Le protocole décrit une méthode d’injection de cellules tumorales par la voie de ponction percutanée dans la citerne magna qui induit de manière robuste des métastases leptoméningées chez la souris, réduisant ainsi le traumatisme et la charge tumorale extracrânienne.
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Article de méthode
Modèle d’injection mini-invasive de citerne magna pour les études de métastases leptoméningées chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les métastases leptoméningées (LM), la propagation des cellules cancéreuses dans les leptoméninges remplies de liquide céphalo-rachidien (LCR), sont une complication rare mais dévastatrice des tumeurs solides avancées. Les patients atteints de LM ont souvent un mauvais pronostic, la survie se mesurant en semaines à quelques mois. Le développement de modèles in vivo qui reproduisent avec précision les complexités de la LM est essentiel pour comprendre ses mécanismes cellulaires et pathologiques et évaluer les thérapies potentielles. Les modèles murins LM sont généralement créés par injection intra-cardiaque, de l’artère carotide ou de la citerne magna de cellules tumorales. Cependant, les injections intracardiaques ou carotidiennes entraînent souvent une charge tumorale extracrânienne et cérébrale importante, compliquant l’imagerie bioluminescente et entraînant une mortalité non liée à la LM. Pendant ce temps, l’injection conventionnelle de citerne magna nécessite des procédures invasives, telles que l’incision cutanée et la dissection musculaire, ce qui la rend à la fois traumatisante et gourmande en ressources. Ici, nous décrivons une procédure peu invasive d’injection de cellules tumorales dans l’espace leptoméningé à travers la citerne magna sans avoir besoin d’une incision cutanée. Cette approche réduit la formation de tumeurs extracrâniennes, minimise les traumatismes chirurgicaux et raccourcit le temps et les soins postopératoires nécessaires par rapport aux autres méthodes chirurgicales. Il est important de noter qu’il induit systématiquement une LM avec une infiltration minimale de parenchyme cérébral, comme le confirment la microscopie à deux photons et l’analyse histologique. Cette approche rationalisée offre un modèle efficace et fiable pour l’étude de la LM dans la recherche préclinique.
Introduction
La maladie métastatique reste le plus grand défi pour les patients atteints de cancers avancés. Les métastases leptoméningées (LM) font référence à la propagation des cellules cancéreuses à la pie-mère, à l’arachnoïde et à l’espace sous-arachnoïdien. La LM des tumeurs solides est de plus en plus fréquente dans le cancer du poumon (9 % à 25 %), le cancer du sein (5 % à 20 %) et le mélanome (6 % à 18 %), en grande partie en raison de l’allongement de la survie et de l’amélioration des techniques de diagnostic. Les cellules cancéreuses peuvent envahir l’espace leptoméningé par de multiples voies, notamment 1) l’invasion directe à travers des structures périphériques telles que la dure-mère, les os et les nerfs ; 2) propagation hématogène dans le système veineux ; et 3) l’entrée par la circulation artérielle, où les cellules cancéreuses se glissent à travers les vaisseaux fenêtrés dans le plexus choroïde et par la suite dans les ventricules remplis de liquide céphalo-rachidien 3,4,5. Les cellules tumorales qui pénètrent dans l’espace leptoméningé rencontrent de multiples défis, notamment la privation de facteurs de croissance, des intermédiaires métaboliques limités et des conditions hypoxiques6. Cependant, en raison du manque d’outils et de techniques appropriés, la façon dont les cellules tumorales naviguent dans ces voies et surmontent les conditions inhospitalières pour coloniser l’espace leptoméningé est mal comprise. Malgré les progrès des thérapies multimodales, y compris la radiothérapie, le traitement systémique et la thérapie par injection intrathécale, le pronostic des patients atteints de LM reste mauvais, avec une survie allant généralement de 2 à 4 mois 3,7,8,9. Il est donc urgent de mieux comprendre la biologie des métastases leptoméningées afin d’améliorer les traitements actuels et de développer de nouvelles thérapies ciblées. Pour y parvenir, il faut développer des modèles in vivo qui récapitulent les caractéristiques complexes de LM.
Contrairement aux métastases dans des organes tels que le foie, les os et le cerveau, la LM se développe généralement des années après le diagnostic de la tumeur primaire 10,11,12. De même, dans les modèles murins avec des métastases spontanées, la LM est rare en raison de sa faible incidence et du fait que les souris succombent généralement à des métastases à d’autres sites. Des modèles expérimentaux de LM murin peuvent être créés par diverses méthodes, notamment intracardiaque, artère intracarotide ou, alternativement, injection directe dans la citerne géante ou les ventricules cérébraux. Bien que l’injection intracardiaque de cellules cancéreuses soit largement utilisée9, elle entraîne souvent une charge tumorale extracrânienne importante, provoquant une mortalité non liée à la LM. D’autres approches, telles que l’injection de cellules tumorales par l’artère carotide13,14, nécessitent des ressources spécialisées importantes et entraînent de grandes incisions chirurgicales, traumatisantes. De plus, cette méthode conduit également principalement à des métastases dans les tissus cérébraux eux-mêmes, plutôt que dans les leptoméninges, et prend du temps et est inefficace pour établir des modèles LM15. L’injection dans la citerne magna permet l’administration directe des cellules tumorales dans l’espace leptoméningé. Plusieurs études ont utilisé cette approche pour étudier les mécanismes de LM et évaluer de nouveaux traitements 6,16,17.
Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole d’injection commode de trans-citerne magna impliquant une ponction percutanée directe pour générer rapidement et de manière stable une plus grande quantité de souris avec LM. Cette méthode contourne la barrière hémato-encéphalique et, par conséquent, permet une xénogreffe efficace de cellules tumorales dans l’espace des leptoméninges. Il réduit également considérablement le traumatisme chirurgical et la durée de la procédure tout en induisant de manière fiable la LM chez la souris. Nous avons confirmé l’apparition d’une LM avec une infiltration minimale dans le parenchyme cérébral, comme vérifié par microscopie à deux photons et analyse histologique. Par conséquent, le modèle résultant reproduit fidèlement le microenvironnement complexe de LM, fournissant un outil précieux pour étudier les mécanismes cellulaires et pathologiques associés à la maladie et évaluer les thérapies potentielles.
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Protocole
Toutes les procédures animales de ce manuscrit ont été examinées et approuvées par le comité d’examen du bien-être et de l’éthique des animaux de laboratoire (ZJU20230155) de ZJU. Les souris C57BL/6J et NSG ont été obtenues et hébergées dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques au Centre des animaux de laboratoire de la ZJU. Ce protocole utilise la lignée cellulaire du cancer du poumon murin, le carcinome pulmonaire de Lewis (LLC1), et la lignée cellulaire du cancer du poumon humain, A549, toutes deux marquées avec la GFP et la luciférase de luciférase. Les deux lignées cellulaires sont aimablement fournies par le Dr Xiang H. F. Zhang (Baylor College of Medicine, États-Unis)18. Ici, nous utilisons les cellules LLC1 à titre d’exemple. La procédure d’injection des cellules A549 est presque identique, sauf que 6 x 104 cellules A549 ont été injectées dans des souris NSG.
1. Préparation des cellules cancéreuses pour l’injection
- Cultiver 1,0 x 106 cellules LLC1 dans du DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 0,1 mg/mL de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 . Lorsque les cellules atteignent une confluence de 70 % à 90 %, trypsinisez pendant 1 minute en utilisant 2 ml de solution de trypsine/EDTA à 0,25 %. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 3 min, lavez-les 2 fois avec du PBS glacé et mettez-les en suspension dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Évaluer la concentration de cellules viables à l’aide d’une solution de Trypan Blue et d’un hémocytomètre19. Assurez-vous que la viabilité cellulaire est supérieure à 90 %, la majorité des cellules étant uniques. Ajustez la concentration cellulaire à 2 x 106 cellules/mL dans du PBS glacé.
- Aliquote 50 μL de la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation séparés pour éviter le pipetage répété.
- Conservez les suspensions cellulaires sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être injectées. Injectez 10 μL de cellules LLC1 marquées à la GFP-Luciferase par souris dans ce protocole, ce qui correspond à 2 x 10cellules 4 par souris.
REMARQUE : Ajustez le nombre de cellules au besoin en fonction de la cinétique métastatique des lignées cellulaires injectées.
2. Préparation des souris
REMARQUE : Dans cette étude, des souris mâles C57BL/6J, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisées.
- Autoclavez tous les instruments chirurgicaux et les gants emballés avec des champs chirurgicaux. Désinfectez le paillasse et l’équipement non chirurgical avec de l’éthanol à 75 %, puis couvrez la zone de travail avec des champs étanches.
- Préparez une cage d’hébergement propre et un coussin chauffant pour la récupération après l’intervention.
- Anesthésier la souris en injectant par voie sous-cutanée 2 % de tribromoéthanol (200 mg/kg). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’un test de pincement avant de continuer. Appliquez une pommade ophtalmique stérile pour protéger les yeux des lésions cornéennes une fois la souris anesthésiée.
- Rasez la fourrure de la région occipitale postérieure à l’aide d’une tondeuse, puis appliquez des crèmes dépilatoires pour enlever complètement la fourrure dans la même région.
- Placez la souris couchée avec son cou placé sur un tube à centrifuger de 15 ml. Fixez la tête et le bas du dos avec du ruban adhésif et palpez l’espace entre l’occiput et la vertèbre C1 avec l’index (figure 1).
- Désinfectez la région occipitale postérieure en trois cycles d’essuyage avec des cotons-tiges stériles imbibés à 75 % d’éthanol, suivis d’un gommage chirurgical à la bétadine. Couvrez les parties non stériles de l’animal avec un champ stérile.
3. Injection de citerne magna
REMARQUE : Des techniques d’asepsie sont requises pour les étapes suivantes, y compris l’utilisation d’un équipement de protection individuelle et de gants stériles.
- Pipeter doucement la suspension cellulaire et aspirer 10 μL pour l’injection avec une seringue à insuline de 31 G et 8 mm.
- Palper la zone entre l’occiput et C1 de la souris avec l’index pour localiser le site de ponction précis sur le bord médian inférieur du crâne occipital postérieur. Marquez ce site si nécessaire.
- Insérez l’aiguille à un angle de 45°-50° dans la citerne magna à travers le site de ponction identifié, en avançant jusqu’à une profondeur de 4 mm. Une sensation de percée distincte indique que l’aiguille a réussi à pénétrer dans la citerne magna.
- Si le site de ponction est difficile à localiser, faites une petite incision de 3 à 5 mm au niveau de l’oreille pour exposer la ligne médiane postérieure. Si une incision chirurgicale est nécessaire, administrer du méloxicam (5 mg/kg/jour) et de la buprénorphine (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée 1 h avant l’intervention chirurgicale.
- Injectez lentement la suspension cellulaire en avançant le piston de la seringue, en maintenant la seringue stable avec la main posée sur la table.
- Après l’inoculation, maintenez la seringue en place pendant 10 secondes supplémentaires pour permettre à la pression intracrânienne de s’équilibrer. Ensuite, retirez l’aiguille et appuyez sur le site de ponction avec un coton-tige stérile pendant 1 à 2 minutes.
4. Soins post-injection
- Transférez les animaux dans des cages propres sur un coussin chauffant et surveillez-les de près jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis.
- En cas d’incision, fermez la plaie à l’aide de colle à tissu et de pinces. Administrez des analgésiques supplémentaires pendant 2 à 3 jours après la chirurgie pour contrôler la douleur et aider à la récupération.
- Surveillez de près les souris pendant 7 jours après l’intervention et vérifiez quotidiennement les activités physiques des animaux et l’apparence autour du site d’injection.
5. Évaluation de la croissance tumorale leptoméningée
- Imagerie par bioluminescence
- Anesthésie la souris et administre de la D-luciférine (150 μg/g) dans la veine rétroorbitaire. Placez les souris dans la chambre d’imagerie, en les positionnant dans un cône nasal désigné sur le collecteur d’anesthésie. Utilisez des déflecteurs lumineux entre les animaux pour minimiser les interférences de signal.
- Imagez immédiatement les animaux à l’aide du système IVIS avec un temps d’exposition compris entre 0,5 s et 2 min6. Confirmer l’inoculation réussie des cellules tumorales dans l’espace leptoméningé par un signal bioluminescent dispersif à travers la tête et la moelle épinière (Figure 2A).
- Suivre la progression de la LM par imagerie par bioluminescence tous les 4 jours. Ajustez les intervalles d’imagerie en fonction de la cinétique de croissance tumorale.
- Analyse histologique
- Anesthésier les souris lorsqu’elles étaient significativement moins actives ou avaient perdu 20 % de leur poids corporel et couper la peau et les côtes pour exposer leur cavité thoracique. Insérez soigneusement une canule à bout émoussé dans le ventricule gauche et avancez la canule dans l’aorte ascendante. Perfuser lentement l’animal avec 20 ml de PBS à travers la canule.
- Utilisez des ciseaux pour retirer la tête et faites une incision médiane du cuir chevelu pour exposer le crâne. Exciser les tissus mous environnants. Coupez le long de la crête orbitaire, puis insérez des ciseaux dans le foramen magnum et avancez soigneusement le long de la surface interne du crâne avec une pression vers le haut pour éviter d’endommager les tissus.
- Retirez les os crâniens, puis extrayez doucement le cerveau. Fixez le cerveau dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 24 h, puis équilibrez-le dans une solution de PBS à 15 % de saccharose pendant 24 h, suivie d’une solution de PBS à 30 % de saccharose pendant 24 h à 4 °C.
- Placez le tissu dans un cryomoule rempli de composé à température de coupe optimale (OCT), puis stockez-le sur de la glace sèche pendant 30 min20.
- Coupez le cerveau intégré à l’OCT en sections de 10 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat. Conservez les sections dans un congélateur à -80 °C jusqu’à nouvel ordre.
- Effectuer une coloration à l’hématoxyline/éosine (H&E) sur les lames cérébrales21. La présence de cellules tumorales au bord du cerveau indique que les métastases se produisent exclusivement dans l’espace leptoméningé (Figure 3 et Tableau 1).
- Microscopie à deux photons
- Anesthésier les souris avec LM. Retirez les cuirs chevelus recouvrant la surface dorsale du crâne avec des pinces et des ciseaux. À l’aide d’une lame de scalpel, vous pouvez retirer le mince périoste de la surface du crâne.
- Amincissez le crâne avec une perceuse abrasive jusqu’à ce que les vaisseaux piaux soient visibles à travers le crâne aminci. Stabilisez la zone d’observation de la tête de souris à l’aide d’une tête triangulaire fixée par un adhésif tissulaire22,23.
- Administrer 0,025 mL de TRITC-dextran à 5 % (p/v) dans une veine infraorbitaire pour marquer les vaisseaux sanguins22.
- Effectuez une microscopie à deux photons à travers les fenêtres d’imagerie et reconstruisez l’espace leptoméningé (Figure 4). Détection de l’os par fluorescence de seconde harmonique à une émission de 450 nm avec une excitation de 900 nm24. Visualisez les cellules tumorales marquées à la GFP et les vaisseaux marqués au dextran en collectant des signaux de fluorescence à une émission de 507 nm et 572 nm avec une excitation de 900 nm et 1000 nm, respectivement.
- Microscope à stéréofluorescence
- Retirez la cervelle de la souris et placez-la sous un stéréomicroscope. Visualisez les cellules marquées GFP à l’aide d’un ensemble de filtres spécifiques à la GFP (Figure 5).
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Résultats
La figure 1 illustre l’emplacement de la souris pour l’injection et le site de ponction en vue latérale et frontale. La figure 2 montre des images représentatives de bioluminescence in vivo d’animaux testés pour générer de la LM par différentes approches. Des cellules LLC1 marquées à la GFP-luciférase ont été injectées dans les animaux par différentes voies, suivies d’une imagerie bioluminescente. Comme le montre l...
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Discussion
La LM est une maladie agressive et mortelle. Une fois que les cellules tumorales métastasent dans l’espace rempli de liquide céphalo-rachidien, elles se disséminent rapidement dans l’ensemble du système nerveux central25. Ces cellules s’installent et envahissent le cerveau, la moelle épinière, les nerfs crâniens et rachidiens, entraînant finalement une détérioration neurologique rapide et finalement la mort17. Pour mieux comprendre les méca...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs remercient les membres du laboratoire Zhang pour leurs précieuses discussions et leur aide tout au long de cette étude. W.Z. est soutenu par les Fonds de recherche fondamentale pour les universités provinciales du Zhejiang (2023QZJH60), le Programme de fonds scientifiques pour les jeunes chercheurs distingués de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (588020-X42306/041) et le fonds de démarrage de l’Institut des sciences de la vie de l’Université du Zhejiang.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes Eppendorf de 1,5 ml | Biosharp | BS-15-M-S | |
| Tube à centrifuger de 15 ml | LABSELECT | Réf. CT-002-15A | |
| Seringue à insuline 31G x 8mm (0.3ml) | Promismed | / | |
| Foret abrasif | GLOBALEBIO | GEGZ-AM1 | |
| Tapis chauffant pour animaux | woggee | / | |
| Cryomoule | Supin | SP-AB-7 x 7 x 5 | |
| Crèmes dépilatoires | Ndayisaba | 1.00023E+11 | |
| D-Luciférine | Biologie de l’or | CHANCE-1G | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Spectre IVIS | Étrier | / | |
| Kétamine | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | H20193336 | |
| Température de coupe optimale | Sakura | 4583-1 | |
| Paraformaldéhyde | SCR | 80096618 | |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | |
| Stylo/streptocoque amphotéricine B | Gibco | 15140122 | |
| Rasoir | Hipidog | Référence 2103CGMJ3373-GQ22N526 | |
| Microscope à stéréofluorescence | Olympe | / | |
| Pinces droites | Beyotime | FS019 | Besoin d’être autoclavé |
| Ciseaux chirurgicaux | Beyotime | FS001 | Besoin d’être autoclavé |
| Tête de fixation de souris triangulaire | Vivoscope Transcend | TVS-FDM-027 | |
| TRITC-dextran, MW 70000 | MedChemExpress | HY-158082C | |
| Solution trypsine/EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Microscopie à balayage laser à deux photons | Olympe | / | |
| Adhésifs tissulaires Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Xylazine | Sigma | X1126 |
Références
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Réimpressions et autorisations
