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Article de méthode

Transformation génétique induite par Agrobacterium tumefaciens chez Solanum nigrum

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DOI :

10.3791/68212

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24 juin 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture and Life Science, Liaocheng University

Dans cet article

Résumé

Cet article fournit un protocole détaillé de la méthode de transformation génétique médiée par Agrobacterium tumefaciens pour produire Solanum nigrum transgénique.

Résumé

Solanum nigrumest une solanacée orpheline apparentée à la pomme de terre et à la tomate, et son fruit frais est une baie nutritive et délicieuse. La plante entière de S. nigrum peut être utilisée comme médicament. Cependant, le S. nigrum sauvage présente des traits indésirables. Heureusement, les techniques de génie génétique, en particulier les technologies d’édition de gènes comme CRISPR/Cas9, offrent de précieuses opportunités pour améliorer rapidement S. nigrum en remédiant à ces déficiences. Chez la plupart des plantes, l’amélioration des plantes grâce à la technologie d’édition génomique est obtenue par la transformation génétique médiée par Agrobacterium tumefaciens. Dans cet article, nous avons détaillé les protocoles de transformation génétique médiés par A. tumefaciens chez S. nigrum. Les cotylédons et les hypocotyles des semis de S. nigrum ont été utilisés comme explants pour la transformation génétique. Comme S. nigrum est résistant à la kanamycine, le gène DsRed a été utilisé comme marqueur visuel pour identifier les plantes transgéniques. La transformation génétique de S. nigrum peut être réalisée efficacement selon ces protocoles d’opération. La détection des plantes transgéniques T1 peut être directement identifiée en indiquant si elles émettent une fluorescence rouge, sans qu’il soit nécessaire de procéder à une identification par PCR.

Introduction

Solanum nigrum (connu sous le nom de morelle noire, 2n = 6x = 72) est une plante solanacée apparentée à la pomme de terre et à la tomate1. Le fruit est une baie sphérique qui devient noire après la maturation. Le fruit frais est une baie nutritive et délicieuse. La plante entière de S. nigrum peut être utilisée comme médicament, avec pour effets de disperser la stase sanguine, de réduire l’enflure, d’évacuer la chaleur et de détoxifier. S. nigrum synthétise deux classes distinctes de métabolites spécialisés à partir d’un précurseur commun du cholestérol : les saponines stéroïdiennes dans ses feuilles et les glycoalcaloïdes stéroïdiens (SGA) dans ses baies. L’uttroside B, une saponine stéroïdienne dérivée de S. nigrum, a récemment été approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis en tant que médicament orphelin pour le traitement du carcinome hépatocellulaire2. L’inactivation du gène GAME15 chez S. nigrum a entraîné des plantes dépourvues de saponines et d’alcaloïdes stéroïdiens, et a également révélé que les saponines stéroïdiennes contrôlent les insectes ravageurs agricoles graves2. Les polyphénols de S. nigrum réduisent le poids et la graisse corporelle en affectant les adipocytes et le métabolisme des lipides3. S. nigrum peut enrichir le cadmium et est utilisé comme plante modèle pour l’étude de l’enrichissement en cadmium 4,5. S. nigrum est une plante non domestiquée, et sa base de recherche est relativement faible. Il est encourageant de constater que la recherche sur S. nigrum s’est progressivement intensifiée ces dernières années. Le génome de l’hexaploïde S. nigrum a récemment été assemblé, et S. nigrum pourrait avoir évolué à partir de son diploïde Solanum americanum (2n = 2x = 24)6,7. Par conséquent, S. nigrum est une plante qui possède à la fois une valeur médicinale et comestible. La recherche sur S. nigrum contribue non seulement à une meilleure compréhension de ses applications potentielles dans le traitement des maladies humaines, mais fournit également des informations précieuses sur l’amélioration de la production agricole. Ainsi, l’établissement d’un système de transformation génétique chez S. nigrum est à la base de l’amélioration génétique grâce à la technologie transgénique et à l’édition de gènes.

Plusieurs rapports se concentrent sur la transformation génétique de S. nigrum médiée par Agrobacterium tumefaciens 8,9,10,1 1. Dans nos travaux précédents, nous avons établi un système de transformation génétique médié par A. tumefaciens LBA4404 pour S. nigrum, et transformé AcMYB110 en S. nigrum, obtenant de nouveaux germoplasmes de S. nigrum avec une teneur accrue en anthocyanes1. Des plantes de S. nigrum transgéniques et génétiquement modifiées ont été obtenues par transformation génétique 10 médiée par A. tumefaciens EHA105. Différentes protéines fluorescentes ont des émissions de fluorescence vertes, rouges, jaunes, oranges et bleues et sont largement utilisées pour indiquer les activités de la vie cellulaire12. Dans le processus de transformation génétique des plantes, les gènes fluorescents rouges sont souvent utilisés comme gènes rapporteurs pour distinguer les événements génétiquement modifiés des événements non génétiquement modifiés13. L’utilisation du gène DsRed comme gène rapporteur permet de discriminer facilement les événements transgéniques, tandis que l’utilisation du facteur de transcription R2R3-MYB comme gène rapporteur peut être influencée par le génotype des plantes14. Dans la descendance transgénique, les plantes transgéniques peuvent également être facilement distinguées des plantes non transgéniques à l’aide d’instruments optiques (par exemple, des microscopes à fluorescence ou des systèmes d’imagerie), éliminant ainsi la nécessité d’une identification par PCR. En intégrant le gène rapporteur de la protéine fluorescente à la technologie d’édition de gènes CRISPR, les gènes de fertilité du maïs ont été supprimés avec précision, ce qui a entraîné la création d’une lignée stérile nucléaire et d’une lignée15 de mainteneur stérile nucléaire contrôlée. L’autopollinisation et la fructification des plantes d’entretien produiront une progéniture 1:1 de lignées d’entretien et stériles. Sur la base de différentes caractéristiques luminescentes, le tri non destructif des semences de mainteneur et de ligne stérile peut être réalisé par reconnaissance visuelle ou mécanique15. Ainsi, l’utilisation du gène de la protéine fluorescente comme gène rapporteur simplifie l’identification des graines ou des plantes transgéniques sans qu’il soit nécessaire de procéder à une analyse PCR. Cela représente un avantage non négligeable dans le domaine de la transformation génétique. Cette méthode vise à décrire le protocole de transformation génétique médiée par Agrobacterium tumefaciens chez S. nigrum, en utilisant le gène fluorescent rouge, DsRed, comme gène rapporteur.

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Protocole

1. Culture aseptique de semis

REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées sur un banc super propre.

  1. Collectez des graines sauvages de S. nigrum dans la ville de Liaocheng, en Chine, et nommez-les Snlc1. Prenez 50 graines sauvages de S. nigrum et placez-les dans un tube à centrifuger de 2 ml. Après avoir trempé dans 1 mL de gibbérelline à 5 % pendant 30 minutes, jeter la solution de gibbérelline.
  2. Ajouter 1 ml d’éthanol à 75 %, agiter pendant 1 min, puis jeter l’éthanol.
  3. Ajouter 1 mL de solution d’hypochlorite de sodium à 2 % et désinfecter la surface des graines pendant 10 min. Secouez soigneusement le tube de centrifugation pour stériliser la surface de la graine. Après 10 min, jeter l’hypochlorite de sodium.
  4. Lavez les graines 5 fois avec de l’eau stérilisée pour éliminer l’hypochlorite de sodium résiduel. Placez les graines dans des boîtes de Pétri d’un diamètre de 90 mm contenant 1/2 MS de milieu solide. Cultivez les plaques dans une chambre de croissance végétale sous une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité à 25 °C (Figure 1A).

2. Culture d’A. tumefaciens LBA4404

  1. Transformez le vecteur binaire pRed130516 hébergé avec un gène fluorescent rouge, DsRed2, en A. tumefaciens LBA4404 par électroporation avec MicroPulser avec les paramètres : Tension 1800 V, Capacité 25 μF, Résistance 200 Ω, Cuvette 1 mm. Cultivez les bactéries sur un milieu solide LB avec 50 mg/L de kanamycine et 50 mg/L de rifampicine à 28 °C pendant 48 h.
  2. Prélever un clone d’LBA4404 porteur de pRed1305 et le cultiver dans 1 mL de milieu liquide LB avec 50 mg/L de kanamycine et 50 mg/L de rifampicine dans un tube à centrifuger de 15 mL dans un concentrateur de table à 180 tr/min à 28 °C pendant 12 h.
  3. Ajouter 50 mL de LB liquide avec le même antibiotique à 1 mL de solution bactérienne, puis cultiver dans une table concentratrice à 200 tr/min à 28 °C pendant 6 h.
  4. Arrêter la culture lorsque la DO600 du milieu de culture bactérienne est de 0,4, puis centrifuger la solution bactérienne à 2200 x g pendant 10 min à 25 °C.
  5. Remettre en suspension les bactéries centrifugées avec une solution infectieuse (IS : M519 4,43 g/L, saccharose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, AS, 100 μmol/L, pH 5,8) et ajuster la concentration de la solution bactérienne àOD 600 = 0,6 à l’aide d’un spectrophotomètre.

3. Explanter l’infection par A. tumefaciens

REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées sur un banc super propre.

  1. Faites pousser les graines pendant 7 jours jusqu’à ce que les cotylédons des plantules soient dépliés (figure 1B). Coupez les deux cotylédons et l’hypocotyle d’une longueur d’environ 1 cm des plantules à l’aide d’un scalpel stérilisé et tranchant dans une boîte de culture avec du papier filtre imbibé d’IS bactérien et jetez les racines primaires. Soyez prudent lorsque vous utilisez un scalpel.
  2. Infuser les explants dans la solution infectieuse pendant 30 min. Placez les explants sur du papier filtre sec pour permettre à la solution bactérienne à la surface de l’explant d’être absorbée.
  3. Placer les explants dans un milieu solide IS (0,7 % de gélose ; Figure 1C). Placez les explants dans une chambre de croissance végétale sans lumière à 19 °C et cultivez pendant 3 jours.

4. Différenciation des explants

REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées sur un banc super propre.

  1. Sortez les explants de la chambre de croissance des plantes à 19 °C. Lavez les explants à l’eau stérilisée 5 fois et placez les explants sur du papier filtre sec et stérilisé.
  2. Placer les explants dans un milieu de différenciation des pousses (SD : M519 4,43 g/L, saccharose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L de gérant, pH 5,8) et cultiver à 25 °C pendant 4 semaines (Figure 1D,E).
  3. Coupez les callosités/bourgeons des explants présentant une fluorescence rouge sous la lumière d’excitation verte d’une lampe fluorescente portative à l’aide d’un scalpel, puis transférez-les dans un nouveau milieu SD et poursuivez la culture pendant 4 semaines à 25 °C (Figure 1F,G).

5. Enracinement et transplantation

  1. Coupez les bourgeons présentant une fluorescence rouge à l’aide d’une lampe fluorescente manuelle, transférez-les dans le milieu d’enracinement (RM : M519 4,43 g/L, saccharose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8), et cultivez-les pendant 2 à 4 semaines à 25 °C pour favoriser la production de racines.
  2. Repiquez les plantules présentant une fluorescence rouge avec une longueur de racine de plus de 2 cm au sol (Figure 1H-K). Avant la transplantation, retirez la gélose des racines à la main pour éviter la croissance excessive de bactéries dans les racines.

6. Tester des plantes T0 génétiquement modifiées avec amplification PCR

  1. Extraire l’ADN génomique d’une lignée transgénique indépendante à l’aide de la méthode du bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB)17.
  2. Amplifiez le gène DsRed à l’aide d’un ensemble d’amorces, RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') et RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') en utilisant de l’ADN génomique de 10 ng comme matrice dans un volume de réaction de 15 μL contenant 7,5 μL de 2x PCR Master Mix et 0,3 μL de chaque amorce (10 μmol/L). Le fragment d’ADN attendu était de 393 pb. Soumettre les produits PCR à une électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % pour déterminer s’il s’agit de plantes transgéniques.

7. Identification de plantes transgéniques de la génération T1 à l’aide d’une lampe fluorescente

  1. Récoltez les fruits des plantes transgéniques T0 de S. nigrum qui ont complètement viré au noir-violet, puis pressez les graines à l’intérieur du fruit à la main. Faites sécher naturellement les graines à l’air libre à température ambiante pendant environ 1 semaine.
  2. Cultivez les graines séchées dans un milieu 1/2 MS selon les étapes 1.1 à 1.4 de ce protocole et placez-les dans une chambre de croissance végétale pendant 1 semaine. Distinguer les semis transgéniques des semis non transgéniques à l’aide d’une lampe fluorescente portative.

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Résultats

Transformation génétique médiée par Agrobacterium tumefaciens pour produire S. nigrum transgénique.
Après avoir infecté les cotylédons et les hypocotyles des plantules de S. nigrum avec A. tumefaciens, nous avons pu déterminer si l’infection à Agrobacterium était réussie puisque DsRed était utilisé comme gène rapporteur. Une fluorescence rouge est a...

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Discussion

Jusqu’à présent, des méthodes de transformation génétique de S. nigrum médiées par A. tumefaciens ont été établies dans différents laboratoires 8,9,10,11. La plupart de ces méthodes de transformation utilisent la kanamycine comme substance de sélection 8,9,10,11.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Fonds de recherche de l’Université de Liaocheng (318012028) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong (ZR2020MC034).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2X SanTaq PCR Master Mix (avec colorant bleu)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B532061Le mélange PCR 2X SanTaq comprend du MgCl ?, des dNTP, de l’ADN polymérase Taq, un tampon PCR, un colorant de chargement et un amplificateur de PCR.
6-BASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.C14819266Cytokinines artificielles
AgarTianjin Damao Chemical Reagent Partnership Enterprise (société en commandite)CAS NO :9002-18-0Solids
ASSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K914BA0002Induire l’expression efficace d’Agrobacterium
CarbSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Antibiotique
CefSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I526BA0010
GibbérellineSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K514BA0009Favorise la germination des graines
kanamycineSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I614BA0013
Antibiotique LB mediumSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113Cultiver la bactérie
MicroPulser ( Gene Pulser Xcell)Bio-Rad, US617BR1 06783Gene Pulser Xcell
MS milieu solidephytotech Co., Ltd., États-UnisHCA0519228A  ; Murashige & Skoog Basal Medium avec vitamines, M519
boîte en plastiqueLiaoSu, ChineT909HBoîte de plantation de plantes
rifampicineSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.S180305Saccharose antibiotique
Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.N° CAS :57-50-1  ;   ;   ;En tant que source de carbone
Tanon-5200Multi machineTanon Co., Ltd., Chine5200MultiSéparation
accélérée sauvage Solanum nigrumcollecté dans la ville de Liaocheng
ZT Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.J921BA0014Régulateurs de croissance des plantes
antibiotique

Références

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