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Article de méthode

In vivo Application du marquage de proximité basé sur TurboID chez Drosophila melanogaster

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DOI :

10.3791/68193

⸱

13 juin 2025

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

Dans cet article

Résumé

Dans cette étude, nous établissons un protocole détaillé pour le marquage de proximité (PL) basé sur TurboID dans l’ovaire de D. melanogaster , couvrant les étapes allant de la supplémentation en biotine et de la dissection de l’ovaire à la validation de l’expression du transgène et à l’enrichissement des peptides biotinylés pour la spectrométrie de masse.

Résumé

Le marquage de proximité (PL) est une méthode puissante pour cartographier les réseaux d’interaction protéine-protéine. Les progrès dans le marquage des enzymes, en particulier TurboID, ont élargi son utilisation à travers les systèmes biologiques. TurboID est particulièrement avantageux pour les applications in vivo en raison de sa robustesse, de sa non-toxicité et de sa facilité d’utilisation. Cette enzyme biotinyle par promiscuité les biomolécules voisines, y compris les protéines et les acides nucléiques, dans une plage d’environ 10 nm en présence de biotine. Nous avons appliqué cette méthode pour étudier l’interactome de la courgette (Zuc), un facteur clé dans la biogenèse de l’ARN piwi-interagissant (piARN) sur la membrane mitochondriale externe (OMM) dans les cellules germinales de l’ovaire de Drosophila melanogaster . En exprimant Zuc-TurboID dans les cellules germinales et en complétant avec de la biotine, nous avons induit la biotinylation des protéines proximales Zuc. L’analyse par spectrométrie de masse suite à l’enrichissement de peptides biotinylés a permis d’identifier des protéines à proximité immédiate de Zuc, y compris des interacteurs bien connus dans la biogenèse des piARN. Il est intéressant de noter que nous avons découvert de nouveaux interacteurs de Zuc impliqués dans le repliement des protéines, l’organisation membranaire et le trafic des vésicules.

Introduction

Les méthodes conventionnelles de cartographie des interactions protéine-protéine (IPP), telles que la spectrométrie de masse de purification d’affinité (AP-MS) et les systèmes de levure-2-hybrides (Y2H), ne parviennent souvent pas à capturer des protéines de faible abondance, exprimées de manière transitoire ou liées à une membrane. Cette limitation provient de leur incapacité à reproduire les conditions physiologiques natives d’une cellule vivante 1,2,3. Pour surmonter ces défis, la PL est apparue comme une technique puissante pour la cartographie à haute résolution du protéome au niveau des sous-organites in vivo. La PL exploite la fusion d’une enzyme de promiscuité avec une protéine d’appât, permettant à l’enzyme de catalyser la formation de molécules réactives à courte durée de vie1. Ces molécules réactives, telles que la biotine, marquent de manière covalente les protéines à quelques nanomètres de la protéine de fusion4. Par la suite, les protéines biotinylées sont isolées et analysées par spectrométrie de masse pour faciliter l’identification des protéines à grande échelle 5,6.

Au cours des dernières années, diverses enzymes de promiscuité ont été développées pour faire progresser les techniques de PL. Deux enzymes largement utilisées sont la biotine ligase mutante R118G dérivée d’Escherichia coli (BioID) et l’enzyme ascorbate peroxydase 2 dérivée du pois (APEX2). BioID convertit la biotine et l’ATP en biotinyl-5'-adénylate (bioAMP)1. Cette molécule réactive se lie de manière covalente aux résidus de lysine des protéines voisines dans ± rayon de 10 nm. L’un des principaux avantages de la PL à base de BioID est l’utilisation de la biotine. Il s’agit d’une biomolécule naturelle et non toxique dans les organismes vivants, ce qui permet un marquage in vivo sûr6. Cependant, BioID présente des limites, notamment une cinétique de marquage lente (18-24 h) et l’exigence d’une température élevée (37 °C) pour une activité catalytique optimale4. Ces traits peuvent entraver son application dans l’étude des processus biologiques dynamiques. Pendant ce temps, APEX2 catalyse la formation de radicaux biotine-phénoxyle en présence de biotine-phénol et de peroxyde d’hydrogène (H2O2)7. Ces radicaux réagissent principalement avec la chaîne latérale d’acides aminés riches en électrons comme la tyrosine et peuvent également se lier à la cystéine, à l’histidine et au tryptophane8. La capacité de marquage rapide de l’enzyme peroxydase (< 1 min) est adaptée à la capture des IPP dynamiques et transitoires9. De plus, elle a une plage de détection plus large (jusqu’à 20 nm) que la biotine ligase. Cependant, le PL à base d’APEX2 présente des inconvénients, notamment la nécessité d’un agent oxydant toxique, H2O2, et la faible perméabilité de la biotine-phénol, qui limitent l’applicabilité in vivo10.

En 2018, Branon et al. ont développé une nouvelle biotine ligase appelée TurboID, une version mutante de 35 kD de BirA (la biotine ligase présente dans E. coli)4. Cette enzyme incorpore une mutation en position R118 (R118S) ainsi que 15 autres mutations par rapport à BirA. Il présente une activité catalytique deux fois plus élevée que BioID. La biotinylation induite par TurboID en 10 min produit des données protéomiques d’une taille et d’une spécificité comparables à 18 h de marquage par BioID. De plus, il présente une excellente activité d’étiquetage à 30 °C4. Par conséquent, TurboID est plus adapté à une application dans des organismes tels que la drosophile ou Caenorhabditis elegans, qui sont généralement élevés à 25 °C et 20 °C, respectivement.

Dans cette étude, nous visons à utiliser le PL basé sur TurboID pour l’étude de l’interactome dans l’ovaire de la drosophile. Les protocoles décrits ici sont utilisés pour cartographier l’interactome de Zuc dans les cellules germinales. Zuc est une endonucléase localisée sur la membrane mitochondriale externe (OMM), qui médie la biogenèse des piARN, de petits ARN non codants essentiels au maintien de l’intégrité du génome 11,12,13. En comparant les protéines biotinylées identifiées à partir de l’analyse Zuc-TurboID avec celles de deux contrôles supplémentaires, NES-TurboID et Tom20-TurboID, nous avons défini des candidats distincts interagissant avec Zuc.

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Protocole

1. PL chez la mouche adulte

  1. Préparation des aliments à base de biotine
    1. Préparez une solution de 1 M de NaOH en diluant 10 M de NaOH dans de l’eau distillée trois fois (TDW). Conservez-le à température ambiante (RT). Préparez 1 M de solution mère de biotine en dissolvant 0,0049 g de poudre de biotine dans 20 mL de TDW. Ajouter 150 à 200 μL de NaOH 1 M pour augmenter la solubilité de la biotine. Vortex pour homogénéiser la solution. Conserver la solution mère de biotine à 4 °C.
    2. Sortez la nourriture pour mouches de la fiole et passez-la au micro-ondes pendant 2 minutes jusqu’à ce qu’elle soit fondue.
      REMARQUE : La nourriture standard pour mouches contient 5 % de semoule de maïs, 3 % de levure, 10 % de saccharose, 1 % d’agar, 0,3 % d’acide propionique et 0,3 % de méthyl4-hydroxybenzoate13.
    3. Ajouter le stock de biotine à l’aliment fondu avec une concentration finale de 100 μM, puis mélanger par vortex. Versez immédiatement 4,5 ml d’aliments enrichis en biotine dans chaque flacon vide à l’aide d’une pipette sérologique. Laissez refroidir les aliments pendant 30 minutes, placez un capuchon en coton sur le flacon, puis conservez les aliments à base de biotine à 4 °C.
      REMARQUE : La biotine doit être ajoutée avant que les aliments ne refroidissent et ne durcissent.
  2. Alimentation à la biotine
    1. Croisez les mouches transgéniques qui surexpriment la protéine de fusion TurboID avec des mouches GAL4 spécifiques aux tissus ou aux cellules 14,15,16. En tant que contrôle négatif, croisez des mouches de type sauvage avec des mouches conductrices GAL4 pour assurer l’absence d’induction de biotinylation.
    2. Environ 10 jours après le croisement, les descendants commenceront à éclore. Dissoudre la poudre de levure sèche dans TDW et incorporer en une pâte lisse. Appliquez une cuillerée de pâte de levure sur la paroi d’un nouveau flacon. Tapotez doucement l’ancienne fiole contenant les mouches nouvellement écloses pour recueillir les mouches au fond. Retournez l’ancien flacon sur le nouveau flacon contenant de la pâte de levure, en vous assurant que les bords des deux flacons sont alignés pour empêcher les mouches de s’échapper.
    3. Tapotez ces flacons ensemble pour transférer les mouches de l’ancien flacon vers la partie inférieure du nouveau flacon. Une fois les mouches transférées, remettez solidement les bouchons de coton sur les nouveaux et les anciens flacons. Attendez 3 jours. La pâte de levure peut être conservée chez RT pendant quelques jours.
      REMARQUE : Le transfert des mouches doit être effectué le plus rapidement possible car les mouches ne seront étourdies que temporairement.
    4. Préparez une solution d’acide propionique à 0,5 % en diluant 250 μL de stock d’acide propionique dans 50 mL de TDW. Stockez-le chez RT.
    5. Le 3ème jour, préparez une solution de travail de biotine de 100 μM en diluant 1 stock de biotine M dans TDW, puis ajoutez 500 μL d’acide propionique à 0,5 %. Mélangez la solution de travail de biotine avec de la poudre de levure sèche et remuez jusqu’à ce qu’elle forme une pâte. Ajoutez une cuillerée de pâte de biotine et de levure sur la paroi du flacon alimentaire de biotine. La pâte de biotine et de levure peut être conservée chez RT pendant quelques jours.
    6. Divisez les mouches en deux groupes. Gardez un groupe dans le flacon alimentaire normal comme contrôle et transférez l’autre groupe dans le flacon alimentaire à la biotine (pâte de biotine et de levure ajoutée) pour commencer la biotinylation. Après 16 h de biotinylation, transférer les mouches dans un nouveau flacon alimentaire normal.
      REMARQUE : Nous avons précédemment effectué un test d’alimentation en biotine pendant 4 h, 8 h et 16 h. Le signal de biotinylation était le plus fort après 16 h d’alimentation, nous avons donc choisi ce point temporel pour des expériences subséquentielles.
  3. Collection d’ovaires de drosophile
    1. Mettez les mouches dans le coussin de mouches CO2 , gardez les femelles et jetez les mâles. Une fois que les mouches ont été correctement anesthésiées (ne bougeant plus), pipetez 1 mL de milieu anti-insectes froid de Grace dans la boîte de dissection.
    2. Prenez une mouche vers la boîte de dissection à l’aide d’une pince à pointe fine et laissez-la s’immerger dans le milieu. Tenez le thorax de la mouche avec des pinces, attention à ne pas écraser le corps. Ensuite, à l’aide d’une autre pince, vous pouvez retirer délicatement l’extrémité de l’abdomen postérieur (où se trouve la partie génitale).
    3. Utilisez la pince pour presser lentement les ovaires (en commençant par le haut de l’abdomen vers le bas).
    4. Une fois qu’ils sont sortis, retirez les filets musculaires et les autres tissus qui entourent les ovaires. Attention à ne pas endommager les ovaires.
    5. Transférez soigneusement les ovaires propres dans un tube de 1,7 mL à l’aide d’une pince ; Gardez le tube sur de la glace. Répétez les étapes 1.3.2 à 1.3.4 pour les mouches suivantes.
    6. Faites pivoter le tube à 3 500 x g pendant 30 s à 4 °C, puis retirez le fluide restant à l’aide d’embouts de micropipettes. Attention à ne pas toucher les ovaires.
    7. Congelez le tube avec de l’azote liquide, puis conservez les ovaires à -80 °C. Les échantillons d’ovaires sont stables pendant 1 an.

2. Expression du transgène et détection de protéines biotinylées par Western blot

REMARQUE : Pour le dosage par transfert Western, prélever environ cinq paires d’ovaires par échantillon.

  1. Lyse tissulaire
    1. Décongelez le tissu ovarien congelé. Ajouter 50 μL de tampon de lyse RIPA (50 mM de Tris-HCl pH 8, 150 mM de NaCl, 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), 0,5 % de désoxycholate de sodium, 1 % de Triton X-100), complété par 1 cocktail d’inhibiteurs de protéase (PI) et 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF). Stocker le tampon de lyse RIPA (sans 1x cocktail PI et 1 mM PMSF) à 4 °C.
      REMARQUE : Le cocktail PI et le PMSF ne doivent être ajoutés que juste avant l’expérience.
    2. Perturber les ovaires à l’aide d’un homogénéisateur manuel couplé à un pilon en plastique (1 min par tube). Un processus de lyse tissulaire sur glace pendant 10 min est nécessaire pour assurer une lyse complète, suivie d’une homogénéisation.
    3. Centrifuger à 13 500 x g pendant 10 min à 4 °C pour séparer le lysat de protéines des débris.
    4. Pipetez le lysat de protéines claires dans un nouveau tube de 1,7 ml (évitez de prendre la couche lipidique sur le dessus), puis conservez le lysat à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement.
  2. Mesure de la concentration en protéines par dosage de l’acide bicchoninique (BCA)
    1. Préparez le réactif de travail (WR) à l’acide bicchoninique (BCA) en mélangeant le réactif A et le réactif B dans un rapport de 50:1. Mélanger 1 μL de lysat ou d’étalon BSA dilué avec 200 μL de WR dans une plaque de 96 puits (en doubles), puis incuber la plaque à 37 °C pendant 30 min.
      1. Calculez la quantité de WR nécessaire à l’aide de cette formule :
        (# étalons + # échantillons) × (# répétitions) × (volume WR par échantillon)
        Pour réaliser un ensemble d’étalons protéiques, préparer plusieurs dilutions de 2 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) dans un tampon de lyse RIPA (sans cocktail PI ni PMSF) avec des concentrations finales de 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 et 2000 μg/mL.
    2. Mesurez l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques à une longueur d’onde de 495 nm. Générez une courbe standard à partir des valeurs d’absorbance BSA, puis déterminez la concentration en protéines.
  3. Dosage par transfert Western
    1. Électrophorèse
      1. Ajoutez 30 à 50 μg de lysat de protéines dans le tampon de chargement 2x SDS. Ajouter de la TDW (si nécessaire) pour obtenir une concentration finale de protéines de 2 μg/μL et une concentration finale de 1x SDS, puis faire bouillir l’échantillon à 95 °C pendant 10 min.
      2. Préparez la mémoire tampon en mélangeant 25 ml de 20 tampons MOPS avec 500 ml de TDW pour obtenir 1 fois la concentration de tampon courant. Stockez-le chez RT.
      3. Rincez les puits de gel Bis-Tris avec 1 mL de tampon courant (3x), puis placez le gel Bis-Tris dans la chambre d’électrophorèse. Remplissez la face avant de la chambre avec le nouveau tampon jusqu’à ce que tous les puits soient immergés (± 250 ml). Remplissez l’arrière de la chambre avec le tampon de fonctionnement utilisé (la moitié du volume du nouveau tampon de fonctionnement utilisé est suffisante).
      4. Chargez l’échantillon sur du gel Bis-Tris et utilisez 4 μL d’échelle de protéines précolorées comme marqueur. Effectuer une électrophorèse (200 V, 30 min). Retirez le gel de la cassette et rincez-le avec TDW.
    2. Transfert de membrane
      1. Préparez un tampon de transfert en ajoutant 20 ml de tampon de transfert (25 fois le stock) et 50 ml de méthanol dans 430 ml de TDW.
      2. Disposez un sandwich composé de tampons buvards, de papier filtre, de gel et d’une membrane nitrocellulosique dans un module de transfert. Avant d’empiler une nouvelle couche, utilisez un rouleau pour enlever les bulles.
      3. Installez le module de transfert sur la chambre de transfert, puis remplissez la chambre avec 500 ml de tampon de transfert. Transfère les protéines pendant 1 h à 175 mA.
        REMARQUE : Le tampon de transfert doit être fraîchement préparé avant l’expérience.
    3. Bloquant
      1. Ajouter 5 ml de pâte Tween20 dans 45 ml de TDW pour obtenir une solution mère Tween20 à 10 %. Dissoudre deux comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans 400 mL de TDW. Retirer 4 mL de solution, puis ajouter 4 mL de Tween20 à 10 % (concentration finale de 0,1 %) pour obtenir 1 solution de PBST. Stockez-le chez RT.
      2. Retirez la membrane tamponnée de la chambre de transfert, puis rincez-la avec 1x PBST.
        REMARQUE : Si la membrane doit être incubée avec différents anticorps, coupez-la avec une lame en acier inoxydable propre en fonction de la taille des protéines attendue avant d’effectuer l’étape de blocage.
      3. Pour vérifier l’expression des gènes, utilisez 2 % de BSA dans 1x PBST pour l’étape de blocage (1 h, RT). Préparez une solution de BSA à 2 % en ajoutant 1 g de BSA dans 50 ml de 1x PBST. Pour la détection des protéines biotinylées, effectuez le blocage à l’aide de 3 % de BSA dans 1 PBST (pendant la nuit, 4 °C). Dissoudre 1,5 g de poudre de BSA dans 50 mL de 1x PBST pour obtenir une solution de BSA à 3 %. Stockez les solutions de blocage à 4 °C.
        REMARQUE : Le BSA utilisé est différent de celui utilisé dans le test BCA. Le BSA pour le dosage BCA fait partie du kit BCA.
    4. Incubation primaire de l’anticorps
      1. Diluer 1 μL de α-V5 dans 10 mL de BSA à 2 % (1:10 000) et 10 μL de gène d’entretien α-HSP90 dans de BSA à 2 % (1:1 000). Ajouter 2,7 μL de conjugué streptavidine-peroxydase de raifort (SA-HRP) dans 9 mL de 1x solution de PBST pour obtenir 0,3 μg/mL DE SOLUTION SA-HRP.
      2. Pour vérifier l’expression des gènes, incubez la membrane avec l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C. Pour la détection des protéines biotinylées, incuber la membrane pendant 1 h à 4 °C. Conservez l’anticorps primaire à 4 °C. Il peut être utilisé plusieurs fois.
      3. Laver la membrane avec 1x PBST pour 3x à RT pendant 15 min chacun.
    5. Incubation secondaire d’anticorps
      1. Préparez une solution secondaire d’anticorps en ajoutant 2 μL d’IgG anti-lapin ou anti-souris (peroxydase de raifort [HRP conjuguée]) dans 10 ml de BSA à 2 % (1:5 000).
        REMARQUE : Pour la SA-HRP, un anticorps secondaire n’est pas nécessaire. Passez directement à l’étape de visualisation. Les anticorps secondaires doivent être fraîchement dilués avant l’expérience.
      2. Incuber la membrane dans une solution d’anticorps secondaire pendant 40 min à RT. Laver la membrane avec 1x PBST pendant 3x à RT pendant 15 min chacune.
    6. Détection de protéines par méthode de chimiluminescence assistée (ECL)
      1. Mélangez 750 μL de luminol et 750 μL de solution HRP (rapport 1:1). Gardez la membrane humide dans le tampon de lavage pendant la préparation du mélange.
        REMARQUE :Ce mélange doit être fraîchement préparé avant l’expérience. Comme les produits chimiques sont sensibles à la lumière, gardez-les à l’abri de la lumière du soleil ou d’autres sources de lumière intense (une exposition à court terme à l’éclairage du laboratoire est acceptable).
      2. Trempez la membrane dans la solution pendant 30 s, puis placez-la entre des feuilles de plastique transparentes. Observez les bandes de protéines tamponnées avec un instrument Chemidoc.

3. Validation de l’expression et de la localisation des transgènes par coloration par immunofluorescence

REMARQUE : Pour vérifier l’expression et la localisation des gènes, disséquez environ cinq paires d’ovaires par échantillon de femelles âgées de 2 jours nourries avec de la pâte de levure. Les jeunes ovaires contiennent principalement des chambres d’ovules aux premiers stades, qui sont idéales pour la coloration par immunofluorescence en raison de l’abondance de cellules nourricières (cellules germinales) et de leurs membranes relativement perméables17. Les stades tardifs des chambres d’œufs sont plus rigides et difficiles à pénétrer en raison de la formation du complexe de coquille d’œuf, qui commence au stade 918. Pour le test de biotinylation des protéines, disséquez environ cinq paires d’ovaires par échantillon de femelles âgées de 4 jours nourries à la biotine, comme décrit à l’étape 1.2.

  1. Préparation des échantillons
    1. Maintenez la partie postérieure d’un ovaire disséqué en place à l’aide d’une pince. À l’aide d’une autre pince, séparez doucement l’ovaire en chambres d’ovules individuelles. Travaillez avec soin pour éviter de rompre les chambres à œufs. Le protocole d’isolement de la chambre d’œuf a été décrit en détail dansla section 19. Pipetez soigneusement les chambres à œufs dans un tube de 1,7 ml, puis lavez-les avec 1 ml de 1x PBS (RT). Coupez le bord des pointes de pipette avant de pipeter pour éviter que les chambres des œufs ne se coincent dans les pointes.
      REMARQUE : N’utilisez des chambres à œufs qu’au stade ≤ 9 (transparentes). Jetez les ovocytes matures et les chambres d’ovules à un stade avancé ≥ 10. Le pipetage fera flotter les chambres à œufs dans la solution. Par conséquent, laissez les chambres d’œufs se déposer au fond (pendant 5 min) avant de passer aux étapes suivantes.
  2. Fixation
    1. Diluer 3,125 mL de formaldéhyde à 16 % (FA) dans 6,875 mL de 1x PBS pour obtenir une solution à 5 % de FA. Stockez-le chez RT.
      REMARQUE : FA est sensible à la lumière, alors gardez-le à l’abri de la lumière.
    2. Pipeter 1 mL de formaldéhyde à 5 % (FA) dans le tube contenant les ovocytes. Placez le tube sur le multi-rotateur, puis fixez les ovocytes pendant 30 min.
      REMARQUE : De la fixation jusqu’à l’étape de coloration nucléaire, les expériences sont effectuées sur un multi-rotateur avec une rotation douce.
    3. Préparez 0,5 % de Triton X-100 dans 1 PBS (1 x PBT) comme solution de lavage en ajoutant 10 ml de Triton X-100 à 10 % dans 190 ml de 1 PBS. Stockez-le chez RT.
    4. Rincer 1 fois les chambres à œufs fixes, puis laver 3 fois à RT pendant 10 min. Utilisez 1 ml de 1x PBT pour les étapes de rinçage et de lavage.
  3. Bloquant
    1. Préparez du sérum de bovin fœtal à 5 % en ajoutant 250 μL de stock FBS dans 4,75 ml de 1x PBT.
      REMARQUE : Cette solution doit être fraîchement préparée avant l’expérience.
    2. Ajouter 1 mL de FBS à 5 % dans le tube et effectuer l’étape de blocage pendant 1 h à RT. Rincer les ovocytes 1x.
  4. Incubation primaire de l’anticorps
    1. Pour vérifier l’expression et la localisation du transgène, diluez 2 μL de α-V5 et 2 μL de α-ATP5A ou α-Tom20 (en tant que marqueur mitochondrial) dans 400 μL de 1x PBT (rapport 1:200).
      REMARQUE : Bien que deux anticorps puissent être utilisés ensemble pour colorer un échantillon, leurs hôtes doivent être différents. Il s’agit d’éviter le chevauchement de la liaison des anticorps secondaires ultérieurs.
    2. Incuber des chambres d’œufs avec 400 μL de solution d’anticorps primaires diluée (pendant la nuit, 4 °C).
      REMARQUE : À l’instar du test Western blot, les anticorps primaires peuvent être utilisés plusieurs fois pour l’immunomarquage. Avant de conserver une solution d’anticorps, assurez-vous qu’elle ne contient pas de chambres à œufs.
    3. Rincer les chambres à œufs 1 fois, puis laver 3 fois à RT pendant 10 min.
  5. Incubation secondaire d’anticorps
    1. Diluer 2 μL d’IgG α-Rb de chèvre Alexa Fluor 488 et 2 μL d’IgG α-M de chèvre Alexa Fluor 594 dans 400 μL de 1x PBT (rapport 1:200). Incuber des chambres d’œufs avec 400 μL de solution d’anticorps secondaires diluée pendant 2 h à RT. Pour la détection de la biotinylation, ajoutez 2 μL d’Alexa Fluor 594 conjugué à la streptavidine à 1x PBT (rapport 1:200) et incubez avec un anticorps secondaire.
      REMARQUE : À partir de cette étape, protégez l’échantillon de la lumière. Les anticorps secondaires doivent être fraîchement dilués avant l’expérience. Plusieurs anticorps secondaires peuvent être utilisés ensemble, mais chaque anticorps primaire doit être attribué à différents fluorophores provenant de différents hôtes afin d’éviter le chevauchement des signaux. Par exemple, 488 Chèvre α-Rb se liera au lapin α-V5. Quant à l’α-ATP5A de souris, 594 Goat α-M est utilisé comme anticorps secondaire complémentaire. Dans le cas de la détection de la biotinylation, l’utilisation d’autres colorants ayant la même longueur d’onde que le conjugué de streptavidine doit être omise.
    2. Rincer les chambres à œufs 1 fois, puis laver 3 fois à RT pendant 10 min.
  6. Coloration nucléaire
    1. Diluer 1 μL de DAPI dans 1 mL de 1x PBS (rapport 1:1 000). Incuber les chambres d’œufs avec 1 mL de solution de DAPI dilué pendant 5 min à RT.
      REMARQUE : Le DAPI doit être fraîchement dilué avant l’expérience.
    2. Rincer les chambres à œufs 1 fois, puis laver 3 fois à RT pendant 10 min.
      REMARQUE : Les chambres à œufs peuvent être stockées dans 1x solution PBS à 4 °C pendant quelques heures avant le montage, mais il est recommandé de procéder dès que possible.
  7. Montage sur glissière
    1. Nettoyez la lame de verre avec un chiffon non pelucheux, puis notez les informations sur l’échantillon dessus. Retirez 1x PBS du tube, mais laissez une petite quantité pour éviter la sécheresse.
    2. Coupez le bord des pointes de micropipette, puis pipetez soigneusement les chambres d’œuf sur la lame de verre. À l’aide d’une pince, répartissez soigneusement les chambres d’œufs sur la lame de verre et évitez toute agglutination. Observez les lames au microscope (un grossissement de 2x est suffisant) pour vous assurer que les chambres des œufs sont uniformément réparties.
    3. Retirez le PBS restant de la lame de verre à l’aide d’une micropipette. Pipetez 15 à 30 μL de solution anti-décoloration (sensible à la lumière) sur la lame de verre et assurez-vous qu’elle entre en contact avec toutes les chambres d’œufs.
    4. À l’aide d’une pince, tenez le bord du couvercle de la diapositive, puis placez-le sur le dessus de la lame de verre (en commençant d’un bord à l’autre) de manière à ce qu’il recouvre les chambres à œufs. Faites-le lentement pour éviter les bulles. Épongez l’excès de solution avec un chiffon non pelucheux, puis scellez les bords de la lamelle à l’aide de vernis à ongles. Laissez bien sécher le vernis à ongles (± 5 min).
    5. Imagez les lames avec un microscope confocal. Stockez les lames à -20 °C.

4. Enrichissement en peptides biotinylés pour l’analyse par spectrométrie de masse

REMARQUE : Environ 3 mg de protéines sont nécessaires pour l’échantillon de spectrométrie de masse. Par conséquent, disséquez environ 100 paires d’ovaires pour obtenir cette quantité.

  1. Lyse tissulaire
    1. Décongelez le tissu ovarien congelé. Pendant ce temps, préparez 1 solution saline tamponnée de Tris (TBS) en dissolvant 1 comprimé de TBS dans 500 mL de TDW. Conservez-le chez RT. Préparez une FDS de 2 % dans 1 TBS comme tampon de lyse en diluant 4 ml de stock de FDS à 10 % dans 16 mL de 1 TBS. Conservez-le chez RT.
    2. Ajouter 500 μL de SDS à 2 % dans 1x TBS (complété par 1x cocktail PI) dans le tube contenant les ovaires. Attendez plusieurs minutes jusqu’à ce que les cellules soient lysées et que la solution devienne collante.
    3. Pipette lysat à un millitube de 1 ml contenant une fibre d’acoustique focalisée adaptative (AFA). Coupez les pointes de pipette avant utilisation. Pour assurer une sonication efficace, transférez un maximum de 500 μL de lysat par tube.
    4. Effectuer la sonication dans les conditions suivantes : puissance incidente de crête 75 W, facteur de service 10 %, cycles par rafale 200, temps 180 s, température 6 °C.
      REMARQUE : Si un échantillon doit être soumis à la sonication plusieurs fois, configurez des intervalles entre les deux pour éviter de générer un excès de chaleur.
  2. Précipitation d’acétone
    1. Déplacez le lysat dans un tube de 5 ml à faible liaison, puis ajoutez de l’acétone froide dans le tube à 6 fois le volume de l’échantillon. Par exemple, ajoutez 3 ml d’acétone à 500 μL de lysat.
      REMARQUE : L’acétone doit être pré-refroidie à -20 °C avant utilisation.
    2. Tube vortex, chargez-le dans un multi-rotateur et incubez pendant une nuit (± 16 h) à -20 °C.
      REMARQUE : Il s’agit d’un point d’arrêt, ce qui signifie que l’expérience peut être momentanément interrompue après cette étape.
    3. Protéines précipitées par granulés à 15 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Jeter le surnageant, puis faire tourner le tube à 4 °C.
    4. Ajouter 2 ml d’une solution de mélange composée de 90 % d’acétone froide et de 10 % de 1 TBS. Pipeter de haut en bas pour mélanger la pastille et la solution. Coupez les pointes de pipette avant utilisation.
    5. Tube vortex, puis chargez-le dans le multi-rotateur et incubez pendant 2 h à -20 °C.
    6. Protéines en granulés à 15 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Jetez le surnageant, puis faites-le tourner dans le tube à 4 °C. Ouvrez le tube et faites sécher la pastille à l’air libre pendant 10 min.
      REMARQUE : Ne séchez pas trop le granulé car il sera difficile de le remettre en suspension plus tard.
    7. Préparez une solution mère de bicarbonate d’ammonium (ABC) de 500 mM en dissolvant 0,7906 g d’ABC dans 20 mL de TDW. Préparez une solution de travail ABC de 50 mM en diluant 3 mL de solution mère ABC de 500 mM dans 27 mL de TDW.
    8. Préparez une solution d’urée à 8 M en ajoutant 0,4805 g d’urée dans 1 mL de 50 mM d’ABC.
      REMARQUE : La solution d’urée doit être fraîchement préparée avant l’expérience.
    9. Mettre en suspension la pastille de protéine dans 500 μL d’urée 8 M. Le volume de 8 M d’urée peut être réduit pour augmenter la concentration en protéines.
    10. Transférez la protéine remise en suspension dans un millitube de 1 ml contenant de la fibre AFA, puis effectuez la sonication dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 4.1.4.
    11. Effectuer un dosage BCA pour déterminer la concentration en protéines. Cette étape est un point d’arrêt. Conservez l’échantillon de protéines à 4 °C jusqu’à nouvel ordre.
  3. Digestion de la trypsine
    1. Mélanger 3 mg de protéines avec TDW (si nécessaire) dans un tube de 5 mL à faible liaison pour obtenir un total de 500 μL de solution.
    2. Dénature les protéines à l’aide d’un thermobloc à 450 tr/min pendant 1 h à 37 °C.
    3. Ajouter 5 μL de DTT 1 M (dissous dans TDW) dans le tube pour obtenir une concentration finale de 10 mM de DTT, puis réduire les protéines à l’aide d’un thermobloc à 450 tr/min pendant 1 h à 37 °C.
    4. Préparez 400 mM d’iodoacétamide en dissolvant 0,0111 g d’iodoacétamide dans 150 μL d’ABC. Ajouter 55 μL d’iodoacétamide 400 mM dans le tube (concentration finale 40 mM), puis alkylat des protéines à l’aide d’un thermobloc à 450 tr/min pendant 1 h à 37 °C.
      REMARQUE : L’iodoacétamide est sensible à la lumière, et toutes les solutions d’iodoacétamide doivent être fraîchement préparées avant l’expérience.
    5. Diluer l’échantillon en ajoutant 50 mM de solution ABC jusqu’à ce que le volume total atteigne 4 mL. Après dilution, la concentration d’urée dans la solution est d’environ 1 M.
    6. Préparez 1 M de solution mère de CaCl2 en dissolvant 1,1098 g de CaCl2 dans 10 mL de TDW. Ajouter 4 μL de 1 M de CaCl2 dans le tube pour obtenir une concentration finale de 1 mM, puis pipeter de haut en bas pour homogénéiser la solution.
    7. Préparez une solution mère de trypsine à 1 mg/mL en ajoutant 0,001 g de trypsine à 1 mL d’ABC. Ajouter 150 μL de trypsine dans le tube (trypsine : échantillon = rapport 1:20). Digérer les protéines à l’aide du thermobloc à 450 tr/min pendant 16 h à 37 °C.
      REMARQUE : La trypsine doit être fraîchement dissoute avant l’expérience. Cette étape est un point d’arrêt. Conservez les peptides digérés à 4 °C jusqu’à nouvel ordre.
  4. Enrichissement en peptides biotinylés
    REMARQUE : Les tampons de lavage et d’élution doivent être fraîchement préparés avant l’expérience.
    1. Préparez 2 M d’urée dans 1 solution de TBS en ajoutant 1,2012 g d’urée dans 10 ml de 1 x TBS.
    2. Utiliser 150 μL de billes magnétiques conjuguées à la streptavidine par échantillon de 3 mg. Lavez les billes de streptavidine avec 1 ml d’urée 2 M dans 1 cuillère à soupe. Répétez cette étape 4 fois. Après chaque lavage, placez le tube sur une grille magnétique pendant 1 min, puis jetez le tampon de lavage.
      REMARQUE : Les billes magnétiques de perçage de streptavidine sont recommandées car elles minimisent les signaux de fond de type PEG dans les résultats de spectrométrie de masse.
    3. Pipeter 1 mL de peptides digérés dans le tube contenant la perle, mélanger délicatement, puis combiner le mélange avec l’échantillon restant dans un tube de 5 mL à faible liaison. Placez le tube sur un multi-rotateur et incubez pendant 1 h à RT.
    4. Transférez 1 ml du mélange dans un tube de 1,5 ml et placez-le sur la grille magnétique pendant 1 min. Jetez le surnageant. Répétez cette étape jusqu’à ce que toutes les perles soient collectées.
    5. Préparez 2 M d’urée dans 50 mM d’ABC en dissolvant 0,7207 g d’urée dans 6 mL de 50 mM d’ABC. Laver les billes avec 1 mL d’urée 2 m en 50 mM 2x et avec 1 mL de TDW une fois. Après chaque lavage, placez le tube sur une grille magnétique pendant 1 min, puis jetez le tampon de lavage.
    6. Préparez une solution mère d’acide formique à 10 % en dissolvant 1 mL d’acide formique dans 9 mL de TDW. Préparez le tampon d’élution composé de 80 % d’acétonitrile et de 0,1 % d’acide formique dans TDW. Par exemple, mélangez 1,2 ml d’acétonitrile, 15 μL d’acide formique à 10 % et 285 μL de TDW pour obtenir un tampon d’élution de 1,5 mL.
      ATTENTION : L’acétonitrile et l’acide formique sont nocifs en raison de leurs propriétés volatiles, alors portez un masque et soyez prudent lorsque vous les manipulez.
    7. Pipeter 100 μL de tampon d’élution dans le tube, homogénéiser doucement puis éluer les peptides à l’aide d’un thermobloc à 300 tr/min pendant 5 min à 60 °C. Après l’élution, placez le tube sur un support magnétique et transférez l’éluat dans un nouveau tube de 1,5 ml. Évitez de prendre des billes lors du transfert de l’éluat. Répétez cette étape 5 fois.
    8. Placez le tube contenant 500 μL d’éluat sur une grille magnétique pendant 5 min, puis transférez-le dans un nouveau tube de 1,5 mL pour assurer l’élimination complète des billes. Les échantillons élués peuvent ensuite être séchés et utilisés pour l’analyse par spectrométrie de masse.
    9. Pour plus d’informations sur l’analyse LC-MS/MS d’échantillons de peptides enrichis et le traitement des données MS, consultez Nguyen et al.20.

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Résultats

Des exemples de résultats sont illustrés dans les figures 1, 2, 3 et 4 publiées précédemment par Nguyen et al.20. La figure 1 illustre la procédure expérimentale de la PL à base de TurboID dans l’ovaire de la drosophile . Tout d’abord, une construction combinant Zuc et TurboID a été générée (Zuc-V5-TurboID). ...

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Discussion

Ici, nous fournissons une procédure complète pour le marquage de proximité (PL) basé sur TurboID dans l’ovaire de la drosophile , développée grâce à un dépannage approfondi pour surmonter divers défis. L’un des principaux problèmes concernait les constructions génétiques, car les différentes dispositions de fusion affectaient considérablement l’expression des protéines et l’efficacité de la biotinylation. Par exemple, NES-V5-TurboID a montré une expression et une biotinylation p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire pour leurs discussions et leur aide. Ce travail a été soutenu par la National Research Foundation (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (RS-2024-00345327 à M.L. ; RS-2023-00219563 à M.L.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps >
Anticorps secondaires anti-IgG de souris (H+L), HRPInvitrogen31430qualité analytique et sensible
Anticorps secondaire anti-IgG de lapin (H+L) hautement adsorbé de croisement, alexa fluor plus 488InvitrogenA32731de chèvre de qualité analytique
sensible à la lumière, HRPInvitrogen31460Qualité analytique, sensible à la lumière
Anticorps HSP90 (lapin)Technologie de signalisation cellulaire4874Anticorps polyclonal
Pierce Protéine de streptavidine, HRPThermo Fisher Scientific21126Qualité analytique
Streptavidine, Conjugué Alexa Fluor 594InvitrogenS11227Sensible à la lumière, qualité
analytiqueAnticorps V5-tag (souris)InvitrogenR960-25Anticorps monoclonal
Anticorps V5-tag (lapin) (D3H8Q)Cell Signaling Technology13202Anticorps monoclonal
Fly LinesCompany<>Numéro de catalogueComments/Description
pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3Korea Drosophila Stock Center2373-2Crosse
pUASp Zucchini V5-TurboID/CyoKorea Drosophila Stock Center2188Crosse
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/CyoKorea Drosophila Stock Center2635-4Crosse
w[*] ; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stock Center7062Fly stock
Equipments and ConsommablesCompanyNuméro de catalogueComments/Description
Balance analytiqueMettler ToledoME2040,1 mg lisibilité
Amersham Protran 0.45 NC nitrocellulose western blot membranes (300 mm × ; 4 m)Cytiva
10600002-Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge TubeCorningMCT-175-CCo-polymère
MARQUE  ; Verre de protection (22 mm x 22 mm)Sigma-AldrichBR470055Verre borosilicaté
Pointes de pipette en vrac (10 µ ; L)Vertex4110N00
Pointes de pipette en vrac au propylène (1000 & micro ; L)Vertex4330N00
Pointes de pipette en vrac au propylène (200 µ ; L)propylèneVertex4230N00
(96 puits)Centrifugeuse enpolystyrène 300096 à fond plat
(avec rotor tubulaire de 1,5 à 2 ml)Eppendorf5424 RCentrifugeuse réfrigérée à angle fixe
(avec rotor tubulaire de 5 ml)Eppendorf5425 RCuillère chimique réfrigérée à angle fixe
--
Système d’imagerie ChemiDocBiorad12003153Western blot
CO2 coussin anti-mouches--Panneau d’anesthésie
CO2 et régulateur--Attention aux gaz à haute pression et aux étourdissements
Incubateur compactJSRJSGI-10TAttention aux hautes pressions température Microscope
confocal à balayage laserZeissLSM 710Attention au faisceau laser intense
Tube conique (15 mL)SPL50015Polypropylène /Polyéthylène haute densité  ;
Tube conique (50 mL)SPL50050Polypropylène /Polyéthylène haute densité  ;
Balance numérique---
Minuterie numérique---
Parabole de dissection--en silicone
Dumont  ;Outils scientifiques fins11252-00Pointes super fines, prudence des objets pointus
Aimant DynaMag-2Invitrogen12321DPour tubes de microcentrifugation de 1,5 à 2 ml
Fisherbrand  ; Lames de microscope Superfrost Plus (25 mm x 75 mm)Fisher Scientific12-550-15Attention aux objets pointus
Bouteilles de nourriture pour mouches (avec bouchon en papier)Hansol TechFFB-21010-Flacons
de nourriture pour mouches (avec bouchon en coton)Hansol TechFFV-11010-Focaled-ultrasonicator
CovarisM220Attention aux ondes ultrasonores
Couteau à gelInvitrogenEI9010Acier inoxydable avec poignée en plastique
Grade 3MM Papier buvard Chr (46 cm × ; 57 cm)Cytiva3030-917Papier Whatmann
Homogénéisateur à main et pilon en plastiqueKimble749540-0000Moteur sans fil
Bloc thermiquePCR finALB6400Attention aux
tissus non pelucheuxYuhan-Kimberly41112-
Azote liquide--Attention aux engelures et aux brûlures
Spectrophotomètre de microplaquesAgilent TechnologiesEpochOptique basée sur un monochromateur
Micro-ondes--Attention à haute température
milliTUBE 1 mL AFA fibreCovarisPN 520135Verre
Mini réservoirde gel Thermo Fisher ScientificA25977Mise en garde des
mini gels de protéines NuPAGE Bis-tris à haute température, 4&ndash ; 12 %, 1,0 et 1,0 ; 1,5 mm, 10 puitsInvitrogenNP0323BOXContient du polyacrylamide, mise en garde contre la toxicité
NuPAGE Bis-tris mini gels de protéines, 4 po ; 12 %, 1,0 et 1,0 ; 1,5 mm, 15 puitsInvitrogenNP0321BOXContient du polyacrylamide, attention à la toxicité
Pinceau (Ø ; 1,8 mm)Hwa hong791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006MMicropipette monocanal avec éjecteur métallique
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005MMicropipette monocanal avec éjecteur métallique
Pipetman L ( P20L)GilsonFA10003MMicropipette monocanal avec éjecteur métallique
Pipetman L (P2L)GilsonFA10001MMicropipette monocanal avec éjecteur métallique
Alimentation PrincipalessciencesMP-310Attention à l’électricité haute tension
Rotateur programmableBiosanRS-24-Protein
LoBind  ; tubesEppendorf30108302-Lame de
rasoirDorco304020Acier inoxydable, prudence des objets pointus
Rouleau---
Pipette sérologique (10 mL)SPL91010polystyrène
(25 mL)SPL91025polystyrène
(5 mL)SPL91005en polystyrène
(50 mL)SPL91050en polystyrène
(1,5 mL)Thermo Scientific3451PKen polypropylène
InvitrogenEI9052-Stéréomicroscope
ZeissStemi 508-Stéréomicroscope
  ;Leica
ThermoMixer  ; CEppendorf5382000015Avec blocs de 1,5 et 5 ml
Pince à épilerAven Tools18526Plastique, pointes plates
Mélangeur vortexScientific IndustriesSI-0236-XCell
II Module BlotInvitrogenEI9051Attention aux
températures élevées XCell  ; SureLock mini-celluleInvitrogenEI0001Attention aux
produits chimiques haute températureEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires/Description
AcétoneSigma-Aldrich650501Qualité analytique
AcétonitrileSupelco1.00029.1000Grade LC-MS, mise en garde contre la toxicité par inhalation et les ampoules étalons d’albumine inflammables
(contenant de l’albumine sérique bovine (BSA) à 2 mg/mL dans une solution saline à 0,9 % et de l’azoture de sodium à 0,05 %)Thermo Scientific23209Fait partie des kits de dosage des protéines Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Albumine, sérum bovinBioshopALB001Bicarbonate
d’ammoniumSigma-Aldrich09830Biotine de qualité analytique
  ;Sigma-AldrichB4639Qualité de culture cellulaire et tissulaire
Chlorure de calcium (CaCl2)Sigma-AldrichC5670Qualité de culture cellulaire
Clarté substrat ECL occidentalBiorad1705060Qualité analytique
DAPISigma-AldrichMBD0015Sensible à la lumière, qualité analytique
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861Qualité analytique
Sérum fœtal bovinCorning35-015-CVQualité de culture cellulaire
Acide formiqueSigma-AldrichF0507Qualité réactif, mise en garde contre la toxicité par inhalation
Milieu d’insecte de GraceGibco11595030Qualité de culture cellulaire
Levure sèche instantanéeNon de marqueN1019-
IodoacétamideSigma-AldrichI1149Sensible à la lumière, qualité analytique
Méthanol Carlo Erba41484Qualité analytique
Vernis à ongles--Novex Tris-glycine de type transparent
(2X)InvitrogenLC2676Tampon de
fonctionnement NuPAGE MOPS SDS de qualité analytique (20X)InvitrogenNP0001Qualité analytique
PageRuler Échelle de protéines pré-coloréesThermo Fisher Scientific26616Qualité analytique
Fluorure de phénylméthanesulfonyle  ;Thermo Fisher Scientific36978Qualité analytique
Tampon phosphate salinSigma-AldrichP4417Qualité analytique
Pierce 16 % Formaldéhyde (p/v)Thermo Fisher Scientific28908Qualité analytique, sensible à la lumière
Pierce Kits de dosage des protéines ThermoScientific23225Qualité analytique
Réactif A Pierce BCA (contenant du carbonate de sodium, du bicarbonate de sodium, de l’acide bicinchoninique et du tartrate de sodium dans de l’hydroxyde de sodium 0,1 M)Thermo Scientific23228Fait partie des kits de dosage des protéines Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Réactif B de Pierce BCA (contenant 4 % de sulfate cuivrique)Thermo Scientific1859078Partie des kits de dosage des protéines Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Acide propioniqueSigma-Aldrich402907Grade ACS
Cocktail d’inhibiteur de protéase IIICalbiochem539134Qualité de culture cellulaire et tissulaire
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36936
Chlorure de sodium (NaCl) sensible à la lumièreBioneerC-9025Qualité analytique
Désoxycholate de sodiumSigma-AldrichD6750Qualité analytique
Dodécylsulfate de sodiumSigma-Aldrich71736
Hydroxyde de sodium (NaOH)BiosesangSR2018-100-00Qualité analytique
Eau triplement distillée--Ultrapure (type 1)
Saline tamponnée au trisSigma-Aldrich94158de qualité analytique
Koma BiotechK0341001Qualité analytique
Tris-HCl, pH 8BioneerC-9006Qualité analytique
Triton x-100Sigma-Aldrich93443Qualité moléculaire
TrypsineThermo Fisher Scientific20233Qualité de culture cellulaire
Tween 20Sigma-AldrichP9416Qualité moléculaire
UréeSigma-AldrichU5378Moléculaire & Qualité culture cellulaire
Résistance aux IgG (H+L) anti-lapin de chèvre (H+L) de à la lumière Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) Plaque de culture cellulaire au en acier inoxydable Système d’imagerie Pince #5SF à haute température Pipette sérologique en Pipette sérologique en Pipette sérologique Tubes de microcentrifugation à faible rétention Tampon éponge de qualité analytique Tampon d’échantillon SDS Tampon de transfert de tris-glycine

Références

  1. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
  2. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by turboid. eLife. 8, e47864(2019).
  3. Qi, Y., Katagiri, F. Purification of low-abundance Arabidopsis plasma-membrane protein complexes and identification of candidate components. Plant J. 57 (5), 932-944 (2009).
  4. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with turboid. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  5. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  6. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  7. Quantitative Proteomics. , https://case.edu/medicine/nutrition/centers-and-collaborations/case-center-proteomics-and-bioinformatics/proteomics-and-small-molecule-mass-spectrometry-core/quantitative-proteomics (2025).
  8. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Meth. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  9. Ummethum, H., Hamperl, S. Proximity labeling techniques to study chromatin. Front Genet. 11, 450(2020).
  10. Han, S., Li, J., Ting, A. Y. Proximity labeling: Spatially resolved proteomic mapping for neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 50, 17-23 (2018).
  11. Nishimasu, H., et al. Structure and function of zucchini endoribonuclease in pirna biogenesis. Nature. 491 (7423), 284-287 (2012).
  12. Zamudio, N., et al. DNA methylation restrains transposons from adopting a chromatin signature permissive for meiotic recombination. Genes Dev. 29 (12), 1256-1270 (2015).
  13. Cha, S. J., et al. Therapeutic modulation of gsto activity rescues fus-associated neurotoxicity via deglutathionylation in als disease models. Dev Cell. 57 (6), 783-798.e8 (2022).
  14. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing Drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. J Undergrad Neurosci Educ. 11 (1), A139-A148 (2012).
  15. Feizy, N., et al. In vivo identification of Drosophila rhodopsin interaction partners by biotin proximity labeling. Sci Rep. 14 (1), 1986(1986).
  16. Zhang, B., Zhang, Y., Liu, J. L. Highly effective proximate labeling in Drosophila. G3. 11 (5), jkab077(2021).
  17. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  18. Waring, G. L. Morphogenesis of the eggshells in Drosophila. Int Rev Cytol. 198, 67-108 (2000).
  19. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), e3679(2012).
  20. Nguyen, T. T. M., et al. In vivo profiling of the zucchini proximal proteome in the Drosophila ovary. Development. 150 (4), dev201220(2023).
  21. Ahmadi, S., Winter, D. Identification of poly(ethylene glycol) and poly(ethylene glycol)-based detergents using peptide search engines. Anal Chem. 90 (11), 6594-6600 (2018).
  22. Zada, A., Khan, I., Zhang, M., Cheng, Y., Hu, X. Airid-based proximity labeling for protein-protein interaction in plants. J Vis Exp. (187), e64428(2022).
  23. Fang, B., et al. Lowering sample requirements to study tyrosine kinase signaling using phosphoproteomics with the tmt calibrator approach. Proteomics. 20 (24), 2000116(2020).
  24. Park, N., et al. One-stage tip method for tmt-based proteomic analysis of a minimal amount of cells. ACS Omega. 8 (22), 19741-19751 (2023).
  25. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. J Vis Exp. (159), e60728(2020).
  26. Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Res. 8, Faculty Rev-135 F1000(2019).
  27. Wei, X. F., Li, S., Hu, J. L. A turboid-based proximity labelling approach for identifying the DNA-binding proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102139(2023).
  28. Bosch, J. A., Chen, C. L., Perrimon, N. Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update. WIREs Dev Biol. 10 (1), e392(2021).
  29. Rayaprolu, S., et al. Cell type-specific biotin labeling in vivo resolves regional neuronal and astrocyte proteomic differences in mouse brain. Nat Commun. 13, 2927(2022).
  30. Uckun, E., et al. In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain. J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).
  31. Xiong, Z., et al. In vivo proteomic mapping through gfp-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish. Elife. 10, e64631(2021).
  32. Holzer, E., Rumpf-Kienzl, C., Falk, S., Dammermann, A. A modified turboid approach identifies tissue-specific centriolar components in C. elegans. PLoS Genet. 18 (4), e1010150(2022).
  33. Artan, M., et al. Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling. J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).
  34. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity. Nat Comm. 10 (1), 3252(2019).
  35. Baumgartner, L., et al. The Drosophila zad zinc finger protein kipferl guides rhino to pirna clusters. eLife. 11, e80067(2022).

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