide (~40 °C/s), permettant d’obtenir un état vitreux des échantillons en quelques secondes. De plus, la vitrification est plus rapide, plus facile et moins coûteuse que la congélation lente4. Il nécessite un minimum de LN2 et utilise généralement un équipement simple qui peut être acheté dans le commerce ou fait maison5 (voir Figure 1).

De plus, le processus de réchauffement est généralement rapide et reproductible. Elle doit être réalisée rapidement pour éviter la toxicité cryoprotectrice et maintenir l’état vitré3. Lors de la congélation d’embryons, de nombreux laboratoires tiennent compte de la commodité du dispositif porteur, de sa fiabilité, de sa robustesse, de sa capacité de conservation et de ses coûts.

Nous privilégions la méthode de vitrification à la spatule à volume minimum pour la cryoconservation de routine d’embryons de moutons et de souris, à l’aide du dispositif Spatula Montevideo (MVD)6. Initialement, nous avons utilisé la méthode de congélation lente7 , mais nous sommes rapidement passés à la vitrification. Pour créer un dispositif plus simple et plus peu encombrant pour le dewar LN2 , nous avons modifié la spatule faite maison de Tsang et Chow (2009)8, qui est branchée sur un cryotube, pour développer la spatule MVD qui est scellée avec une paille de 0,5 mL (voir le tableau des matériaux). La spatule est dotée d’une pointe de chargement de gel (voir tableau des matériaux), où une plate-forme d’environ 1 mm² est formée en faisant fondre doucement la pointe avec une pince fine, créant ainsi une plaque en forme de pétale pour le chargement des embryons. Cette plate-forme peut accueillir jusqu’à 40 embryons de souris dans une petite goutte de vitrification. Une tige de bouchon d’identification (voir tableau des matériaux) est insérée dans l’extrémité ouverte de l’embout du chargeur de gel.

L’objectif de cette méthode est de vitrifier les embryons de manière simple, rapide et peu coûteuse qui, en outre, permet de gagner de la place dans le dewar de l’azote. Ce système est utilisé avec succès depuis de nombreuses années, offrant d’excellents taux de survie embryonnaire (~97 %) et de résultats reproductifs, en particulier chez les embryons de souris. Étant donné que la spatule MVD est préparée en laboratoire, il s’agit d’une méthode peu coûteuse par rapport aux dispositifs commerciaux9. De plus, il permet de gagner de la place dans le dewar d’azote par rapport à l’utilisation de cryotubes 8,10.

figure-introduction-1
Figure 1 : Comparaison des deux principales techniques utilisées pour la cryoconservation d’embryons. Cette figure a été modifiée avec la permission de Crispo et al.1. Créé en BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

Les animaux utilisés pour obtenir des embryons de souris ont été hébergés et manipulés conformément à la législation nationale 18.611 et aux directives internationales en matière de soins aux animaux11. Le protocole expérimental (permis n° #007-18) a été opportunément approuvé par la Commission de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut Pasteur de Montevideo (accord écrit). Les protocoles expérimentaux pour les ovocytes/embryons de moutons ont été approuvés par le Comité Institutionnel de Protection des Animaux Fundación IRAUy (protocole #001-2017), conformément aux directives ARRIVE12 et ont été réalisés conformément aux directives internationales de protection des animaux11.

1. Vitrification (Figure 2)

  1. Préparation de la spatule MVD
    1. Raccourcissez l’embout du gel-loader (voir tableau des matériaux) en coupant les premiers 10 mm et le cône de l’embout.
      REMARQUE : Cela crée une pointe plus courte et droite, facilitant le scellement final avec la paille de 0,5 mL (voir le tableau des matériaux).
    2. Tenez l’extrémité de l’embout du chargeur de gel à l’aide de la pince d’horloger #5 (voir Tableau des matériaux) à environ 1,0 cm de l’embout. Placez doucement la pointe dans la flamme d’un bec Bunsen (voir le tableau des matériaux) et maintenez-la enfoncée pendant 8 à 10 s pour former une plate-forme en forme de pétale d’environ 1 mm2.
    3. Retirer du feu et maintenir fermement avec la pince pendant 5 s.
    4. À l’aide d’un stéréomicroscope (voir Tableau des matières), vérifiez que la plate-forme en forme de pétale (~ 1 mm2) est formée et que le bord distal est scellé.
      REMARQUE : La plate-forme doit être fermée à l’extrémité distale pour éviter l’infiltration de LN2 pendant la vitrification. Assurez-vous que la plate-forme est propre et exempte de fils de plastique. S’il est trop petit ou s’il a des fils, coupez la pointe et répétez la procédure.
    5. Répétez les étapes 1.1.1 à 1.1.4 pour préparer le nombre nécessaire de spatules (1 spatule = jusqu’à 40 embryons de souris).
    6. Stérilisez les spatules à l’aide de rayons ultraviolets (UV) ou d’oxyde d’éthylène et rangez-les dans un tube ou une boîte stérile.
    7. Le jour de la vitrification, récupérez les spatules en les manipulant par l’extrémité opposée de la plate-forme. Insérez une tige d’identification (voir tableau des matériaux) dans chaque spatule et placez-les sur la base du stéréomicroscope. Étiquetez la tige avec un marqueur permanent ou une étiquette autocollante résistante à l’azote liquide.
      REMARQUE : Évitez toujours de toucher la plate-forme lorsque vous manipulez les spatules. La longueur totale de l’appareil complet (spatule + paille de 0,5 mL + tige d’identification) ne doit pas dépasser plus de 1 cm de la longueur du gobelet.
  2. Préparation des solutions de vitrification
    1. Préparez la solution FS : Dissoudre 1,5 g de milieu à gradient de densité (voir le tableau des matériaux) et 0,85 g de saccharose (voir le tableau des matériaux) dans 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; voir le tableau des matériaux). Chauffer au bain-marie jusqu’à dissolution complète, puis stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE : Cette solution peut être conservée à 4 °C jusqu’à 6 mois.
    2. Préparez la solution de pré-vitrification (PV) : Le jour de la vitrification, mélangez 10 % d’éthylène glycol (voir le tableau des matériaux), 10 % de diméthylsulfoxyde (voir le tableau des matériaux) et 80 % de milieu M2 (voir le tableau des matériaux). Un volume total de 100 μL est nécessaire pour 5 spatules.
    3. Préparez la solution de vitrification (V) : Le jour de la vitrification, mélangez 15 % d’éthylène glycol, 15 % de diméthylsulfoxyde, 10 % de milieu M2 et 60 % de solution FS. Un volume total de 100 μL est nécessaire pour 5 spatules.
  3. Processus de déshydratation et de vitrification de l’embryon
    1. Préparez le LN2 : Versez le LN2 dans un récipient approprié (par exemple, un récipient isolé en polystyrène de 10 cm x 30 cm x 20 cm) et placez autant de pailles de 0,5 ml que de spatules à utiliser.
      REMARQUE : Pour faciliter la visualisation de la plate-forme de la spatule lors de la manipulation sous LN2, il est suggéré d’utiliser un récipient en polystyrène coloré isolé par le fond pour créer un effet de contraste.
      ATTENTION : Portez des lunettes et des gants appropriés (voir le tableau des matériaux) lors de la manipulation du LN2.
    2. Préparez les solutions : Sur une boîte de Pétri en plastique de 100 mm (voir le tableau des matériaux), placez les gouttes suivantes : 100 μL de M2, 20 μL de solution PV et 20 μL de solution V pour chaque spatule.
    3. Vitrifier les embryons : Placer les embryons à vitrifier dans la goutte M2. Manipulez 30 à 40 embryons à la fois, en les incubant dans la goutte de solution PV pendant 30 secondes, puis dans la solution en V pendant 30 secondes supplémentaires à température ambiante (RT).
    4. Utilisez un capillaire en verre tiré (voir le tableau des matériaux) avec un ensemble de tube d’aspirateur (voir le tableau des matériaux). Préchargez le capillaire avec au moins 1 μL de la solution correspondante avant de placer les embryons.
      REMARQUE : Les embryons seront à différentes hauteurs dans les gouttes, alors ajustez le micromètre du stéréomicroscope pour les localiser. Récupérez les embryons de chaque goutte lorsqu’il reste 10 s. Toutes les manipulations d’embryons doivent être effectuées au stéréomicroscope.
    5. Chargez les embryons : Aspirez les embryons à l’aide d’une solution minimale en V (par exemple, ~ 0,1 μL) et placez-les rapidement sur la plate-forme de la spatule.
    6. Immersion dans LN2 : Après le chargement des embryons, immergez immédiatement la plate-forme de la spatule dans LN2 pendant 5 s (en tenant la spatule à la main, par sa tige). Ensuite, tout en maintenant la spatule dans des vapeurs LN2 , scellez-la avec une paille de 0,5 mL à l’aide d’une longue pince à épiler en inox (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE : Retirez LN2 de la paille avant de sceller pour éviter la dilatation pendant le réchauffement. Assurez-vous que la spatule et la paille sont correctement alignées pour éviter tout contact entre la goutte d’embryon et la paroi de la paille. Pour plus de commodité, les spatules scellées peuvent rester dans le récipient LN2 jusqu’à ce que toutes les spatules soient chargées d’embryons, en les remplissant de LN2 si nécessaire.
    7. Répéter la procédure : Répéter les étapes 1.3.3 à 1.3.7 pour chaque groupe d’embryons, en utilisant une nouvelle paire de gouttes PV et V.
    8. Stockage : Transférez les spatules dans des gobelets (voir Tableau des matériaux) puis dans un dewar de stockage LN2 (voir Tableau des matériaux).

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Figure 2 : Schéma du processus de vitrification à l’aide de Spatula MVD. Voir le texte pour plus de détails. Créé dans BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Réchauffement (figure 3)

  1. Préparation de la solution
    1. Préparez une solution de saccharose à 1 M en dissolvant 0,85 g de saccharose dans 2,5 ml de milieu M2. Stérilisez la solution avec un filtre de 0,22 μm.
      REMARQUE : Cette solution peut être préparée et conservée à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
    2. Préparez des solutions de saccharose 0,5 M et 0,25 M en diluant la solution de saccharose 1 M avec le volume approprié de milieu M2.
    3. Maintenir les solutions de saccharose à 37 °C sur une plaque chauffante (voir Tableaux des matières) jusqu’à ce que le réchauffement commence.
  2. Préparation de la plaque chauffante
    1. Sur une boîte de Pétri en plastique de 100 mm, placez les gouttes de solution suivantes : une goutte de 500 μL de saccharose 0,5 M, une goutte de 50 μL de saccharose 0,5 M et une goutte de 50 μL de saccharose 0,25 M pour chaque spatule à réchauffer. Placez trois gouttes de milieu M2 (100 μL chacune) pour le lavage.
  3. Processus de réchauffement
    REMARQUE : Le processus de réchauffement a lieu à RT, par exemple 20-22 °C sur la base d’un stéréomicroscope.
    1. Récupérez les spatules scellées du dewar. Placez-les dans un récipient approprié avec LN2. Voir la figure 3.
    2. Placez la plaque chauffante sur le stéréomicroscope. Un à la fois, tenez la base de la spatule à l’aide d’une pince à épiler en acier inoxydable et, d’une main gantée, retirez la tige d’identification, puis la paille. Trempez rapidement la plate-forme contenant les embryons dans la goutte de saccharose de 0,5 M de 500 μL.
    3. Assurez-vous que tous les embryons sont tombés dans la goutte ; Si nécessaire, déplacez doucement la spatule pour faciliter leur libération. Chargez les embryons dans un capillaire en verre tiré, placez-les dans la goutte de 50 μL de solution de saccharose 0,5 M et incubez pendant 2 min.
    4. Placez les embryons dans la goutte de 50 μL de solution de saccharose 0,25 M et incubez pendant encore 2 min.
      REMARQUE : Avant de placer les embryons dans chaque solution, préchargez le capillaire avec la solution à utiliser.
    5. Enfin, lavez les embryons trois fois dans différentes gouttes de milieu M2 pour éliminer le saccharose.
    6. Incuber les embryons dans des conditions appropriées à chaque espèce pendant au moins 1 h avant utilisation.

figure-protocol-2
Figure 3 : Schéma du processus de réchauffement de la spatule MVD. Voir le texte pour plus de détails. Créé dans BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Résultats

Nous avons d’abord utilisé la méthode traditionnelle de congélation lente à base de solutions de propylène glycol, de pailles et d’équipements de congélation à vitesse contrôlée7. Cependant, après avoir considéré la méthode de vitrification comme une option potentiellement plus facile et plus rentable, nous avons mené une étude pour comparer les résultats de la congélation lente traditionnelle (SLF) par rapport à la Spatula MVD dans des embryons de souris 8 cellul...

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Discussion

La spatule MVD est un appareil de vitrification facile à assembler, peu coûteux et de volume minimal, doté d’une grande capacité de rétention d’embryons et d’une occupation optimale de l’azote liquide. Cette méthode s’est avérée simple, rapide et robuste. En moyenne, nous avons obtenu non seulement des taux élevés de récupération embryonnaire et de survie des embryons vitrifiés (~90 %), mais également de bons résultats reproductifs lors du transfert d’embryons chez la souris (~80 % de ta...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions Alejo Menchaca pour sa contribution au développement de la Spatula MVD. GS a reçu un financement du programme de troisième cycle en biotechnologie - Facultad de Ciencias - Universidad de la República (https://webmasterbiotecnol.wixsite.com/biotec1) (numéro de subvention : GS 2437 347). GS, MNM et MC ont reçu un financement de FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur (https://focem.mercosur.int/es/) (numéro de subvention : COF 03/11). GS et MC sont membres du Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay. (https://www.anii.org.uy/). Les bailleurs de fonds (Biotechnology Postgraduate Program - Facultad de Ciencias -Universidad de la República ; FOCEM − Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur ; Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay) n’a joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publication ou la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 et micro ; Filtre M  ;Sartorius16534Minisart filtre seringue 0.2 & micro ; L
0,5 mL de pailleMinitube13408/0044Paillette moyenne de type français
Ensemble de tube d’aspirateur  ;SigmaA5177
Bec Bunsen  ;Indulab7000134
DiméthylsulfoxydeSigmaD2650
Éthylène glycol  ;Sigma102466
Ficoll PM70°SigmaF2878Gradient de densité moyen
Pointe du chargeur de gelEppendorf  ;10411193
Capillaire en verre  ;Marienfeld2900000Tube capillaire microhématocrite
Gants pour la manutention LN2Bouclier temporaireRéférence CE0338Cryogants
GobeletsMinitube16913/1133
Lunettes pour la manipulation LN2  ;   ;3M  ; 40661-00000-10Revêtement anti-buée, anti-rayures
Plaque chauffanteLabecLA-SH-II-5BMaquette numérique
Tige d’identification  ;Les technologies IMV6326Non stéroïde LG48 mm
Contenant isotherme en polystyrène
LN2 stockage DewarTaylor-WhartonXT21-AICryoscience
Pinces longues en acier inoxydableOutils scientifiques fins11000-25
M2  ;SigmaRéférence M7167
PBS  ;Fait maisonSaline tamponnée au phosphate. Habituellement, 1 L de tampon concentré 5x est préparé, puis dilué à 1x. Recette : 40 g de chlorure de sodium, 1 g de chlorure de potassium, 7,2 g de phosphate disodique anhydre, 1,2 g de phosphate monopotassique. Ajouter de l’eau distillée et stériliser à l’autoclave.
Boîte de Pétri en plastique  ;Faucon  ;   ; 351029Boîte de Pétri bactériologique non traitée TC
StéréomicroscopeOlympeSZ2-LGB
Saccharose  ;SigmaS1888
horloger' s #5 forceps  ;Outils scientifiques fins11254-20

Références

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