Article de méthode

Amélioration de l’administration et de l’expression de gènes à l’aide de l’injection intraosseuse de plasmides d’éditeur de base d’adénine encapsulés dans des nanoparticules de chitosane

DOI :

10.3791/68181

⸱

16 mai 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons une approche de thérapie génique qui délivre du chitosane enrobé d’ABE directement dans la moelle osseuse par injection intra-osseuse.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’administration de plasmides exogènes à des animaux de laboratoire est cruciale dans la recherche biomédicale, y compris l’étude des fonctions des gènes, l’élucidation des mécanismes de la maladie et l’évaluation de l’efficacité des médicaments. Cependant, l’efficacité de transfection de la méthode actuelle est relativement faible, et l’introduction de plasmides pour l’expression génique à long terme peut être affectée par le système immunitaire. Pour remédier à ces limitations, nous avons développé et étudié une nouvelle méthode qui utilise le chitosane pour encapsuler les plasmides de l’éditeur de base adénine (ABE), puis délivrer directement le complexe à la moelle osseuse de souris par injection intra-osseuse. Dans cette étude, pour cibler le gène δ CaMK II , qui est étroitement lié à la différenciation des ostéoclastes, nous avons utilisé du chitosane pour encapsuler les plasmides ABE CaMK II δ . Nous avons injecté directement la cargaison plasmidique dans la cavité de la moelle osseuse par injection intra-osseuse. Les résultats ont montré une efficacité d’édition in vivo élevée de 14,27 % au locus A1 et de 10,69 % au locus A2 chez les souris receveuses. Cette nouvelle stratégie est non seulement particulièrement adaptée aux maladies causées par une fonction anormale des ostéoclastes, mais présente également un potentiel important pour faire progresser le domaine de la thérapie génique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La thérapie génique est apparue comme une approche prometteuse dans le domaine de la recherche biomédicale 1,2. Il offre la possibilité de traiter une variété de troubles en introduisant des plasmides étrangers chez des animaux de laboratoire pour moduler l’expression de gènes spécifiques et étudier leurs effets thérapeutiques. Cependant, les méthodes d’administration conventionnelles ont rencontré quelques problèmes qui limitent leur efficacité et leur sécurité3. Les préoccupations comprennent une faible efficacité de transfection, des dommages biologiques élevés et une faible efficacité d’expression génique. Par conséquent, il est nécessaire d’établir une nouvelle méthode d’administration pour la thérapie génique qui puisse surmonter ces limitations.

Le chitosane est un polysaccharide naturel avec une bonne biodégradabilité et une biocompatibilité 4,5,6, ce qui le rend facile à dégrader dans le corps des animaux sans provoquer de toxicité biologique grave. Il a été largement utilisé dans l’administration de médicaments en raison de son taux élevé d’intégration de médicaments 7,8, de son efficacité d’administration améliorée et de sa réduction des dommages causés aux animaux.

La technologie d’édition génomique ABE, qui permet la conversion directe de paires de bases de A-T en G-C, est prometteuse dans la recherche génétique et médicale. Par rapport à la technologie d’édition de gènes courante actuelle, la technologie ABE peut réaliser une mutation précise à base unique, réduisant ainsi l’édition de séquences d’ADN non cibles, réduisant les effets hors cible 9,10 et conduisant à zéro cassures double brin d’ADN11, ce qui réduit considérablement le risque d’édition de gènes12. La technologie ABE est également hautement biocompatible et convient mieux à la recherche sur le traitement des maladies.

L’injection dans la veine caudale est une méthode couramment utilisée pour l’administration in vivo de plasmides, en particulier dans la thérapie génique. Le gène cible de cette étude est CaMK II δ, qui est étroitement lié à la différenciation des ostéoclastes13,14. L’utilisation d’une injection intra-osseuse au lieu de la veine de la queue permet au plasmide modifié de pénétrer dans les ostéoclastes directement dans la moelle osseuse. Cette transmission directe à la moelle osseuse augmente l’efficacité et la stabilité de l’expression des gènes, ce qui est avantageux pour le traitement des maladies liées à la dysfonction ostéoclaste.

Ici, nous présentons une nouvelle méthode qui consiste à encapsuler le plasmide ABE avec du chitosane, puis à introduire directement le complexe dans des souris par injection intra-osseuse. Grâce à cette méthode, nous espérons ouvrir la voie à des traitements de thérapie génique plus efficaces pour les plasmides étrangers pénétrant dans les organismes, en particulier les maladies liées à la dysfonction des ostéoclastes.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité de santé animale de l’Université d’Anhui sur l’utilisation et le soin des animaux. Dans cette étude, ABE a été généreusement offert par le professeur Tian Chi (Université des sciences et technologies de Shanghai, Shanghai, Chine ; Figure 1D).

1. Construction du plasmide ABE

  1. Concevez un ARNg avec la séquence TCCATGATGCACAGACAGGA où PAM est présenté par GAC.
  2. Selon le guide de la liste des amorces de l’entreprise, ajoutez l’amorce au volume correspondant de ddH2O pour obtenir une concentration de 100 μM. Ensuite, secouez et mélangez soigneusement pour assurer une répartition uniforme. Pour la réaction de recuit, préparez une solution de 10 μM en ajoutant 10 μL de la solution d’amorce mère dans le nouveau tube de microcentrifugation, 90 μL de ddH2O, et mélangez bien.
  3. Ajouter 5 μL d’amorce en amont, 5 μL d’amorce en aval et 40 μL de ddH2O dans un tube de microcentrifugation. Pour faciliter la réaction de recuit, plongez le tube dans un récipient rempli d’eau bouillante pendant 5 min. Assurez-vous que le niveau d’eau n’atteint pas l’ouverture du tube pour éviter que l’eau ne pénètre et ne contamine les amorces. Refroidir à température ambiante pour terminer la réaction de recuit.
  4. Ajouter 2 μg de pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP (Figure 1D), 1 μL d’ESP3I, 4 μL de tampon et 33 μL de ddH2O dans un tube de microcentrifugation et laisser réagir dans un bain-marie à température constante à 37 °C pendant 45 min.
  5. Effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose. Préparez un gel d’agarose à 1 % en pesant 0,5 g d’agarose et versez-le dans une bouteille en verre. Ajoutez 50 ml de 1 tampon TAE dans le flacon en verre et agitez pour dissoudre la poudre d’agarose. Chauffer au four à micro-ondes pendant 2 minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement fondu. Ajouter 5 μL de colorant de gel d’acide nucléique YeaRed, bien mélanger et verser dans le moule en gel ; Une fois le gel solidifié, commencez à ajouter les échantillons.
    REMARQUE : Pour préparer 1xTAE, utilisez les réactifs indiqués dans le tableau 1.
  6. Ajoutez 1x TAE dans le réservoir d’électrophorèse et mettez dans le bloc de gel d’agarose configuré, qui doit être immergé dans le TAE. Ajouter 5 μL de 1x tampon de chargement au produit de digestion à partir de l’étape 1.4 et mélanger. Ajoutez l’échantillon au gel. De plus, ajoutez également 6 μL de marqueur au gel.
  7. Exécutez le programme d’électrophorèse à une tension constante de 110 V pendant 35 min. Après l’électrophorèse, déterminez la position de la bande dans l’échantillon en fonction du marqueur et coupez la bande de gel avec une lame propre pour la récupération du gel.
  8. Effectuez l’opération de récupération du gel selon les instructions du kit de purification du gel maxi. Réglez un bain-marie à 50 °C. Ajouter le volume correspondant de solution PN dans le tube contenant le gel coupé selon le kit. Piquez le gel avec une pointe de pipette pour faciliter la dissolution puis mettez-le dans le bain-marie. Secouez le tube de temps en temps et observez le processus de dissolution jusqu’à ce que le bloc de gel soit complètement dissous.
  9. Prenez une colonne de rotation, CA3, du kit. Ajoutez 500 μL de solution BL du kit dans la colonne de centrifugation et centrifugez-la à 2 000 x g pendant 1 min pour équilibrer la colonne. Après la centrifugation, retirez les déchets liquides au fond du tube de collecte et remettez la colonne d’adsorption dans le tube de collecte.
  10. Poursuivre la centrifugation à 2 000 x g pendant 1 min. Jeter les déchets liquides au fond du tube de centrifugation, ajouter 600 μL de solution de PN et centrifuger 2 000 x g pendant 30 s ; Jetez à nouveau les déchets liquides. Répétez l’opération et jetez à nouveau les déchets liquides.
  11. Après la centrifugation, remplacez le tube de prélèvement de 2 ml par un nouveau tube de 1,5 ml. Ouvrez le couvercle et laissez sécher dans un endroit aéré pendant 30 min pour retirer complètement l’éthanol. Ensuite, ajoutez 40 μL préchauffés de ddH2O, centrifugez et éluez l’ADN requis.
    REMARQUE : Le PN doit être ajouté avec de l’éthanol anhydre conformément aux instructions. L’utilisation d’eau préchauffée peut augmenter le rendement.
  12. Ajouter 7 μL de produit de recuit de l’étape 1.3, 3 μL de produit de récupération de gel de l’étape 1.11, 1 μL d’ADN ligase T4, 2 μL de tampon 10x T4 Ligase et 7 μL de ddH2O dans un tube de microcentrifugation, et conserver toute la nuit à 16 °C pour obtenir le produit de ligature.
  13. Ajouter 10 μL de produit de ligature et 70 μL de DH5α dans un tube de microcentrifugation sur de la glace pendant 30 min. Réglez le bain-marie à 42 °C. Après le bain de glace, mettez le tube dans le bain-marie pendant 90 s, puis à nouveau sur de la glace pendant 2 min.
  14. Ajouter 600 μL de milieu liquide Luria-Bertani (LB) dans le tube et agiter à l’aide d’un agitateur pendant 30 min. Dans le même temps, irradiez une plaque de fluide solide LB à l’intérieur d’une armoire à flux laminaire pendant 30 min. Après l’incubation, répartissez uniformément 100 μL de la solution sur la plaque. Après l’enrobage, placez la plaque à l’envers dans un incubateur bactérien à 37 °C pour la culture.
    REMARQUE : Le DH5α est généralement stocké à -80 °C. Le milieu solide LB est préparé à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 2. Le milieu liquide LB est préparé à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 3.
  15. Sélectionnez une seule colonie et agrandissez la colonie bactérienne pendant 14 h sur une assiette fraîche. Prenez un tube à centrifuger de 50 ml, ajoutez 50 ml de milieu liquide LB, ajoutez 50 μL d’ampicilline dans un rapport de 1:1000 et mélangez bien. Répartissez-le dans de nouveaux tubes à raison de 15 ml par tube.
  16. Vérifiez la plaque de culture pour les colonies blanches rondes avec une bonne croissance. Sélectionnez-les à l’aide d’une pipette de 10 μL et transférez-les dans le milieu LB. Cultivez-le dans un agitateur pendant 12 h, puis envoyez cet échantillon pour séquençage.
  17. Comparez les résultats du séquençage avec l’ARNg cible pour identifier la souche avec la séquence correspondante, Camk II δ-sgRNA, en tant que souche cible, puis extrayez le plasmide.
  18. Effectuez l’extraction du plasmide selon les instructions du mini kit plasmide. Ajouter 500 μL de BL dans la colonne d’adsorption CP3, centrifuger pendant 1 min à 2 000 x g et jeter les déchets liquides. Remettez la colonne d’adsorption dans le tube de collecte. Ajouter 500 μL de solution bactérienne et centrifuger à 4 000 x g pendant 10 min.
  19. Collectez le flux. Centrifugez à nouveau et, après avoir retiré le surnageant, ajoutez 250 μL de P1 dans le tube de centrifugation avec précipitation bactérienne, puis transférez-le dans un tube de microcentrifugation et un vortex. Ajouter 250 μL de P2 et inverser doucement pour 6x-8x. Ajouter 350 μL de P3 et retourner doucement de nouveau pour 6x-8x. Un précipité floculant blanc apparaît.
  20. Centrifugeuse pendant 10 min à 2 000 x g. Transférez le surnageant dans une nouvelle colonne d’adsorption CP3, centrifugez à 2 000 x g pendant 30 s et éliminez les déchets liquides. Ajouter 600 μL de PW, centrifuger à nouveau à 2 000 x g pendant 30 s et éliminer les déchets liquides. Ajouter à nouveau 600 μL de PW, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et éliminer les déchets liquides.
  21. Placez la colonne d’adsorption dans le tube de collecte et centrifugez pendant 2 min à 2 000 x g pour éliminer les PW résiduels. Ensuite, placez la colonne d’adsorption dans un tube de microcentrifugation propre, laissez-la sécher pendant 30 minutes et ajoutez 35 μL de ddH2O préchauffé au milieu du film d’adsorption, puis stockez le produit obtenu à -20 °C pour les tests ultérieurs.
    REMARQUE : PW doit être ajouté avec de l’éthanol anhydre conformément aux instructions. L’utilisation d’eau préchauffée peut augmenter le rendement.

2. Extraction de cellules de moelle osseuse

  1. Sélectionnez des souris KM âgées de 8 à 9 semaines, mâles et pesant environ 30 g. Fixez les souris dans la main gauche, la tête vers le bas, et injectez 150 μL de pentobarbital sodique à 1 % sur le côté de l’abdomen avec une seringue avec la main droite. Confirmez l’anesthésie par pincement des orteils.
  2. Effectuez une luxation cervicale des souris, retirez le tibia avec des ciseaux chirurgicaux et une pince à épiler, et enlevez l’excès de tissu musculaire environnant. Faites tremper le tibia retiré dans du PBS et lavez-le en ne laissant que des os propres.
  3. Prendre 1 mL de PBS dans une seringue pour rincer les cellules de la moelle osseuse d’une extrémité du tibia jusqu’à ce que l’os soit blanc.
  4. Prélever la suspension cellulaire et centrifuger à 800 x g à 4 °C pendant 5 min. Après avoir éliminé le surnageant, lysez les globules rouges avec 500 μL de lysat de globules rouges. Après 1 min, ajoutez 1 mL de tampon de séparation pour terminer le lysat de globules rouges. Après une centrifugation à 800 x g à 4 °C pendant 5 min, retirez le surnageant et placez les cellules sur de la glace pour une utilisation ultérieure.
    REMARQUE : Si les globules rouges sont complètement lysés, les cellules précipitent et aucun globule rouge n’est visible. Si les globules rouges sont encore visibles, ils peuvent être lysés à nouveau, mais le temps d’incubation ne doit pas être trop long pour éviter d’endommager d’autres cellules.

3. Transfection de chitosane

  1. Préparation de chitosane : Peser 4 mg de chitosane et dissoudre dans 20 mL de solution d’acide acétique à 0,2 mg/mL. Ajustez le pH à 5,5 avec 10 M de NaOH. Prenez 500 μL de cette solution et ajoutez-la dans des tubes de microcentrifugation individuels.
  2. Ajoutez des plasmides ABE de 2 μg, 3 μg, 4 μg et 5 μg dans des tubes individuels et dissolvez-les dans 500 μL de 30 mM Na2SO4. Mélangez 500 μL de solution de chitosane et 500 μL de plasmide.
  3. Incuber au bain-marie à 50-55 °C pendant 15 min. Après avoir bien mélangé les deux solutions, agitez pendant 15 à 30 s et laissez reposer pendant 30 min.
  4. Caractérisation du chitosane : Analyser les diamètres et les potentiels zêta du chitosane à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS), avec une concentration de chitosane maintenue à 0,1 mg/mL dans ddH2O. Analyser chaque échantillon 3x.
  5. Coulez des échantillons à 0,1 mg/mL sur une puce de silicium. Ajouter 20 μL des échantillons remis en suspension dans des grilles de 200 mailles et incuber à température ambiante pendant 10 min. Teindre les grilles avec de l’acide phosphotungstique à 2 % pendant 3 min et retirer le liquide restant avec du papier filtre. Observez avec un microscope électronique à transmission.
  6. Efficacité d’encapsulation des nanoparticules : Filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,1 μm pour éliminer les particules non précipitées. Téléchargez le plasmide et mesurez la concentration avec un spectrophotomètre à 260 nm. Les efficacités calculées du plasmide ABE et du plasmide à ARNg étaient respectivement de 84 % ± 0,37 % et de 85 % ± 0,53 %.
  7. Injectez 100 μL de chitosane incorporé dans le plasmide chez la souris à travers la cavité de la moelle osseuse (étape 5). Après 7 jours d’injection, isolez les cellules de la moelle osseuse et lysez les globules rouges comme décrit à l’étape 2.
  8. Ajouter 2 mL de milieu DMEM contenant du sérum dans des plaques de culture cellulaire à 6 puits et ajouter les cellules de la moelle osseuse (environ 1 x 106) en suspension dans 500 μL de milieu DMEM contenant du sérum. Mesurez l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence. Le plasmide CaMK II δ-sgRNA a une fluorescence rouge TagRFP lorsqu’il est excité à 580 nm (Figure 2B).
    REMARQUE : Le milieu DMEM contenant du sérum est préparé à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 4.

4. Cytométrie en flux

  1. Préparez différentes doses de plasmides ABE : 2 μg, 3 μg, 4 μg et 5 μg, et administrez-les aux souris receveuses comme décrit à l’étape 3. Après 7 jours, isolez les cellules de la moelle osseuse des souris comme décrit à l’étape 3.
  2. Prélever les cellules de la moelle osseuse et centrifuger à 800 x g à 4 °C pendant 5 min. Jetez le surnageant et lysez les globules rouges avec 500 μL de lysat de globules rouges. Après 1 min, terminez la réaction avec 1 mL de tampon de séparation et comptez le nombre de cellules avec un compteur de cellules.
  3. Transvaser 1 x 106 cellules dans un nouveau tube de microcentrifugation et centrifuger avec 800 x g à 4 °C pendant 5 min. Après avoir retiré le surnageant, remettre les cellules en suspension avec 500 μL de PBS et les transférer dans un tube d’écoulement. Mesurez l’efficacité par cytométrie en flux. Préparez un groupe témoin de cytométrie en flux comme décrit à l’étape 2.
    REMARQUE : Les débris cellulaires et les cellules mortes avec les signaux FSC inférieurs et situés dans le coin inférieur gauche du graphique de dispersion FSC par rapport au SSC (moins de 400) ont été exclus (figure 3). Comme les plasmides ont une fluorescence rouge TagRFP, ils peuvent être triés.

5. Injection dans la cavité de la moelle osseuse

  1. Sélectionnez des souris mâles KM âgées de 8 à 9 semaines, pesant environ 30 g. Anesthésiez-les avec une injection intrapéritonéale de 150 μL de Pentobarbital sodique à 1 % (étape 2.1). Confirmez la profondeur de l’anesthésie par pincement des orteils.
  2. Fixez la souris anesthésiée en position couchée sur la table d’opération et fixez le membre avant de la souris avec du ruban adhésif.
  3. Désinfectez le tibia postérieur des souris avec un tampon imbibé d’alcool. Remplissez le plasmide à injecter dans une seringue de 1 ml avec une aiguille de 26 G. Éliminez les bulles d’air et préparez-vous à l’injection.
  4. Touchez le tibia de la souris et maintenez le tibia de la souris avec vos doigts. Déterminez la position de l’aiguille d’injection de manière à ce que la tige tibiale soit pénétrée à partir du plateau tibial au niveau de l’articulation du genou de la souris. Faites pivoter l’aiguille d’injection parallèlement au tibia, enfoncez la cavité de la moelle osseuse et injectez lentement (environ 3 s) pour minimiser les dommages aux souris.
  5. Après l’injection, retirez lentement l’aiguille (environ 3 s) et utilisez immédiatement un tampon imbibé d’alcool pour arrêter le saignement et désinfecter le site de ponction.
  6. Placez doucement les souris dans un environnement chaud (20-26 °C), attendez qu’elles se remettent de l’anesthésie et observez leur récupération.

6. Séquençage de Sanger

  1. Après 7 jours d’injection, prélever des cellules de moelle osseuse de souris comme décrit à l’étape 2 et isoler l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’extraction. Collecter les cellules par centrifugation à 2 000 x g pendant 1 min. Jeter le surnageant, ajouter 200 μL de solution GA et vibrer avec un mélangeur vortex. Ajouter 20 μL de protéinase K et 200 μL de GB, mélanger, puis placer dans un bain-marie à 70 °C pendant 10 min.
  2. Après l’incubation, ajoutez 200 μL d’éthanol anhydre, agitez pendant 15 s, puis placez le liquide mélangé dans la colonne d’adsorption de support. Centrifuger à 2 500 x g pendant 1 min, jeter les déchets liquides au fond du tube et ajouter 500 μL de solution GD. Centrifugez et jetez les déchets liquides, lavez la pastille 2 fois avec du PW, et enfin séchez-la en l’éluant avec 40 μL d’eau pure.
    REMARQUE : PW doit être ajouté avec de l’éthanol anhydre conformément aux instructions.
  3. Amplifiez le gène cible CaMKIIδ par PCR avec la séquence d’amorce directe gctaaggtgataaatgtggcact et la séquence d’amorce inverse de ctagtgtgcgggccagattc. Préparez la réaction de PCR en ajoutant 25 μL de tampon 2x, 1 μL de dNTP Mix, 2 μL d’amorce directe, 2 μL d’amorce inverse, 1 μL d’ADN polymérase, 2 μL d’ADN matrice et 17 μL de ddH2O. Exécutez le programme PCR suivant : 95 °C pendant 3 min, 95 °C pendant 15 s, 53,7 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 60 s, 12 °C pour la conservation de la chaleur.
  4. Après la PCR, préparez un gel d’agarose à 1 % et effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose à 110 V pendant 35 min (étape 1.5, étape 1.6). Coupez la zone de gel cible après l’électrophorèse et envoyez-la pour le séquençage de Sanger (Figure 4).

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des plasmides in vitro ont été injectés à des souris par injection intraosseuse (Figure 1A). La taille moyenne des particules des nanoparticules était d’environ 202,9 nm, le potentiel était de 2,77 mV et le PDI était de 0,22 (Figure 1B). La figure 1C montre la forme de surface des nanoparticules observées comme sphériques par microscopie électronique. La figure 1D

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour la recherche biomédicale, le défi de l’administration de plasmides exogènes aux animaux consiste à améliorer l’efficacité de l’administration et de l’expression des gènes tout en minimisant les dommages causés aux animaux pour obtenir l’effet thérapeutique souhaité15,16. Nous présentons une nouvelle méthode d’injection intraosseuse de plasmide ABE médié par le chitosane dans les cellules de la moelle osseuse de souris receve...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été financé par la Fondation des sciences naturelles de la province d’Anhui (2208085MC74, 2208085MC51) et la Fondation pour la recherche scientifique du Département de l’éducation de la province d’Anhui, Chine (KJ2021A0055).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes PCR de 0,2 ml, bouchon platLABSELECT  ; PT-02-C
Seringue de 1 mLAnhui Jiangnan medical equipment Co., LTD/
1 % de pentobarbital sodique//
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mlLABSELECTRéférence : MCT-001-150
10 & fois ; Tampon de chargement d’ADNVazymeRéf. P022-01
10X T4 DNA Ligase Tampon 1 mlTaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,LTD2011A
1250 &mu ; l Pointe de pipette 102,1 mmLABSELECTRéf. T-001-1250
200 &mu ; l Pointes de pipette 50.55mmLABSELECT  ; Réf. T-001-200
2x Tampon Phanta MaxaVazymeRéf. P505-d1
4 ? centrifugeuseThermo Fisher75002425
Tube à centrifuger de 50 mlLABSELECTRéf. T-012-50
Plaques de culture cellulaire à 6 puitsLABSELECT11110
Agar-agarSangon BiotechA505255-0250
AmpèreAbiowell/
ChitosaneSangon BiotechA600614-0500
Agitateur de culture à température constanteShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LTDZWY-200D
Compteur de cellules automatisé CountessThermo Fisher ScientificComtesse II/II FL
Lames et support de chambre de comptage de cellules Countess, jetablesThermo Fisher ScientificRéf. C10228
Tampon CutSmartBiolabs de la Nouvelle-AngleterreB7204SVIAL
DH5 et alpha ;Biosystèmes générauxCS01010
DMEMgibcoC11995500BT
Mélange dNTPVazymeRéf. P505-d1
Enzyme Esp3INEBiolabsRéf. R0734S
Acide éthylènediaminetétraacétiqueVETEC (sigma-aldrich)V900106
Sérum fœtal bovinOriCellRéférence : FBSAD-01011-500
Cytomètre en fluxBD FACSCalibur342975
Tube d’écoulementBiotechnologie BeyotimeFFC005-1sac
Microscope à fluorescenceLeica427019
Kit de purification Gel MaxiTIANGENDP210
Kit d’extraction d’ADN génomiqueTIANGENDP304
Acide acétique glacialChina National Pharmaceutical Group Corporation10000218
Marqueur d’ADN GoldBand DL2,000OUIRéférence 10501ES60
Machine à glaçonsShanghaizhengqiaoBNS-30Laboratoire réservé
Tampon ImunoSepPrecision Biomedicals Co., LTD604050
Megafuge 8 Petite série de centrifugeuses de paillasseThermo Fisher Scientific75004250
MEMTechnologie de la vie11140050
NanoDrop 2000°Thermo Fisher Scientific, États-Unis
NaOHSIGAMS5881-500G
PBSXiGeneXG3650
Vecteur PCMV-SPRY-ABE8E//
Appareil d’amplification PCRThermo FisherAKC96300441
Pénicilline/Streptomycine  ;SolarbioP1400
PeptoneSangon BiotechA505247-0500
ADN polymérase Phanta Max Super-FidelityVazymeRéf. P505-d1
Lysat de globules rougesBeyotimeRéf. C3702
Chlorure de sodiumChina National Pharmaceutical Group Corporation10019318
Sulfate de sodiumAladinS433911
T-001-10 10&mu ; l Pointes de pipette 31.65mmLABSELECT  ; Réf. T-001-10
T4 ADN ligaseTaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,LTD2011A
TrisBioFroxx1115KG001
TryptoneSangon BiotechA505250-0500
Mélangeur vortexsigmaZ258423
Bain-marieShanghaiyihengDK-80
Teinture en gel d’acide nucléique YeaRedOUIRéférence 10203ES76
Extrait de levureBBIA610961-0500
Zetasizer NanoMalvern PanalyticalZetasizer Nano ZS
&bêta ;-mercaptoéthanol  ;Sigma444203

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ikawa, Y., et al. Gene therapy of hemoglobinopathies: Progress and future challenges. Hum Mol Genet. 28 (R1), R24-R30 (2019).
  2. Ginn, S. L., Mandwie, M., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update. J Gene Med. 26 (8), e3721(2024).
  3. Chen, J., Wang, K., Wu, J., Tian, H., Chen, X. Polycations for gene delivery: Dilemmas and solutions. Bioconjug Chem. 30 (2), 338-349 (2019).
  4. Tong, H., et al. Progress and prospects of chitosan and its derivatives as non-viral gene vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 9 (6), 495-502 (2009).
  5. Alizadeh, L., Zarebkohan, A., Salehi, R., Ajjoolabady, A., Rahmati-Yamchi, M. Chitosan-based nanotherapeutics for ovarian cancer treatment. J Drug Target. 27 (8), 839-852 (2019).
  6. Dimassi, S., Tabary, N., Chai, F., Blanchemain, N., Martel, B. Sulfonated and sulfated chitosan derivatives for biomedical applications: A review. Carbohydr Polym. 202, 382-396 (2018).
  7. Maity, S., Mukhopadhyay, P., Kundu, P. P., Chakraborti, A. S. Alginate coated chitosan core-shell nanoparticles for efficient oral delivery of naringenin in diabetic animals-an in vitro and in vivo approach. Carbohydr Polym. 170, 124-132 (2017).
  8. Abnoos, M., et al. Chitosan-alginate nano-carrier for transdermal delivery of pirfenidone in idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Biol Macromol. 118 (Pt A), 1319-1325 (2018).
  9. Lee, H. K., Smith, H. E., Liu, C., Willi, M., Hennighausen, L. Cytosine base editor 4 but not adenine base editor generates off-target mutations in mouse embryos. Commun Biol. 3 (1), 19(2020).
  10. Lee, S. N., Jang, H. S., Woo, J. S. Heterologous expression and purification of a CRISPR-cas9-based adenine base editor. Methods Mol Biol. 2606, 123-133 (2023).
  11. Tang, J., Lee, T., Sun, T. Single-nucleotide editing: From principle, optimization to application. Hum Mutat. 40 (12), 2171-2183 (2019).
  12. Newby, G. A., et al. Base editing of hematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 595 (7866), 295-302 (2021).
  13. Lu, D. Z., et al. Camkii(δ) regulates osteoclastogenesis through erk, jnk, and p38 mapks and creb signalling pathway. Mol Cell Endocrinol. 508, 110791(2020).
  14. Sato, K., et al. Regulation of osteoclast differentiation and function by the camk-creb pathway. Nat Med. 12 (12), 1410-1416 (2006).
  15. Li, X., et al. Viral vector-based gene therapy. Int J Mol Sci. 24 (9), 7736(2023).
  16. Gonçalves, G. A. R., Paiva, R. M. A. Gene therapy: Advances, challenges and perspectives. Einstein. 15 (3), 369-375 (2017).
  17. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV in clinical trials. Curr Gene Ther. 11 (4), 321-330 (2011).
  18. Mingozzi, F., et al. Cd8(+) t-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med. 13 (4), 419-422 (2007).
  19. Dong, L., Li, Y., Cong, H., Yu, B., Shen, Y. A review of chitosan in gene therapy: Developments and challenges. Carbohydr Polym. 324, 121562(2024).
  20. Rizeq, B. R., Younes, N. N., Rasool, K., Nasrallah, G. K. Synthesis, bioapplications, and toxicity evaluation of chitosan-based nanoparticles. Int J Mol Sci. 20 (22), 5776(2019).
  21. Mansouri, S., et al. Chitosan-DNA nanoparticles as non-viral vectors in gene therapy: Strategies to improve transfection efficacy. Eur J Pharm Biopharm. 57 (1), 1-8 (2004).
  22. Zhou, C., et al. Off-target rna mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature. 571 (7764), 275-278 (2019).
  23. Betzler, B. K., Chee, Y. J. Bin Abd Razak, H.R. Intraosseous injections are safe and effective in knee osteoarthritis: A systematic review. Arthrosc Sports Med Rehabil. 3 (5), e1557-e1567 (2021).
  24. Lin, Y. W., Aplan, P. D. Leukemic transformation. Cancer Biol Ther. 3 (1), 13-20 (2004).

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