Modification enzymatique et évaluation par cytométrie en flux des protéines affichées à la surface de la levure

Résumé

Ici, nous introduisons un protocole pour l’utilisation de substrats affichés à la surface de levure pour des tests de modification enzymatique. La plateforme a été démontrée en utilisant l’analyse de l’activité de déphosphorylation de la tyrosine phosphatase SHP-2 contre l’un de ses substrats en tant que test de modification enzymatique représentatif.

Résumé

L’affichage de la surface de la levure est une stratégie de liaison génotype-phénotype qui permet un criblage à haut débit de la fonction protéique. Traditionnellement, l’affichage de la surface de la levure a été appliqué à l’évolution de nouvelles protéines de liaison, la cytométrie en flux étant utilisée pour évaluer et trier par niveaux de force de liaison. Récemment, on s’est intéressé de plus en plus à l’application de l’affichage de surface de levure pour le criblage de modifications enzymatiques de variantes de substrat, avec des modifications additives (par exemple, la phosphorylation) ou soustractives (par exemple, la protéolyse) fournissant un phénotype lisible par cytométrie en flux. De telles modifications sont régulièrement appliquées en utilisant la co-localisation intracellulaire, mais la capacité de réaliser une modification enzymatique extracellulaire des substrats affichés pourrait ouvrir beaucoup plus de réactions à l’étude. Ici, nous décrivons des techniques de conception et d’application de tests de criblage pour la modification enzymatique extracellulaire à des substrats candidats affichés à la surface de la levure et une évaluation ultérieure à l’aide d’une analyse par cytométrie en flux. Nous fournissons ces protocoles dans le contexte des phosphatases déphosphorylant des substrats de levure contenant des résidus de tyrosine phosphorylés et commentons comment ce cadre appliqué peut être adapté au développement de tests de criblage pour d’autres paires enzyme-substrat.

Introduction

La compréhension des interactions entre les enzymes et leurs cibles est devenue un domaine de recherche de plus en plus intéressant en raison de sa nécessité dans la caractérisation biologique des voies contrôlant l’homéostasie cellulaire et le développement de la maladie ^1,2. Les enzymes sont responsables de la catalyse de nombreuses réactions qui maintiennent la vie biologique, contrôlant les voies nécessaires telles que le métabolisme cellulaire ^3,4, la signalisation⁵ et même des processus fondamentaux comme la réparation du génome ^6,7. En raison de leur rôle dans ces processus, leurs interactions jouent également un rôle dans le développement de nombreuses maladies, car des déviations dans leur activité peuvent provoquer une dérégulation sévère de l’activité cellulaire, provoquant l’apoptose ou la prolifération de cellules cancéreuses nocives². L’étude de l’activité enzymatique a eu des applications importantes dans le développement de nouvelles thérapies ^8,9, nécessitant des dosages adaptés à chaque interaction enzyme-substrat^{spécifique 10}. De multiples essais enzymatiques ont été établis comme protocoles standard pour l’évaluation et la caractérisation de ces interactions. Les essais mis au point pour analyser les interactions enzymatiques sont classés en essais de détection qui surveillent la liaison pour l’activation/inhibition¹¹ ou en essais qui surveillent la modification du substrat par les enzymes¹².

L’un des rôles majeurs des enzymes est la régulation du comportement cellulaire. La transduction du signal, c’est-à-dire la réponse intracellulaire d’une cellule à un déclencheur extracellulaire¹³, est responsable de la survie et de la fonctionnalité cellulaires. La prolifération cellulaire, la différenciation et de nombreux autres processus fonctionnels impliquent tous des voies de signalisation avec des interactions enzymatiques qui les régissent^14,15. Les enzymes catalysent les modifications post-traductionnelles, qui modulent souvent les réseaux de signalisation massifs responsables de la transmission correcte des messages extracellulaires¹⁶. La phosphorylation des protéines est la modification post-traductionnelle la plus courante, omniprésente dans la signalisation cellulaire et de multiples autres voies cellulaires. Par conséquent, les protéines kinases sont apparues comme une proportion importante des cibles thérapeutiques potentielles en raison de leur rôle régulateur critique¹⁷. Les phosphatases sont les molécules modulatrices naturelles des complexes de signalisation cellulaire à base de phosphate^18,19, ayant la capacité d’éliminer les résidus de phosphate de leurs protéines cibles²⁰. Au cours de la dernière décennie, les phosphatases sont devenues une cible thérapeutique majeure pour le traitement du cancer²¹ et des maladies inflammatoires²² en raison de leur implication dans la régulation des voies de signalisation en aval dans plusieurs types de cellules. Ensemble, les protéines kinases et les phosphatases fournissent un large éventail d’interactions, qui peuvent être étudiées grâce au développement de protocoles de dosage enzymatique spécifiques.

L’affichage de la surface de la levure a été utilisé comme outil pour la caractérisation et l’évaluation de l’activité enzymatique^23,24. Il fournit une plate-forme à haut débit pour le criblage des processus de modification post-traductionnelle lorsqu’il est combiné à des stratégies de séquestration du réticulum endoplasmique^25,26. Cela permet aux paires kinase-substrat d’être co-localisées et conservées dans le réticulum endoplasmique en se liant aux récepteurs KDEL²⁷, où la phosphorylation du substrat peut se produire à des taux accrus en raison de la proximité entre les kinases et leurs cibles. La liaison du récepteur KDEL est médiée par une séquence de rétention du réticulum endoplasmique Fehdel C-terminale qui s’est avérée avoir une capacité de rétention plus forte que les autres séquences HDEL^25,28. Le substrat phosphorylé est ensuite ancré à la surface de la levure pour son évaluation ultérieure par cytométrie en flux²⁹. À l’heure actuelle, il n’existe aucun protocole généralisable établi pour la modification enzymatique des substrats affichés à la surface de la levure. Nous élargissons les capacités d’affichage de la surface de la levure en tirant parti des variantes de substrat phosphorylées exprimées extracellulairement et en les modifiant par déphosphorylation par leur phosphatase connue. L’analyse par cytométrie en flux fournit ensuite une plate-forme pour l’évaluation phénotypique des substrats susmentionnés par la mesure des altérations de la médiane de phosphorylation à la suite de l’incubation avec la phosphatase connue. Il s’agit d’une méthode adaptable pour la modification post-traductionnelle des protéines affichées en surface, tout en fournissant une méthode pour l’analyse de la modification enzymatique des interactions lors de l’utilisation de la plate-forme d’affichage de surface de levure.

Nous présentons des techniques pour le développement et l’application d’un test de modification enzymatique qui décrit l’introduction d’une interaction kinase-substrat dans la plate-forme d’affichage de surface de la levure, la co-incubation du substrat phosphorylé exprimé avec une phosphatase recombinante, et l’analyse ultérieure de l’activité de déphosphorylation par cytométrie en flux. Dans ce rapport, cela est accompli en co-localisant le domaine cytoplasmique de CD28 avec la kinase lymphocytaire (LCK) dans le réticulum endoplasmique de la levure, suivi de l’affichage du CD28 phosphorylé à la surface de la levure et de la déphosphorylation ultérieure par la phosphatase-2 contenant le domaine d’homologie Src 2 (SHP-2). Un anticorps anti-phosphotyrosine (4G10 dans cette étude), qui détecte les résidus de tyrosine phosphorylés dans une grande variété de séquences peptidiques, est utilisé pour quantifier le niveau de phosphorylation en fonction du traitement à la phosphatase. Le processus détaillé fournit une approche généralisable pour étudier les interactions enzyme-substrat ; Une manière prospective d’étudier les enzymes et les substrats de manière purifiée.

Protocole

1. Croissance cellulaire de la levure hébergeant le plasmide et induction de l’expression des protéines

1. En suivant la recette décrite dans le tableau 1, préparer les milieux nécessaires à la croissance des levures non plasmidiques (YPD), à la croissance des cellules de levure contenant des plasmides (SD-CAA) et à l’induction de l’expression des protéines (SRG-CAA) ainsi que les plaques SD-CAA.
2. Transformez l’ADN plasmidique d’affichage de levure contenant la paire kinase-substrat en cellules de levure EBY-100 grâce à la méthode à base de cations lithium^30,31, couramment adoptée pour une utilisation dans les kits de transformation de levure de divers fabricants.
   REMARQUE : L’électroporation³² ou d’autres techniques de transformation de plasmide de levure préférées peuvent être utilisées en fonction de la construction du plasmide transformée.
3. Préparez un tube de culture de 14 mL avec 10 mL de milieu YPD. Inoculer les cellules EBY-100 et les faire croître dans un incubateur à 30 °C, 300 tr/min jusqu’à ce que la culture atteigne une densité optique (DO_{600 nm}) de 0,8-1,0 (8 x 10⁶- 1 x 10⁷ cellules/mL).
   REMARQUE : Le diamètre extérieur_{de 600 nm} est mesuré en préparant des cuvettes d’échantillon de 3 mL contenant des dilutions 1:10 de cultures de levure dans leurs milieux respectifs et des cuvettes vierges de 3 mL contenant les milieux utilisés pour les dilutions des échantillons. Le programme OD_600nm sur le spectrophotomètre permet de mesurer d’abord la cuvette à blanc, puis chaque cuvette d’échantillon en réglant la dilution correspondante préparée pour chaque échantillon. 1 DO_600nm correspond à 1 ×^{10 7} levure/mL.
4. Récolter les cellules en centrifugeant la culture à 1 000 x g pendant 3 min, et laver avec la^1ère solution de lavage fournie dans le kit de transformation de levure, ou TE (10 mM Tris-HCl et 1,0 mM EDTA)³¹.
5. Granulez à nouveau les cellules à 1 000 x g pendant 3 min et mettez-les en suspension dans 1 mL du tampon de transformation fourni dans le kit de transformation de levure, ou de l’eau stérile. Les cellules doivent être aliquotes en aliquotes de 50 μL et peuvent être stockées à -80 °C jusqu’à 6 mois.
6. Pour la transformation du plasmide, une aliquote par plasmide est préparée et décongelée sur de la glace, puis 0,5 à 1,5 μg d’ADN plasmidique contenant la construction d’affichage de la levure est ajouté directement aux cellules. On ajoute 0,5 mL de la solution de transformation fournie dans le kit de transformation de levure, ou 0,5 mL d’une solution stérile de polyéthylène glycol à 50 % et de solution de LiOAc³¹ à 0,1 M. Combinez soigneusement le mélange de cellules, d’ADN plasmidique et de solution de transformation par pipetage.
7. Incuber le mélange de transformation de manière statique pendant 30 à 60 min à 30 °C, le mélange vortex à 15 minutes d’intervalle. Récoltez les cellules par centrifugation à 1 000 × g pendant 3 min.
8. Préparez un tube de culture de 14 mL avec 4,5 mL de milieu SD-CAA. Remettre en suspension les cellules contenant le plasmide désiré dans 500 μL de SD-CAA et inoculer les 4,5 mL préparés.
9. En prenant soin de ne pas percer la gélose, répartir 50 μL des 5 mL de culture inoculée sur une plaque SD-CAA et incuber statiquement à 30 °C pendant 48 h pour déterminer l’efficacité de la transformation.
10. Incuber les 5 mL de culture cellulaire SD-CAA dans un incubateur à agitation à 30 °C, 300 tr/min pendant au moins 18 h. Surveiller la densité optique (OD_600nm) après 16 h et 20 h. Une fois que l’échantillon a atteint une densité optique suffisante ne dépassant pas 6, centrifuger la culture pendant 3 min à 2 500 × g. Jetez le surnageant sans déranger la pastille de levure.
11. Remettre en suspension la pastille de levure dans le SRG-CAA jusqu’à une DO finale de_{600 nm} inférieure à 1 (<1 × 10⁷ levure/mL).
12. Incuber la culture de levure dans un incubateur à agitation à 30 °C, 300 tr/min pendant au moins 8 h mais pas plus de 24 h.
    REMARQUE : L’induction de l’expression des protéines dans les cellules de levure peut varier n’importe où de 20 à 37 °C. 30 °C convient à la synthèse des paires kinase/substrat^29,33 mais peut être ajustée si nécessaire pour les protéines spécifiques étudiées.
13. Mesurez la DO_{600 nm} pour déterminer la densité cellulaire.
    REMARQUE : Le protocole peut être arrêté à ce stade en stockant les cultures de levure à 4 °C.

2. Biotinylation de l’anticorps anti-phosphotyrosine 4G10

1. Remettre en suspension un flacon de 2 mg de PEG4-NHS-Biotine à une concentration finale de 5 mM en ajoutant 680 μL de PBS stérile.
   REMARQUE : La remise en suspension de PEG4-NHS-Biotine doit être effectuée immédiatement avant que la réaction de biotinylation ne soit effectuée. Le NHS s’hydrolyse en solution aqueuse. L’utilisation de PBS et de flacons stériles est importante pour la préparation des réactifs destinés à l’entreposage à long terme et pour l’utilisation dans les essais cellulaires afin d’atténuer les effets potentiels des contaminants sur la viabilité des réactifs ou les essais sensibles effectués.
2. En fonction de la concentration d’anticorps 4G10, ajouter 100 μg d’anticorps dans un flacon stérile de 1,7 mL.
3. Ajouter 1 μL de 5 mM de PEG4-NHS-Biotine préparée à partir de l’étape 2.1 dans le flacon contenant les 100 μg d’anticorps 4G10 pour obtenir un rapport molaire biotine/anticorps de 7,5:1. Pipeter doucement le mélange pour homogénéiser la réaction.
4. Incuber la réaction à température ambiante avec une rotation constante pendant au moins 2 h.
5. Suivre le protocole du fabricant pour les colonnes de dessalage par centrifugation de 0,5 mL afin d’échanger le tampon du 4G10 biotinylé (B-4G10) dans du PBS.
   REMARQUE : Les colonnes de dessalage avec une coupure de poids moléculaire (MWCO) de 7 kDa sont couramment utilisées pour la biotinylation des anticorps afin de permettre l’élimination de la biotine et d’autres petites molécules n’ayant pas réagi tout en conservant l’anticorps plus gros.
6. Diluer l’anticorps B-4G10 jusqu’à une concentration finale de 1 μM dans du PBSA (PBS avec 1 g/L d’albumine sérique bovine). Aliquote l’anticorps B-4G10 en plus petits volumes pour éviter les cycles répétés de congélation/décongélation.
   REMARQUE : Les anticorps biotinylés peuvent être conservés à 4 °C pour une utilisation quotidienne jusqu’à 3 mois sans perte d’efficacité significative. Conservez le reste des aliquotes non utilisées à -20 °C pendant un maximum de 2 ans.

3. Déphosphorylation des substrats exprimés à la surface des cellules de levure

1. Préparez la solution tampon 2x de travail comme décrit précédemment dans la littérature³⁴.
   REMARQUE : 2x est recommandé pour faciliter la mesure des ingrédients nécessaires.
2. Préparez le tampon de travail pour les échantillons dans un flacon de 1,7 mL en diluant la solution tampon 2x préparée à l’étape 3.1 1:2 dans de l’eau désionisée.
   REMARQUE : Le volume total de réaction pour chaque échantillon sera de 20 μL, et chaque échantillon nécessitera entre 10 μL et 18 μL de tampon de travail. Préparez suffisamment de tampon de travail pour tous les échantillons ou commandes.
3. Après la préparation recommandée de l’échantillon décrite au tableau 2, étiqueter les flacons de 1,7 mL avec le témoin ou le nom de l’échantillon correspondant.
4. Sur la base de la DO_{de 600 nm} mesurée à l’étape 1.9, calculez le volume de culture nécessaire pour récupérer deux millions (2 × 10⁶) de cellules de levure à partir de la culture de levure correspondante pour chaque échantillon.
5. Ajouter le volume de culture de levure calculé à l’étape précédente dans le flacon de 1,7 mL pour chaque échantillon.
6. Centrifugez le flacon pendant 1 min à 4 500 × g. Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une micropipette et le jeter comme déchet biologique.
7. Remettre les cellules granulées en suspension dans 1 mL de PBSA et répéter l’étape 3.6.
   REMARQUE : Il est important d’éliminer autant de surnageant que possible sans déranger les cellules granulées.
8. D’après sa concentration de stock, calculer le volume de SHP-2 humain recombinant requis pour avoir une concentration finale de 1 000 nM dans un volume de réaction total de 20 μL.
   REMARQUE : Le SHP-2 recombinant doit être aliquote en petites quantités de sorte que toute protéine utilisée dans chaque essai n’ait pas subi plus de deux cycles de congélation-décongélation. Tout résidu de SHP-2 provenant d’une aliquote après que tous les échantillons ont été préparés pour un essai doit être jeté.
   Les concentrations de stock d’enzymes recombinantes peuvent varier en fonction du numéro de lot. Le SHP-2 recombinant est couramment formulé à une concentration de base de 0,2 à 0,4 mg/mL. Pour une concentration mère de 0,324 mg/mL SHP-2, cela correspond à une concentration mère de 4,696 μM (SHP-2 a un poids moléculaire de 69 kDa). 4,26 μL de la matière première de SHP-2 dans une réaction de 20 μL donnent une concentration de réaction finale de 1 000 nM de SHP-2.
9. Ajouter 7,7 mg de DTT dans 10 mL d’eau déminéralisée préparée dans un cône de 15 mL pour créer une solution de DTT de 5 mM. Si les limites de l’équipement rendent difficile la pesée des milligrammes, ajoutez 0,77 g de DTT à 10 ml d’eau désionisée, puis effectuez une dilution 100x pour créer la solution de DTT de 5 mM utilisée pour le dosage.
   REMARQUE : La solution DTT peut être préparée dans des solutions mères à concentration plus élevée pour être diluée à 5 mM s’il n’est pas possible de mesurer des quantités à l’échelle du milligramme à l’aide de l’équipement disponible. La solution de DTT doit être préparée fraîche avant la remise en suspension de la cellule dans le tampon de travail en raison de sa tendance à l’hydrolyse, ce qui la rend instable sur de longues périodes lorsqu’elle est diluée dans l’eau.
10. Remettre les cellules granulées en suspension dans le tampon de travail préparé à l’étape 3.2 de sorte que le volume de réaction final dans chaque échantillon ou témoin soit de 20 μL.
    REMARQUE : La quantité de tampon de travail ajoutée doit être calculée en fonction de la quantité de DTT (2 μL) et de SHP-2 (calculée à l’étape 3.8) qui se trouvera dans chaque échantillon.
11. Ajouter 2 μL de la solution de DTT 5 mM préparée à l’étape 3.9 à chaque échantillon ou témoin pour une concentration de réaction finale de 0,5 mM de DTT.
12. Ajouter le volume de SHP-2 calculé à l’étape 3.8 à chaque échantillon pour un volume final de 20 μL et mélanger délicatement à l’aide d’une micropipette.
13. Enveloppez les couvercles des flacons d’échantillon dans un parafilm pour éviter les fuites ou la contamination croisée.
14. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 2 h sur un rotor à vitesse constante.
15. Retirer les échantillons du rotor et arrêter la réaction en ajoutant 1 mL de PBSA à chaque échantillon.
16. Répétez l’étape 3.6.

4. Marquage cellulaire et analyse par cytométrie en flux de substrats déphosphorylés

1. Mettre en suspension les échantillons de l’étape 3.16 dans un mélange de 20 μL de leurs réactifs primaires correspondants, comme décrit dans le tableau 2. Incuber les échantillons pendant 20 min à température ambiante.
   REMARQUE : Il a été calculé que toutes les concentrations de réactifs utilisées étaient supérieures au nombre de protéines exprimées à la surface des cellules de levure. Le calcul suppose l’expression de 10 000 protéines/cellule à partir de toutes les levures 2 x 10⁶ dans un échantillon³⁵, alors que seulement ~50 % d’entre elles le font habituellement. Le tableau 3 montre le rapport de réactif de marquage en excès pour chacun des réactifs exprimé dans le tableau 2, calculé comme suit :
   
2. Centrifugez les échantillons à 4 500 × g pendant 1 min et jetez le surnageant en tant que déchet biologique dangereux.
3. Laver les cellules une fois en les mettant en suspension dans 1 mL de PBSA. Répétez l’étape 4.2.
4. Remettre en suspension les échantillons dans un mélange de 20 μL de leurs réactifs secondaires correspondants, comme décrit dans le tableau 2. Incuber les échantillons pendant 15 min en l’absence de lumière.
5. Répétez l’étape 4.2.
6. Répétez l’étape 4.3.
7. Remettre en suspension les échantillons lavés dans 300 à 500 μL de PBSA et les transférer dans des tubes de polystyrène de 5 mL pour les analyser immédiatement à l’aide d’un cytomètre en flux approprié.
   REMARQUE : Si des échantillons doivent être transportés, conservez-les sur de la glace humide. Ce n’est pas recommandé, mais les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pendant un maximum de 2 h sous forme de granulés humides.
8. Après avoir effectué le démarrage et la préparation nécessaires du cytomètre pour une nouvelle expérience, cliquez sur le bouton Nouvelle expérience dans le menu Fichier , nommez l’expérience, puis cliquez sur Enregistrer pour vous assurer que les données acquises sont enregistrées dans le chemin d’accès au fichier souhaité.
9. Sélectionnez l’icône de pointage dans la barre d’outils supérieure pour créer deux point-plots ou plus pour chaque échantillon à exécuter. Pour l’un des diagrammes à points, sélectionnez le nom de l’axe X pour afficher le canal FSC-A et le nom de l’axe Y pour afficher le canal SSC-A. Ce graphique montre l’aire de dispersion latérale par rapport à l’aire de diffusion directe et est utilisé pour bloquer les cellules de levure pour une analyse plus approfondie.
10. Sur un autre graphique à points, sélectionnez le nom de l’axe X pour afficher le canal dans lequel le réactif secondaire ciblant l’anticorps anti-épitope primaire devient fluorescent. Sélectionnez le nom de l’axe Y pour afficher le canal dans lequel le réactif secondaire de la streptavidine devient fluorescent. Ce graphique ne montrera que les événements contrôlés par le biais du graphique de dispersion latéral par rapport au graphique de dispersion vers l’avant en tant que cellules de levure et est utilisé pour afficher la phosphorylation de la tyrosine sur l’axe Y et l’expression de surface du substrat sur l’axe X.
    REMARQUE : Dans cet exemple, le réactif secondaire ciblant l’anticorps anti-épitope primaire est fluorescent dans le canal FITC (AF-488) et le réactif secondaire de la streptavidine dans le canal AF-647. Les canaux utilisés peuvent varier en fonction des réactifs primaires et secondaires utilisés lors de l’étiquetage.
11. Placez chaque tube d’échantillon dans le support de tube du cytomètre et sélectionnez Exécuter pour que le cytomètre commence à charger l’échantillon et à acquérir des données. Ajustez les événements à afficher, les événements à enregistrer, le temps d’enregistrement et le débit d’échantillon si nécessaire.
12. Définissez une porte autour des cellules de levure saines dans le graphique SSC-A vs FSC-A créé à l’étape 4.9. La figure 1 illustre une représentation descriptive de la stratégie de contrôle à appliquer.
    REMARQUE : Sur le graphique SSC-A par rapport au graphique FSC-A, 100 000 événements à afficher et 50 000 événements à enregistrer dans la porte de levure définie constituent une bonne ligne directrice pour visualiser et collecter suffisamment de données pour une analyse plus approfondie. Des stratégies de contrôle plus strictes pour sélectionner la levure singulet peuvent être appliquées sur la base d’un graphique de la hauteur de dispersion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion vers l’avant, comme récemment signalé³⁶. La stratégie de déclenchement illustrée à la figure 1 correspond à une approche moins stricte, incluant la levure singulet et un peu de levure doublet par le biais d’un désaccord de dispersion.
13. Enregistrez la fluorescence de tous les échantillons de contrôle à l’aide d’un analyseur de cytométrie en flux. Des échantillons de contrôle sont systématiquement prélevés en premier pour aider à définir une stratégie de contrôle, comme décrit ci-dessous à l’étape 4.14.
14. Définissez une stratégie de contrôle pour votre parcelle créée à l’étape 4.10 avant d’analyser les échantillons traités. La figure 1 illustre une représentation descriptive de la stratégie de contrôle à appliquer.
15. Enregistrer la fluorescence des échantillons déphosphorylés à l’aide du cytomètre en flux et de la stratégie de déclenchement définie aux étapes 4.12 et 4.14.
16. Analysez les données de cytométrie en flux acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux.
17. Évaluez la déphosphorylation en mesurant et en comparant la médiane de l’axe Y des cellules exprimant des protéines à leur surface et la phosphorylation de base fournie par les cellules non affichées entre les échantillons et les témoins. Calculez le pourcentage de différence médiane de phosphorylation comme suit :
    

Résultats

L’analyse par cytométrie en flux d’une réplique individuelle de notre système modèle incubée pendant 2 h sans (Figure 1A) et avec (Figure 1B) 1 000 nM SHP-2 révèle une différence de phosphorylation médiane de 63,6 %, qui est définie comme le rapport de la médiane de l’axe Y (phosphorylation) de tous les événements affichés en surface moins le signal de phosphorylation de base défini comme la médiane de l’axe Y des événements non affichés entre l’échantillon trai...

Discussion

Le protocole présenté permet d’analyser les interactions enzymatiques en utilisant l’affichage extracellulaire des protéines à la surface de la levure. L’incorporation de la séquestration du réticulum endoplasmique dans le plasmide de surface utilisé introduit la capacité d’analyser des interactions spécifiques entre les enzymes et les substrats modifiés post-traductionnellement en raison des interactions intracellulaires qui peuvent être conçues pour se produire^27,29

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bouteilles de 1 L de média	Corning	06-414-1D
1,7/2,0 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 & micro ; L SureOne Pointes de pipette	Fisher Scientific	02-707-438
1000 & micro ; L SureOne Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-408
12 mL Polystyrène Tubes à fond rond	Greiner	07-000-212
3 mL Cuvettes en plastique	BRAND	759076D
300 µ ; L SureOne Pipettes	Fisher Scientific	02-707-411
Pipettes sérologiques de 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Caséine acide (acides casaminés)	Fisher Scientific	BP-1424-500
Balance analytique  ;	30243397		Mettler Toledo
;	Corning	Falcon 351008
Biospectromètre	Labconco	Logic Classe II, type A2 302310102
Biospectromètre	Eppendorf	Kinetic 6136000010
Bovin Sérum	Albumine Fisher	BP1600-100
Acide citrique	Fisher Scientific	A940-500
CytoFLEX Cytométrie en flux Analyseur  ;	Beckam Coulter	Cytoflex C09745	CytExpert logiciel
Dextrose	Fisher Scientific	D16-1
Dithiothreitol	Fisher bioréactifs	BP172-5
Âne anti-chèvre FITC	Invitrogen	A16000
EDTA	Alfa Aesar	H56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-Biotine	Thermo Scientific	A39259
Kit de transformation de levure Frozen-EZ II  ;	Zymo Research	T2001
Galactose	Fisher Scientific	BP656-500
Réfrigérateur à usage général	Marvel Scientific	MS24RAS4RW
Anticorps anti-myc tag de chèvre  ;	Centrifugeuse	Bethyl A190-104A
;	Eppendorf	5425 R 5406000313
Mini incubateur réfrigéré à basse température	Fisher Scientific	15-015-2632
Anticorps anti-phosphotyrosine de souris 4G10	BioXcell	BE0194
Parafilm M	Bemis	M PM999
Saline tamponnée au phosphate  ;	Fisher bioréactifs	BP399-500
Contrôleur de pipettes  ;	Eppendorf	easypet 3 4430000018
Raffinose	Thermo Scientific	J21060-36
Recombinant humain Actif SHP-2 Protéine	R& D Systems	1894-SH
Centrifugeuse réfrigérée  ;	Eppendorf	5910 R
Saccharomyces cerevisiae levure présentoir surface souche EBY 100	ATCC	MYA-4941
Incubateur	Eppendorf	M1335-0002 Nouveau-Brunswick Innova 42  ;
Jeu de pipettes monocanal·e·s	Eppendorf	05-403-151
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	S671-500
Citrate de sodium dihydraté	Fisher	Scientific S279-500
Phosphate de sodium dibasique heptahydraté	Fisher Scientific	S373-500
Phosphate de sodium monobasique monohydraté	Fisher Scientific	S468-500
Streptavidin Alexa Fluor 647	Invitrogen	S32357
Balance à chargement par le haut	Mettler Toledo
Tris chlorhydrate	EMD Millipore	648317-100GM
Tube revolver rotator	Fisher Scientific	11-676-341
Pesée Papier  ;	Fisher Scientific	09-898-12B
Base d’azote	de levure BD Difco	291940
Colonnes de dessalage Zeba Spin  ;	Thermo Scientific	89883