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Article de méthode

Isolement et culture de cholangiocytes primaires de souris atteintes de polykystose hépatique à l’aide d’une méthode de digestion en deux étapes

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DOI :

10.3791/68202

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16 mai 2025

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1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2The Province and Ministry Co-sponsored Collaborative Innovation Center for Medical Epigenetics, Key Laboratory of Immune Microenvironment and Disease (Ministry of Education), State Key Laboratory of Experimental Hematology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de digestion optimisée en deux étapes pour isoler les cholangiocytes primaires de haute pureté et de haute viabilité de souris de type sauvage et de souris atteintes de polykystose hépatique.

Résumé

Dans ce protocole, nous avons optimisé une méthode de digestion en deux étapes pour isoler des cholangiocytes primaires de haute pureté et de haute viabilité de souris de type sauvage et de souris atteintes de polykystose hépatique (DLP). Après avoir anesthésié les souris, les foies ont été perfusés à travers la veine cave inférieure avec 50 mL de solution A, suivis de 30 mL de solution B à 37 °C pour digérer enzymatiquement le tissu hépatique. Une dissociation mécanique, une secousse et une microdissection ont été effectuées pour éliminer les cellules parenchymateuses adhérentes, laissant un arbre biliaire intact. L’arbre biliaire a ensuite été finement haché et digéré en secouant pendant 60 min à 37 °C. La suspension unicellulaire résultante a été recueillie à l’aide d’une crépine à cellules de 70 μm. Les cholangiocytes ont été purifiés par isolement immunomagnétique. La suspension cellulaire a été incubée avec un anticorps anti-EpCAM en rotation pendant 45 minutes à 4 °C, suivie de l’ajout de billes de protéine G et d’une rotation supplémentaire pendant 45 minutes à 4 °C. Après trois lavages avec du PBS, les cholangiocytes ont été collectés à l’aide d’un séparateur magnétique. Les cholangiocytes primaires purifiés ont été remis en suspension dans un milieu de culture de cholangiocytes et ensemencés sur des boîtes de culture cellulaire recouvertes de 1 mg/mL de collagène de queue de rat de type I. La pureté des cholangiocytes a été confirmée par immunomarquage pour le marqueur cytokératine-19 (CK19), un marqueur spécifique des cholangiocytes. Bien que cette étude se soit concentrée sur l’isolement des cholangiocytes primaires de souris de type sauvage et de souris PLD, nous sommes convaincus que le protocole peut également être appliqué à d’autres modèles de souris pathologiques. Cette méthode de digestion détaillée en deux étapes facilite l’étude in vitro des cholangiopathies et le développement de thérapies ciblées.

Introduction

Les cholangiocytes, les cellules épithéliales qui tapissent l’arbre biliaire intrahépatique, forment une monocouche et constituent environ 3 à 5 % de la population cellulaire totale du foie1. Ces cellules s’interconnectent dans le foie pour créer un réseau canalaire tridimensionnel complexe2. Dans des conditions normales, les cholangiocytes remplissent des fonctions vitales, notamment la sécrétion, l’absorption, la réparation des lésions et servent de barrière immunitaire, jouant ainsi un rôle essentiel dans la physiologie et la pathologie du foie. Cependant, le dysfonctionnement des cholangiocytes peut entraîner diverses maladies, notamment la DLP, la cholangite sclérosante primitive, le cholangiocarcinome et les lésions hépatiques cholestatiques 3,4,5.

Parmi les maladies liées à la cholangiopathie, la DLP se distingue comme une maladie héréditaire caractérisée par la formation de nombreux kystes remplis de liquide provenant de cholangiocytes. L’élargissement progressif de ces kystes diminue considérablement la qualité de vie des patients6. Les options de traitement actuelles de la DLP restent insuffisantes, offrant une efficacité limitée tout en étant souvent associées à des taux élevés de récidive et de complications7. Cela souligne le besoin urgent de développer des stratégies thérapeutiques sûres et efficaces pour répondre aux demandes cliniques non satisfaites dans la prise en charge de la DLP.

La recherche sur les mécanismes des cholangiopathies, y compris la DLP, a été considérablement entravée par le manque de lignées cellulaires appropriées. Pour remédier à cette limitation, l’utilisation de modèles murins pathologiques et l’isolement des cholangiocytes primaires à partir de ces modèles pour des expériences in vitro se sont avérés inestimables pour découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents aux cholangiopathies et identifier des stratégies thérapeutiques potentielles.

Dans notre récente étude8, nous avons réussi à établir un modèle de souris PLD en utilisant des souris Pkd1 à knockout conditionnel (KO). Des kystes hépatiques ont été observés dès 1 mois après la délétion de Pkd1 et ont progressivement augmenté en taille au fil du temps. Bien que les protocoles permettant d’isoler les cholangiocytes des rats et des humains soient bien documentés 9,10, l’isolement des cholangiocytes primaires des souris reste particulièrement difficile en raison de leur petite taille et de l’architecture complexe de la veine porte et du système biliaire. Les méthodes existantes sont confrontées à des limites importantes, notamment une faible pureté cellulaire, une faible viabilité, des procédures complexes et des coûts élevés11,12.

Ce manuscrit présente un protocole détaillé pour isoler les cholangiocytes primaires de haute pureté des souris à l’aide d’une méthode de digestion en deux étapes. Cette approche optimisée vise à soutenir les études in vitro , à faciliter l’investigation des mécanismes moléculaires sous-jacents aux cholangiopathies et à faire progresser le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

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Protocole

Tous les soins de souris et les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d’éthique de l’Université de médecine de Tianjin (doc. n° : TMUa-MEC 2022016).

1. Préparation des équipements et des solutions

  1. Stérilisez les instruments chirurgicaux (ciseaux, pinces et manches de scalpel) par autoclave au moins 1 jour avant l’isolement cellulaire.
  2. Au moins 1 jour avant l’isolement cellulaire, préparez le milieu de culture de cholangiocytes à l’aide des réactifs indiqués dans le tableau 1. Stérilisez le milieu de culture des cholangiocytes en le filtrant à travers un filtre de 0,22 μm.
  3. Au moins 1 jour avant l’isolement cellulaire, préparer la solution A et la solution B à l’aide des réactifs énumérés au tableau 2 pour la perfusion hépatique de souris. Stérilisez la solution A et la solution B par autoclave ou filtrage à travers un filtre de 0,22 μm et ajustez leur pH à 7,35 à l’aide de NaOH stérile sous agitation douce.
    REMARQUE : Le milieu de culture de cholangiocytes, la solution A et la solution B peuvent être conservés à 4 °C pendant au moins un mois.
  4. Avant de commencer l’expérience, ajoutez de la poudre de collagénase II à la solution B et mélangez doucement pour obtenir une concentration finale de 0,5 mg/mL. Préchauffez la solution A et la solution B dans un bain-marie à 37 °C avant utilisation.
  5. Immédiatement avant de commencer l’expérience, préparez des plats de 6 cm remplis de PBS stérile et placez-les sur de la glace pour les garder froids pendant la procédure.

2. Perfusion de digestion du tissu hépatique

  1. Anesthésier la souris en utilisant une surdose d’inhalation d’isoflurane. Placez la souris anesthésiée en position couchée et fixez-la avec du ruban adhésif pour faciliter la procédure.
  2. Ouvrez la cavité abdominale de la souris après avoir stérilisé l’abdomen avec de l’éthanol à 75 %, puis faites un nœud coulant autour de la veine cave inférieure à l’aide d’une aiguille emboutie. Rincer un cathéter intraveineux de 24 g avec la solution A à l’aide d’une seringue de 20 ml.
  3. Insérez le cathéter intraveineux dans la veine cave inférieure sous le nœud coulant, fixez le nœud coulant et fixez le cathéter en place avec du ruban adhésif.
  4. Perfuser le foie avec 50 mL de la solution A à travers la veine cave inférieure à l’aide d’une seringue de 20 mL, et inciser la veine porte hépatique pour drainer la solution de perfusion. Maintenir le débit de perfusion à 10 mL/min.
  5. Poursuivre la perfusion avec 30 mL de la solution B contenant de la collagénase II à un débit de 3,5 mL/min à l’aide d’une pompe péristaltique.
    REMARQUE : Cette étape est destinée à la digestion du tissu hépatique.
  6. Retirez le tissu hépatique perfusé avec succès et placez-le dans une boîte de 6 cm remplie de PBS stérile et froid.

3. Isolement des cholangiocytes

REMARQUE : Comme le nombre de cholangiocytes chez les souris normales est relativement faible, il est recommandé d’utiliser un groupe de 2 à 6 souris pour la procédure. Cependant, pour les modèles de maladies chez la souris avec une prolifération anormale des cholangiocytes, tels que la DLP, les cholangiocytes d’une seule souris sont suffisants. Sauf indication contraire, les échantillons et les réactifs doivent toujours être conservés sur de la glace, et toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique.

  1. Dissocier et secouer mécaniquement le tissu hépatique à l’aide d’une pince incurvée. Par la suite, effectuez une microdissection sous microscope à dissection pour éliminer les cellules parenchymateuses adhérentes, laissant un arbre biliaire intact. Retirez le tissu de la vésicule biliaire avant de passer à l’étape suivante.
    Lavez le mouchoir 2 fois avec du PBS.
  2. Hacher finement l’arbre biliaire à l’aide d’une lame chirurgicale et le digérer dans 3 mL de solution de digestion (tableau 3) par souris en agitant (90 tr/min) à 37 °C pendant 60 min. Au bout de 30 minutes, pipetez doucement le mélange à l’aide d’une pointe de pipette pour bien mélanger.
    REMARQUE : La solution de digestion doit être fraîchement préparée avant utilisation.
  3. Passez la suspension cellulaire dans une crépine de 70 μm. À l’aide du piston d’une seringue de 5 ml ou de 10 ml, appuyez doucement sur la suspension cellulaire à travers la crépine. Lavez la passoire avec du PBS.
  4. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Lavez les cellules 3 fois avec un milieu RPMI.
  5. Centrifuger à nouveau à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  6. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 900 μL de milieu RPMI contenant 40 U/mL de DNase I. Ajouter 2 μg d’anticorps anti-EpCAM et incuber la suspension sur un rotateur (20 tr/min) à 4 °C pendant 45 min.
  7. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  8. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu RPMI contenant 40 U/mL de DNase I. Prélaver les billes de protéine G avec 1 mL de milieu RPMI. Ajouter 20 μL de billes de protéine G à la suspension cellulaire et incuber à rotation (20 tr/min) à 4 °C pendant 45 minutes supplémentaires.
    REMARQUE : L’anticorps anti-EpCAM peut également être préincubé avec des billes de protéine G pour créer un complexe billes-anticorps avant d’introduire la suspension cellulaire.
  9. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS à l’aide d’un séparateur magnétique.
  10. Effectuer la numération cellulaire et l’évaluation de la viabilité cellulaire à l’aide de la coloration au bleu trypan (0,04 %, 3 min) sur un hémocytomètre.
    REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de retirer les billes des cholangiocytes, elles se détacheront naturellement une fois la culture commencée et n’interféreront pas avec la culture cellulaire.

4. Culture de cholangiocytes

REMARQUE : Préparez des plats de culture cellulaire frais enrobés de collagène de queue de rat de type I avant la culture des cholangiocytes. Prérefroidissez tous les réactifs sur de la glace.

  1. En suivant les instructions du fabricant, mélangez du collagène stérile ddH2O, 10x PBS, 1 N NaOH et du collagène de queue de rat de type I pour obtenir une concentration finale de 1 mg/mL de collagène de queue de rat de type I dans 1x PBS. Enduisez uniformément les boîtes de culture cellulaire avec le mélange et placez-les dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 30 min pour permettre au collagène de se solidifier.
  2. Lavez les plats de culture cellulaire enrobés de collagène de queue de rat de type I avec du PBS préchauffé.
  3. Remettez les cholangiocytes en suspension dans un milieu de culture de cholangiocytes préchauffé. Ensemencer la suspension cellulaire dans des boîtes de culture cellulaire enrobées de collagène de queue de rat de type I de 1 mg / mL et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2. Remplacez le milieu tous les 2 jours.

5. Passage et cryoconservation des cholangiocytes

  1. Laver les cholangiocytes deux fois avec du PBS, puis incuber les cellules dans de la trypsine à 0,25 % à 37 °C pendant 5 à 10 min.
  2. Ajouter un volume égal de milieu de culture de cholangiocytes pour neutraliser la trypsine, puis centrifuger à 500 x g pendant 5 min.
  3. Préparez des boîtes de culture cellulaire enrobées de collagène de queue de rat de type I comme décrit à l’étape 4.1.
  4. Suivez les étapes 4.2 et 4.3.
  5. Si une cryoconservation est nécessaire, remettre les cholangiocytes en suspension dans un milieu de stockage (9:1 FBS : DMSO) et les stocker dans un congélateur à -80 °C ou de l’azote liquide. Décongelez les cellules au besoin pour une utilisation future.

6. Validation des cholangiocytes

REMARQUE : La pureté des cholangiocytes a été évaluée par coloration pour le marqueur cholangiocytaire CK19.

  1. Lavez les cholangiocytes 2x avec du PBS, puis fixez les cellules dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min.
  2. Lavez les cholangiocytes avec du PBS, puis perméabilisez les cellules avec 1 % de Triton X-100 pendant 8 min.
  3. Laver les cholangiocytes avec du PBS, puis bloquer les cellules dans 5 % de BSA pendant 1 h.
  4. Lavez les cholangiocytes avec du PBS, puis incubez les cellules avec l’anticorps primaire contre CK19 (dilution 1:12 avec 2 % de BSA) pendant la nuit à 4 °C.
  5. Lavez les cholangiocytes 2x avec du PBS, puis incubez les cellules avec l’anticorps secondaire anti-rat Alexa Fluor 488 (dilution 1:1 000 avec PBS) pendant 1 h à température ambiante.
  6. Lavez les cholangiocytes avec du PBS, colorez-les avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole pendant 15 minutes et observez au microscope.

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Résultats

Le schéma du flux de travail pour le processus de digestion en deux étapes utilisé pour isoler les cholangiocytes est illustré à la figure 1. L’ensemble de la procédure prend ~5 h. Tout d’abord, le foie est perfusé avec la solution A à travers la veine cave inférieure pour éliminer le sang, comme indiqué par le foie qui pâlit. Le foie est ensuite perfusé avec la solution B contenant de la collagénase II pour initier la digestion tissulaire. Cette étape initia...

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Discussion

Ce protocole fournit une méthode détaillée pour isoler les cholangiocytes primaires de haute pureté de souris à l’aide d’un processus de digestion en deux étapes, permettant l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents aux cholangiopathies. Plusieurs étapes critiques sont essentielles pour assurer la réussite de l’isolement des cholangiocytes.

La première étape critique consiste à assurer une perfusion et une digestion efficaces à l’aide de la solution A e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Commission municipale de l’éducation de Tianjin (2022ZD054 à L.Z.)

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 &mu ; m filterPALL4612
0.25 % TrypsineGibco25200-056
Seringue 10 mLKONSMED10 mL 1.2*30TWLB
Seringue 20 mLKONSMED20 mL 1.2*30TWLB
24 G Cathéter intraveineuxWEGO24GX19  ; mm/Y-G
3,3',5-triiodo-L-thyronineSigmaT55161.7 mg/mL stock
4 % paraformaldéhydeSolarbioP1110
5 mL seringueKONSMED5 mL 0.7*30TWLB
6 cmplats Thermo Scientific150462
70 µ ; Filtre à cellules mCorning352350
anticorps anti-CK19DSHBTROMA-III
anticorps anti-EpCAMDSHBG8.8
BSA SolarbioA8020
CaCl2Sangon BiotechA5013302 M stock
Concentré lipidique chimiquement défini (100x)Gibco11905-031
Collagenase IIWorthingtonLS004176
Collagenase XISigmaC76573,2 mg/mL stock
DexaméthasoneSigmaD175610 mg/mL stock
Microscope de dissectionLeicaEZ4
DMEM/F12 (1:1)VivaCell biosciencesC3130-0500
DMSOSigmaD2650
DNase ISigmaD451310 U/&mu ; L stock
Âne anti-rat Alexa Fluor 488 anticorps secondaireInvitrogenA21208
EGTASolarbioE805050 mM (PH = 8) stock
Facteur de croissance épidermique (1 mg/mL)SigmaSRP3196
EthanolamineSigmaE9508
Sérum fœtal bovinVivaCell biosciencesC04001-500
ForskolinSigmaF391720 mM stock
Solution de gentamicine/amphotéricine (500x)GibcoR01510
HémocytomètreQIUJINGXB. K.25.
HEPESSigmaH4034
HyaluronidaseSigmaH350610 mg/mL stock
Insuline-transferrine-sélénium (100x)Gibco41400045
IsofluraneRWDR510-22-10
KClSangon BiotechA100395
L-Glutamine (200 mM)SigmaG7513
Séparateur magnétiquePromegaZ5342
MEM acides aminés non essentiels (100x)Gibco11140050
MEM solution vitaminique (100x)Gibco11120052
MgCl2Sangon BiotechA1002881,5 M stock
Na Pyruvate  ; (100 millimètres)Gibco11360070
Na2HPO4Sangon BiotechA600487
NaClSangon BiotechA610476
NaOHSangon BiotechA6206171 N stock
PBSVivaCell biosciencesC3580-0500
PBSSolarbioP1010
Pénicilline-Streptomycine (100x)Gibco15140-122
Pompe péristaltiqueBaodingRongbaiYZ1515PPS
Protéines G billesInvitrogen10004D
RotatorKylin-BellQB-528
RPMIVivaCell biosciencesC3010-0500
Inhibiteur de la trypsine de sojaSigmaT652210 mg/mL stock
Aiguille emboutieJinhuan MedicalHM601
Triton X-100SolarbioT8200
Trypan blueSigmaT614610 mg/mL stock
Type I collagène queue de ratBD354236

Références

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  7. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., LaRusso, N. F. Polycystic liver disease: Advances in understanding and treatment. Annu Rev Pathol. 17, 251-269 (2022).
  8. Ji, R., et al. Multi-omics profiling of cholangiocytes reveals sex-specific chromatin state dynamics during hepatic cystogenesis in polycystic liver disease. J Hepatol. 78 (4), 754-769 (2023).
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