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Article de méthode

Fréquence et distribution des croisements dans la méiose de Caenorhabditis elegans par génotypage SNP à l’aide de la PCR en temps réel

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DOI :

10.3791/68183

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11 juillet 2025

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1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit une méthode pour mesurer les fréquences de croisement et la distribution au cours de la méiose chez Caenorhabditis elegans. Le génotypage du polymorphisme mononucléotidique avec PCR en temps réel a été utilisé pour déterminer l’origine des chromosomes. La cartographie en 4 points a permis de déterminer les distributions de croisement des régions du bras gauche, du centre et du bras droit de chaque chromosome.

Résumé

Caenorhabditis elegans est un excellent organisme modèle pour l’étude de la méiose. En plus des avantages généraux, tels qu’un cycle de reproduction court, de nombreuses descendances et un corps transparent pour l’imagerie, il existe six paires de chromosomes holocentriques homologues. Il y a de fortes interférences de croisement et une réglementation de la distribution de croisement. Pour mesurer la fréquence de croisement, la cartographie des marqueurs visibles, la cartographie snip-SNP et la quantification des marqueurs cytologiques en tant que précurseurs de la formation de croisement ont été développées. Ici, nous introduisons une méthode de génotypage SNP modifiée pour mesurer la fréquence et la distribution du croisement dans l’ovogenèse de C. elegans . Cette méthode permet d’omettre les étapes laborieuses de la digestion par restriction et de l’électrophorèse sur gel, et d’éviter le jugement ambigu des bandes d’ADN non coupées. Le génotypage du polymorphisme mononucléotidique (SNP) est effectué à l’aide de la souche hybride Bristol/Hawaiian. Le croisement d’hermaphrodites avec des mâles exprimant myo-3p ::GFP nous permet de nous concentrer sur l’ovogenèse. Un seul lysat de ver produit une matrice d’ADN suffisante pour les six chromosomes. Les sondes de chimie TaqMan à base d’exonucléase 5' et de liant de sillon mineur (MGB) spécifique au SNP permettent la détection précise du SNP à un taux de génotypage d’environ 97,7 %. Nous utilisons la détection précise des SNP pour mesurer la fréquence de croisement chez C. elegans. Cette méthode peut également être appliquée pour déterminer la fréquence de croisement chez les mutants mâles ou défectueux, ainsi que pour des intervalles chromosomiques plus spécifiques.

Introduction

La formation de croisements entre chromosomes homologues est essentielle pour la bonne ségrégation des chromosomes et aussi pour la génération de la diversité génétique1. Les erreurs dans la formation des croisements provoquent une aneuploïdie, qui peut entraîner l’infertilité, une fausse couche et des malformations congénitales2. La fréquence des croisements varie selon la région chromosomique, le type de mutant, l’âge et le sexe, ce qui souligne la nécessité de mesurer avec précision la fréquence des croisements dans chacune deces conditions3,4,5. L’objectif global de cette méthode est de mesurer avec précision la fréquence de croisement de chaque domaine chromosomique et ainsi de déterminer avec précision la distribution des croisements sur toute la longueur du chromosome C. elegans.

Traditionnellement, la cartographie en deux points à l’aide de marqueurs morphologiques a été utilisée pour mesurer la fréquence de croisement 6,7,8,9,10. Chez C. elegans, les phénotypes trapus, courts, à corps gras (Dpy) et de mouvement non coordonné (Unc) sont souvent utilisés pour créer des cartes chromosomiques6. Les avantages de cette méthode sont son faible coût et sa capacité à analyser de nombreuses descendances. Les inconvénients de ces méthodes comprennent la limitation du choix des loci d’intérêt et l’impossibilité d’utiliser des descendants létaux car leurs phénotypes ne sont pas visibles. Afin de pallier l’inconvénient du choix du site, les transposons Tc1 ont été utilisés comme marqueurs pour les sites marqués en séquence polymorphe (STS)11,12. Les Tc1 peuvent être détectés par PCR et électrophorèse. Alors que la souche standard Bristol N2 avait 30 copies du transposon Tc1, les isolats de C. elegans de Bergerac en France (RW7000 et DP13) avaient 500 copies de Tc1. Ainsi, le nombre et la distribution des transposons de Tc1 varient entre les isolats, ce qui est utilisé pour analyser les chromosomes de la descendance des vers hybrides entre les isolats par PCR. Par la suite, les SNP ont également été utilisés pour mesurer la fréquence et la distribution de croisement13,14. Le SNP entre les souches Bristol N2 et Hawaiian CB4856 apparaissait tous les 1 000 pb15,16. Les SNP sont détectés sous forme de polymorphismes de longueur de fragment de restriction (RFLP) à l’aide de la PCR, de la digestion de restriction et de l’électrophorèse. Récemment, des sites d’insertion/délétion (InDel) de petite taille ainsi que des SNP entre Bristol N2 et CB4856 hawaïen ont été proposés comme marqueurs plus efficaces17. Cependant, la mesure de la fréquence de croisement à l’aide de Tc1, RFLP et InDel nécessite des processus à forte intensité de main-d’œuvre tels que la PCR, le traitement par enzymes de restriction et l’électrophorèse. Si chaque processus n’est pas optimisé dans une analyse à grande échelle, les résultats peuvent être mal interprétés en raison de facteurs tels que la précision de la PCR, le type d’enzyme de restriction utilisé, l’efficacité du clivage de l’ADN et la clarté et la séparation des bandes pendant l’électrophorèse. En revanche, la méthode proposée utilise le génotypage des SNP par PCR en temps réel pour faciliter une quantification précise et précise.

Les croisements ne sont pas répartis de manière aléatoire le long des chromosomes. Chez C. elegans, les croisements simples ont tendance à se former plus fréquemment dans les bras et sont supprimés au centre 3,5. La cartographie morphologique en deux points ne permet pas d’identifier où les croisements se produisent en dehors des gènes marqueurs. À l’inverse, la cartographie SNP permet une augmentation des marqueurs et il a été démontré qu’elle facilite la détermination de la région exacte d’un croisement le long de l’ensemble du chromosome 5,14,18. Dans cette étude, nous avons utilisé les limites de domaine chromosomique proposées par Rockman et Kruyglyak5 et sélectionné quatre SNP pour l’analyse : aux deux extrémités du chromosome et aux deux extrémités des limites centre/bras.

En tirant parti des méthodes précédentes, nous avons proposé une méthode de détection précise et rapide des SNP par PCR en temps réel à l’aide de TaqMan, nucléase5' 19 pour mesurer le croisement entre le bras gauche, le centre et le bras droit de chaque chromosome. Les avantages de notre méthode par rapport aux technologies alternatives, par rapport aux études précédentes 20,21,22, sont la précision et la simplicité. Cette méthode est une méthode d’analyse croisée appliquée à la qPCR pour C. elegans et convient largement aux chercheurs qui étudient la méiose.

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Protocole

1. Premier croisement génétique

  1. Préparez des plaques d’accouplement composées de plaques normales de milieu de croissance des nématodes (NGM) avec un petit point OP50 (~5 mm de diamètre) dans la boîte de 35 mm.
  2. Ajouter trois hermaphrodites L4 de la souche N2 de Bristol (ou des mutants d’origine Bristol) et neuf jeunes mâles adultes de la souche hawaïenne CB4856 sur une plaque d’accouplement (figure 1A).
    REMARQUE : Pour analyser les mutants à létalité embryonnaire élevée, il est nécessaire d’utiliser des mutants équilibrés avec des origines Bristol et hawaïennes dans ce croisement. Pour obtenir des mutants d’origine hawaïenne, les mutants de Bristol doivent être croisés avec la souche hawaïenne au moins six fois jusqu’à ce que tous les sites d’intérêt SNP aient une origine hawaïenne. En conséquence, le mutant hawaïen ne contient des origines de Bristol que dans la région mutée et le chromosome équilibreur.
  3. Incuber la plaque pendant 1,5 jour à 20 °C pour accoupler les deux souches. Transférez chaque hermaphrodite dans une nouvelle plaque NGM individuelle avec OP50.
  4. Placez les plaques dans un incubateur à 20 °C pendant 1 jour pour leur permettre de pondre des œufs fécondés. Transférez chaque hermaphrodite dans une nouvelle plaque NGM individuelle avec OP50.
  5. Placez les plaques dans un incubateur à 20 °C pendant 1 jour pour permettre aux œufs fécondés d’être à nouveau pondus. Retirez les hermaphrodites. Conservez les plaques pendant 0,5 à 1 jour dans un incubateur à 20 °C pour faire pousser la descendance jusqu’à L4.

2. Deuxième croix

  1. Choisissez six hermaphrodites L4 croisés (hybrides Bristol/Hawaiian) et 12-15 ccIs4251[(pSAK2) myo-3p ::GFP ::LacZ ::NLS + (pSAK4) myo-3p ::mitochondrial GFP + dpy-20(+)] I (TTS24) mâles Bristol sur une nouvelle plaque d’accouplement (Figure 1B).
    REMARQUE : La souche insérée ccIs4251 est obtenue du Centre de génétique Caenorhabditis, et elle doit être croisée avec la souche N2 de type sauvage plus de six fois.
  2. Conservez la plaque pendant 1,5 jour à 20 °C dans un incubateur pour l’accouplement. Transférez chaque hermaphrodite dans une nouvelle plaque NGM avec OP50.
  3. Placez les plaques dans un incubateur à 20 °C pendant 1 jour pour leur permettre de pondre des œufs fécondés. Transférez chaque hermaphrodite dans une nouvelle plaque NGM individuelle avec OP50.
  4. Conservez les plaques pendant 1 jour dans un incubateur à 20 °C pour leur permettre de pondre à nouveau des œufs fécondés. Transférez chaque hermaphrodite parental dans un tube PCR avec 3 μL de tampon de lyse pour vérifier si le premier croisement a réussi.
  5. Vérifiez les génotypes des parents en tant qu’hybride Bristol/Hawaiian par PCR dans une région du chromosome V. Séparez les bandes par électrophorèse sur gel d’agarose à 2,5 %.
    1. Dans le SNP, WBVar01973670, la longueur de l’amplicon PCR du génome de Bristol est de 220 pb et celle du génome hawaïen est de 196 pb. Si les résultats de la PCR indiquent que les parents sont des homozygotes de Bristol, cela est dû à l’autofécondation du premier croisement. N’utilisez pas la descendance de ces vers pour une analyse plus approfondie.

3. Échantillonnage

  1. Préparez le tampon de lyse des vers comme suit : 50 mM de KCL, 10 mM de Tris pH 8,2, 2,5 mM de MgCl2, 0,45 % d’IGEPAL CA-630 (NP-40), 0,45 % de Tween 20 et 0,01 % de gélatine. Stériliser par filtration et conserver à température ambiante. Immédiatement avant l’utilisation, ajouter 3 μL de protéinase K à 20 mg/mL (en H2O) à 1 mL de tampon de lyse et stocker dans des aliquotes à -20 °C.
  2. Vérifiez l’expression de la GFP au niveau du muscle de la paroi corporelle des descendants du deuxième croisement à l’aide d’un microscope à dissection fluorescente avant d’ajouter les vers dans des tubes PCR individuels. Le grossissement est de 6,1 à 55x et la longueur d’onde utilisée est de 440 à 460 nm.
  3. Choisissez une vis sans fin simple positive à la GFP et ajoutez-la à chaque tube PCR contenant 3 μL de tampon de lyse de la vis (Figure 1C). Prélever un total de 360 descendants mâles adultes croisés (90 x 4 réplicats biologiques) dans chacun des 360 tubes PCR.
    REMARQUE : Pour éviter de choisir une progéniture autofécondée, des vers positifs à la GFP doivent être sélectionnés pour l’échantillonnage. Des hermaphrodites non accouplés plus jeunes que L4 sont également disponibles pour l’analyse des autosomes, mais parce qu’ils ont des nombres différents de chromosomes X, les mâles et les hermaphrodites doivent être identifiés après avoir atteint L4 et échantillonnés lors de l’analyse du chromosome X.
  4. Placez les échantillons dans un congélateur à -80 °C pendant 5 min. Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à ce que la lyse puisse commencer.
  5. Lors de l’analyse de mutants à haute létalité embryonnaire, collectez les embryons morts au lieu des larves vivantes pour obtenir des résultats impartiaux. Pour prélever des embryons, utilisez l’embout d’une pipette contenant 0,5 μL de solution de chitinase (20 mg/mL de chitinase, 50 mM de NaCl, 70 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2). Prélever les embryons dans les 4 heures suivant la ponte.
    REMARQUE : Les embryons morts pondus il y a plus de 4 h ne conviennent pas à l’analyse PCR, probablement en raison de la dégradation de l’ADN génomique.

4. Lyse de l’échantillon

  1. Réglez les tubes PCR dans le thermocycleur à 60 °C pendant 1 h, puis à 95 °C pendant 15 min. Ajouter 100 μL d’eau sans nucléases dans chaque tube et bien mélanger.
  2. Conservez les échantillons à -20 °C jusqu’au début du génotypage SNP par PCR en temps réel.

5. Génotypage des SNP

  1. Préparez un mélange comme suit (Figure 2). Dans un tube de 1,5 ml, ajoutez 125 μL de Master Mix, 6 μL de test de génotypage SNP (40x), 280 μL d’eau distillée (DW), d’amorce directe (450 nM), d’amorce inverse (450 nM), de sonde 1 (100 nM), de sonde 2 (100 nM).
    REMARQUE : Les sondes et les amorces sont répertoriées dans le tableau 1.
  2. Mélangez soigneusement en pipetant plusieurs fois pour assurer une concentration uniforme. Ajouter 4 μL du mélange dans chaque puits d’une plaque PCR à 96 puits sur la base du support à l’aide d’une micropipette à 12 canaux.
  3. Ajouter 1 μL de lysat contenant chaque ADN génomique dans chaque puits et mélanger en pipetant plusieurs fois.
  4. Préparer des témoins positifs, c’est-à-dire des homozygotes de Bristol, des homozygotes hawaïens et des hybrides de Bristol/Hawaï, ainsi que trois témoins sans modèle comme témoins négatifs (figure 3A).
  5. Scellez la plaque avec un film adhésif optique. Appuyez sur le film en vous concentrant sur les bords de chaque puits à l’aide d’un applicateur.
  6. Centrifugez brièvement la plaque pour recueillir le liquide au fond et éliminer les bulles d’air du liquide.
  7. Chargez la plaque sur l’instrument de PCR en temps réel. Cliquez sur le bouton Créer une nouvelle expérience dans le logiciel.
  8. Dans le paramètre Propriétés, définissez Type d’instrument sur Système QuantStudio 1, Type de bloc sur Bloc de 96 puits 0,2 ml, Type expérimental sur Génotypage, Chimie sur Réactifs TaqMan et Mode d’exécution sur Rapide.
  9. Dans le paramètre Méthode, réglez le volume sur 5 μL (en vous assurant que le volume de réaction correct correspond à la configuration), le nombre de cycles sur 40 cycles (par défaut). Réglez les réglages de température et de temps comme suit : Étape de pré-lecture à 25 °C pendant 30 s, Étape de maintien (activation enzymatique, démarrage à chaud) à 95 °C pendant 20 s, Étape PCR à 95 °C pendant 1 s, 60 °C pendant 20 s et Étape de post-lecture à 25 °C pendant 30 s.
  10. Dans le réglage Plaque, faites correspondre les positions des échantillons et des commandes à chaque puits sur l’écran du logiciel.
  11. Enregistrez l’expérience dans un périphérique USB, chargez-la dans l’instrument de PCR en temps réel, puis cliquez sur le bouton Exécuter .

6. Analyse des données

  1. Enregistrez les résultats sur une clé USB et transférez-les sur un ordinateur pour l’analyse des données.
  2. Analysez les données delta Rn (dRn) en temps réel à l’aide de la formule ci-dessous, où Rn (rapporteur normalisé) est le signal de fluorescence du colorant rapporteur, VIC et FAM, normalisé en divisant par le signal de fluorescence du colorant de référence passif, ROX.
    dRn = Rn - ligne de base
  3. Examinez le graphique de discrimination allélique.
  4. Confirmez la séparation des grappes (Figure 3B). Dans le graphique de discrimination allèle, les homozygotes de Bristol sont regroupés dans le coin inférieur droit, les hybrides de Bristol/Hawaï dans le coin supérieur droit, les homozygotes d’Hawaï dans le coin supérieur gauche et les témoins négatifs sont regroupés dans le coin inférieur gauche. Utilisez les codes de couleur suivants :
    Rouge : allèle Bristol
    Bleu : allèle hawaïen
    Vert : Hétérozygote
    Noir : Contrôle négatif
  5. Exportez les résultats dans un tableur et assemblez les données de génotypage des quatre positions SNP. S’il y a des appels indéterminés dans quatre positions consécutives, excluez les données de la valeur N. Utiliser 90 échantillons par plaque pour l’analyse.
    1. Identifiez les croisements comme suit : Si le SNP à la position #1 est un hybride Bristol/Hawaiian, et que les positions #2-#4 sont toutes des homozygotes de Bristol [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] ou que la position #1 est un homozygote de Bristol et que la position #2-#4 sont toutes des hybrides Bristol/Hawaiian [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H], Ces résultats indiquent un seul croisement entre les positions #1 et #2 (quelque part sur le bras gauche du chromosome). De même, dans le cas de [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B] ou [B/B]-[B/H]-[B/H], un seul croisement se produit entre #2 et #3 (quelque part dans la région centrale du chromosome), et dans le cas de [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B] ou [B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H], Un seul croisement se produit entre #3 et #4 (quelque part sur le bras droit du chromosome).
      REMARQUE : Il existe six modèles de doubles croisements. Gauche et droite : [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/B] et [B/H]-[B/B]-[B/H], gauche et centre : [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B] et [B/H]-[B/B]-[B/H]-[B/H], centre et droite : [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/B] et [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/H].

7. Analyse statistique

  1. Insérez les valeurs dans le logiciel SPSS Statistics (IBM). Pour comparer la distribution du croisement au bras gauche, dans la région centrale et dans le bras droit des chromosomes, insérez 82 chromosomes avec un croisement au bras gauche, 20 chromosomes avec un croisement dans la région centrale et 68 chromosomes avec un croisement au bras droit.
  2. Effectuez une analyse de variance et une correction de Bonferroni et déterminez la signification statistique à l’aide d’une valeur p bilatérale. Effectuez autant de comparaisons que nécessaire, telles que le bras gauche par rapport au centre ou le WT par rapport au mutant.

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Résultats

Nous avons détecté les quatre sites SNP sur le chromosome II chez C. elegans par un test de génotypage SNP pour quantifier la formation de croisements par longueur totale du chromosome, dans le bras gauche, dans la région centrale et dans le bras droit. La détection des SNP est effectuée selon les instructions du fabricant. Le mélange principal contient de l’ADN polymérase Taq, de l’uracile-N-glycosylase (UNG) thermolabile, du dNTP avec dUTP et du colorant ROX de référence passif. L’ADN polymérase Taq est activé...

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Discussion

Ici, nous avons introduit une méthode de mesure de la fréquence et de la distribution des croisements dans la méiose de C. elegans basée sur le génotypage SNP des descendants croisés de l’espèce hybride Bristol/Hawaiian. Alors que la méthode conventionnelle SNIP-SNP (RFLP) nécessite une électrophorèse sur gel après PCR, et que la détection des bandes d’ADN nécessite un système de documentation sur gel14,18, le génotypage...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les souches ont été aimablement fournies par le Caenorhabditis Genetics Center (CGC), financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Nous remercions les membres du Laboratoire Saito pour leurs discussions utiles concernant ce travail. Ce travail a été soutenu par la subvention KAKENHI de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) JP23K05868 à TTS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
101-1000&mu ; l Pointe de pipetteQSP111-N-Q
Solution 0,5 mol/I-EDTA (pH 8,0)Nacalai tesque14347-21
Solution d’hydroxyde de sodium 10mol/INacalai tesque94611-45
10X DreamTaq Tampon vertThermo Fisher Scientific  ;EP0713
10&mu ; L, pointe longue, grandioseFUKAEKASEI, WATSON110-207C
200&mu ; L, pointe standard, graduéeFUKAEKASEI, WATSON110-705C
Poudre d’agarNacalai tesque01028-14
AgarosePH JaponPH108
Autoclave TOMY modèle ES-215 Stérilisateur à vapeur haute pressionTOMY SEIKOES-215
Bacto Peptone Digestion enzymatique des protéinesThermo Fisher Scientific  ;211677
Acide boriqueNacalai tesque05215-05
Caenorhabditis elegans Bristol sauvage  ;Centre de Génétique CaenorhabditisN2
Caenorhabditis elegans Hawaïen de type sauvageCentre de Génétique CaenorhabditisRéf. CB4856
Chlorure de calciumNacalai tesque06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p ::GFP ::LacZ ::NLS + (pSAK4) myo-3p ::GFP mitochondriale + dpy-20(+)] ILaboratoire SaitoTTS24à l’origine de PD4251
CholestérolNacalai tesque08721-62
Tests de génotypage SNP TaqMan personnalisésThermo Fisher Scientific  ;4332077
Mélange de solutions de désoxynucléotide (dNTP)Biolabs de la Nouvelle-AngleterreN04470
DigPrint Doc Tablette DP-T130ZOutils BioDP-T130Z
hydrogénophosphate dipotassiqueNacalai tesque28726-05
Microscope de dissectionNikonSMZ-745 C-DS
ADN polymérase Dream TaqThermo Fisher Scientific  ;EP0713
Solution de bromure d’éthidiumNacalai tesque14631-94
Amorce avant pour WBVar01973670IDT103988736atgtctcacccaaggttgaa
gélatineNacalai tesque166-31
Pipette classique Gilson PIPETMANThermo Fisher Scientific  ;
IGEPAL CA-630Sigma-Aldrich18896
Sulfate de magnésium heptahydratéNacalai tesque21003-75
Plaque Reacton optique MicroAmp à 96 puitsThermo Fisher Scientific  ;N8010560
Film d’adhérence optique MicroAmpThermo Fisher Scientific  ;4311971
MiniAmp  ; thermocycleurThermo Fisher Scientific  ;MiniAmpli
Système d’électrophorèse horizontale Mini-Sub Cell GT, plateau de 7 x 10 cmLaboratoires Bio-Rad1704466
Nichipet EXIINichiryo00-NPX2-2
Nichipet EXII MULTINichiryo00-NPM-12VP
Pippete Mate NEONichiryo00-PMNEO
Chlorure de potassiumNacalai tesque285-38
Dihydrogénophosphate de potassiumNacalai tesque28720-65
Protéinase KThermo Fisher Scientific  ;EO0491
Système de PCR en temps réel QuantStudio 1, 96 puits, 0,2 mLThermo Fisher Scientific  ;N° A40426
Échelle d’ADN Quick-Load Purple 1kb PlusBiolabs de la Nouvelle-AngleterreN0550S
Amorce inversée pour WBVar01973670IDT103988737tggctactcctagtcactga
Chlorures de sodiumNacalai tesque31319-45
TaqPath ProAmp Master MixThermo Fisher Scientific  ;N° A30866
TC Dish 35, StandardSARSTEDT83.3900
Tris (hydroxyméthyl) aminométhaneNacalai tesque35406-75
Base TrizmaSigma-Aldrich  ; T1503-1KG
Préadolescent 20Réactif Yoneyama03706
WormStuff Pic à versGenesee Scientific59-AWP
WormStuff Pointes de pic à vers (90/10 % Pt/Ir, calibre 30)Genesee Scientific59-30PI36

Références

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