Flux de travail à l’aide d’un microscope cryogénique à fluorescence coïncidente, à faisceau d’électrons et d’ions pour le broyage ciblé de cellules

Résumé

Ce flux de travail permet la production de lamelles ciblant des structures biologiques marquées par fluorescence qui sont petites (<1 μm d’étendue axiale) et rares (1 copie par cellule) à l’aide d’une plateforme d’imagerie cryogénique tri-coïncidente. Cette plate-forme intègre la microscopie à fluorescence, le broyage par faisceau d’ions focalisés et la microscopie électronique à balayage à une seule position focale et permet la microscopie à fluorescence simultanée pendant le broyage.

Résumé

Le broyage cryogénique par faisceau d’ions focalisés avec microscopie électronique à balayage (CryoFIB-SEM) est devenu l’approche dominante pour la préparation de lamelles de cellules de moins de 200 nm d’épaisseur pour la tomographie électronique cryogénique (CryoET). Récemment, la microscopie à fluorescence a été incorporée dans les systèmes CryoFIB-SEM pour guider la production de lamelles vers des cibles marquées par fluorescence. Cependant, dans la plupart des applications, les systèmes d’imagerie optique et par faisceau d’ions ont des plans focaux distincts dans différentes régions de la chambre à vide, fonctionnant efficacement comme deux microscopes distincts. Cette configuration nécessite un recalage d’images entre les modalités, ce qui manque souvent de la précision nécessaire pour cibler de manière fiable de petites structures rares in situ. Nous présentons un flux de travail basé sur une plate-forme d’imagerie tri-coïncidente personnalisée qui permet simultanément l’imagerie de fluorescence et l’usinage par faisceau d’ions focalisés. Cela permet un retour de fluorescence en temps réel qui peut être utilisé pour déterminer quand terminer le broyage afin de préserver les structures d’intérêt marquées par fluorescence dans la lamelle finale. En utilisant cette approche, nous avons ciblé le centre d’organisation des microtubules (MTOC) dans les macrophages vitrifiés et avons obtenu un taux de réussite de >60 %, confirmé par la tomographie électronique cryogénique ultérieure et la microscopie corrélative à la lumière et électronique.

Introduction

La tomographie électronique cryogénique (CryoET) permet de visualiser des échantillons biologiques dans un état proche de leur origine à une résolution macromoléculaire^de 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Cependant, l’épaisseur des cellules eucaryotes – souvent de plusieurs microns – dépasse le libre parcours moyen (~300 nm) des électrons de 300 kV, limitant la profondeur de pénétration des électrons non diffusés et limitant ainsi l’épaisseur utilisable de l’échantillon. Pour résoudre ce problème, un faisceau d’ions focalisés (FIB) peut être utilisé pour ablater la majeure partie de la cellule cryogénisée dans un processus connu sous le nom de broyage CryoFIB, produisant des lamelles suffisamment fines pour l’imagerie CryoET 12,13,14,15,16.

Dans les flux de travail précédemment rapportés, les échantillons sont d’abord conservés dans de la glace vitrifiée par congélation en plongée 17,18,19, puis chargés dans un instrument à double faisceau équipé à la fois d’un CryoFIB et d’un microscope électronique à balayage (MEB). L’imagerie MEB peut être utilisée pour identifier des caractéristiques subcellulaires d’intérêt telles que des organites et même certaines structures protéiques^20,21. Ces informations peuvent être utilisées pour diriger le processus de broyage CryoFIB, où l’échantillon est ablaté par étapes dans le but de produire une lamelle de moins de 200 nm d’épaisseur adaptée à CryoET ^13,14,22. Cependant, cette approche présente deux défis clés que le présent protocole aborde. Tout d’abord, il est souvent nécessaire d’obtenir une cryoET de structures protéiques spécifiques, mais le MEB peut être dommageable, et la plupart des structures protéiques ne sont pas discernables par le MEB lors de l’imagerie de matériel biologique non coloré. Comment le broyage peut-il être guidé avec précision vers des régions subcellulaires spécifiques ou des régions contenant des biomolécules spécifiques sans dommage ? Deuxièmement, même après la production de lamelles minces et de CryoET ultérieur, il peut être difficile d’identifier des biomolécules spécifiques dans les reconstructions finales en raison de l’insuffisance de la résolution, du rapport signal/bruit et/ou du contraste requis pour l’identification sans ambiguïté. Comment déterminer les positions spatiales de ces biomolécules dans les reconstructions cryo-ET ?

Pour relever ces deux défis, le domaine s’est de plus en plus tourné vers la microscopie à fluorescence. Les protéines fluorescentes génétiquement codées ou les colorants exogènes qui se lient aux protéines cibles sont couramment utilisés pour marquer des biomolécules d’intérêt^{spécifiques 5,23,24}. La microscopie cryogénique à fluorescence de cellules vitrifiées prélevée après broyage peut être corrélée avec les tomogrammes résultants. Cette approche, connue sous le nom de microscopie corrélative cryogénique à la lumière et à l’électronium (CryoCLEM), est bien établie et a été largement utilisée pour localiser des protéines spécifiques dans les reconstructions CryoET 5,12,23,24. Parmi les avancées récentes, citons l’utilisation de biocapteurs fluorescents et de méthodes de super-résolution pour améliorer les informations complémentaires et la précision spatiale 25,26,27,28,29.

CryoCLEM est un moyen de surmonter le deuxième défi identifié ci-dessus, en permettant de déterminer l’emplacement de protéines spécifiques dans la lamelle. Cependant, CryoCLEM ne fait rien pour l’utilisateur si la lamelle finale ne contient pas les protéines d’intérêt. Heureusement, la microscopie à fluorescence peut également être utilisée pour diriger le broyage vers des régions d’intérêt marquées. Bien que le fraisage FIB guidé par fluorescence soit un développement plus récent que CryoCLEM, les flux de travail initiaux émergeant il y a une dizaine d’années¹², il a été adopté rapidement et largement. Les premiers protocoles s’appuyaient sur des microscopes optiques externes pour acquérir des ensembles de données de fluorescence 2D ou 3D, qui étaient ensuite enregistrés sur des images MEB et par faisceau d’ions après le transfert de l’échantillon dans le CryoFIB-SEM. Plus récemment, les microscopes à fluorescence ont été intégrés directement dans les chambres à vide CryoFIB-SEM. Cette intégration réduit la contamination par la glace lors des transferts et permet d’imager plus facilement la lamelle finale. Plusieurs plateformes ont maintenant été développées pour combiner la microscopie à fluorescence avec CryoFIB-SEM pour le broyage guidé par fluorescence. Ceux-ci ont ciblé avec succès des organites et de grands complexes protéiques ^5,23,24. Cependant, à quelques exceptions^près30, le chemin optique produit un plan focal distinct dans une région physique différente de la chambre à vide du FIB-SEM. Par conséquent, un recalage précis entre les images de fluorescence et d’ions est toujours nécessaire pour le fraisage direct, tout comme c’est le cas avec l’utilisation de microscopes optiques autonomes.

Ce processus de repérage est sujet à des imprécisions en raison de trois facteurs clés : les décalages d’indice de réfraction (qui provoquent des décalages focaux apparents)^31,32, le mouvement de l’échantillon pendant le fraisage et l’erreur de localisation. De plus, le recalage est généralement facilité par des repères fluorescents de la taille d’un micron qui sont visibles à la fois dans les modalités ioniques et optiques et sont utilisés comme paires de points d’alignement pour calculer les transformations entre les images ioniques et optiques. Cependant, ces billes peuvent obscurcir ou concurrencer le signal de fluorescence de l’échantillon, et leur localisation et leur alignement sur les images optiques et ioniques sont lents et nécessitent beaucoup d’utilisateurs. Ensemble, ces limitations ont entravé le ciblage systématique de petites caractéristiques rares. Bien qu’il soit difficile de définir une limite précise aux structures qui peuvent actuellement être préservées dans les lamelles minces, les approches basées sur l’enregistrement sont généralement considérées comme inefficaces pour capturer des cibles dont les dimensions axiales sont inférieures à un micron³³.

Ici, nous rapportons l’utilisation d’un système d’imagerie tri-coïncident qui intègre la FIB, la MEB et la microscopie à fluorescence à une seule position focale^34,35. Cette configuration permet un fraisage guidé par fluorescence plus simple et plus précis par rapport aux intégrations non coïncidentes en supprimant la nécessité d’enregistrer des images optiques et ioniques. Dans des conditions idéales de faible bruit de fond et de signal élevé, une précision de guidage de l’ordre de 10 nm peut être atteinte à³⁶. Il permet également l’acquisition de données de microscopie à fluorescence cryogénique multicolores tout au long du processus de broyage, y compris à partir de la lamelle mince finale, ce qui permet une analyse corrélative et la localisation de cibles limitées par une sous-diffraction³⁵. Pour ce faire, nous utilisons une boîte à outils de transformation d’image personnalisée pour aligner précisément ces images de fluorescence avec la microscopie électronique à transmission à faible grossissement afin de déterminer où collecter CryoET, rationalisant ainsi la collecte de données et assurant la capture de la cible dans les reconstructions tomographiques finales.

Pour guider le broyage, nous exploitons la capacité du système à surveiller les changements d’intensité de fluorescence en temps réel. Au lieu d’essayer d’aligner les images optiques et ioniques pour trouver notre cible, l’utilisateur observe simplement le signal fluorescent de l’échantillon. Au fur et à mesure que l’usinage progresse, la fluorescence se comporte d’une manière très caractéristique : elle devient d’abord plus brillante lorsque le film de support de carbone entre l’objectif du microscope et l’échantillon marqué par fluorescence est retiré, puis diminue progressivement à mesure que le matériau autofluorescent flou est broyé, et enfin, diminue fortement lorsque la structure marquée elle-même est partiellement retirée. Ce signal en temps réel détermine précisément où l’on en est dans le processus de broyage et quand arrêter le broyage, garantissant ainsi que la cible d’intérêt est retenue dans la lamelle finale³⁷. Dans le protocole détaillé, nous discuterons également d’une approche plus avancée qui utilise les oscillations de la luminosité de fluorescence dues aux effets interférométriques pour guider le broyage vers des objets dont l’étendue axiale est de <300 nm.

Nous démontrons l’utilité de la plateforme en ciblant le centre d’organisation des microtubules (MTOC)³⁸. Le MTOC est un organite critique impliqué dans la division et la différenciation cellulaires. Dans les cellules de mammifères, la microscopie à fluorescence de la tubuline marquée révèle que le MTOC est un seul punctum fluorescent d’environ 1 μm de diamètre dans les cellules vivantes. Cette approche a été utilisée pour localiser avec succès le MTOC avec une grande fidélité aux lamelles minces des cellules vitrifiées. L’organisation détaillée des microtubules au niveau du MTOC et leurs interactions avec d’autres organites sont révélées dans les reconstructions tomographiques ultérieures. Ce flux de travail permet la microscopie à fluorescence corrélative de haute précision et le CryoFIB-SEM sans enregistrement, réduisant ainsi les entrées de l’utilisateur et élargissant l’accès aux structures cellulaires qui étaient auparavant prohibitives pour capturer de manière robuste avec des approches non coïncidentes.

Définitions et description de l’instrument
Le microscope optique intégré est décrit en détail dans Boltje et ^al.35, et de plus amples détails sur l’utilisation du microscope intégré peuvent être trouvés dans un protocole récemment publié³⁴. L’objectif est intégré par le bas et équipé de capacités de positionnement x, y et z pour permettre l’alignement avec le point coïncident FIB-SEM. Il fonctionne actuellement avec un objectif 100x, 0,85 NA avec un correcteur de lamelle. L’imagerie optique est réalisée à travers un couvre-cœur, qui protège l’objectif des matériaux pulvérisés et de l’irradiation du FIB et du MEB. L’éclairage à grand champ est fourni par un ensemble de LED couvrant plusieurs longueurs d’onde visibles. La détection de fluorescence est réalisée à l’aide d’un détecteur sCMOS. Il y a trois positions d’étape définies : chargement : la position d’étape où l’échantillon est chargé ; revêtement : la position de l’étape pour le revêtement via le système d’injection de gaz ; 3 faisceaux : la position de la platine pour laquelle les trois microscopes (FIB, MEB et optique) peuvent être alignés.

Protocole

REMARQUE : Le système tri-coïncident utilisé ici est un composant d’imagerie par fluorescence cryogénique personnalisé intégré dans un système FIB-SEM à double faisceau disponible dans le commerce. Le principe et l’ordre des opérations peuvent être généralement adaptés aux futures implémentations tricoïncidentes.

1. Configuration

1. Refroidissez le système à la température cryogénique. Surveillez la température à l’aide de deux capteurs : l’un situé sur la platine d’échantillonnage et l’autre à l’intérieur de la chambre. Maintenir l’étage de l’échantillon à environ 20 °C plus chaud que celui de la chambre (p. ex., étage à ~-170 °C, chambre à ~-190 °C) afin de minimiser l’accumulation de glace sur l’échantillon. Le processus de refroidissement prend généralement environ 1,5 h.

2. Chargement de l’échantillon

1. Utilisez de l’azote liquide pour refroidir manuellement la station de transfert lorsque la température du système approche de la température cryogénique (environ -167,5 °C). La température du système est affichée dans le coin supérieur gauche du logiciel de microscopie optique.
2. Chargez une grille automatique clipsée dans la cassette d’échantillons conçue pour le système de microscopie optique cryogénique. La cassette se compose d’une lamelle collée et d’une entretoise, avec l’Autogrid positionnée entre elles. Fermez la cassette en serrant la vis annulaire, puis insérez-la dans la fente de la station de transfert³⁴.
3. Fixez la station de transfert au système et utilisez la caméra de la chambre interne pour guider la cassette d’échantillon sur l’étage d’échantillonnage.

3. Système d’injection de gaz (GIS) pour le revêtement d’échantillons

1. Ouvrez le logiciel de contrôle de la microscopie optique et déplacez l’étage de l’échantillon de la position Chargement à la position Revêtement .
2. Insérez l’aiguille SIG à l’aide du logiciel de contrôle FIB-SEM en cliquant sur l’icône Snowflake. Sous Contrôle SIG, choisissez l’option insérer une aiguille GIS.
3. Permettre le dépôt SIG pendant 30 s en ouvrant le flux de gaz.
   REMARQUE : Cela varie de 20 s à 1 min en fonction du type d’échantillon. L’objectif de cette étape est de protéger suffisamment l’échantillon pendant la procédure de broyage FIB qui suit.
4. En rétractant l’aiguille GIS, ramenez l’étage d’échantillonnage à la position de chargement prédéfinie.

4. Alignement du système à trois faisceaux

REMARQUE : Cette section est adaptée de Wang³⁹.

1. Dans le logiciel de microscopie optique, déplacez l’étage d’échantillon de la position de chargement à la position prédéfinie à 3 faisceaux .
2. Dans le logiciel FIB-SEM, cliquez sur la fenêtre en haut à gauche et réglez le SEM sur un grossissement de 100x.
3. Dans l’onglet Alignement du logiciel de microscopie optique, cliquez sur la fonction Afficher pour acquérir un atlas MEB de la grille. Cette image de l’atlas utilise les paramètres précédemment définis.
4. Identifiez une zone carrée avec un film de carbone brisé et double-cliquez dessus pour déplacer l’étage d’échantillon à cet endroit.
5. Revenez au logiciel de contrôle FIB-SEM et ajustez le MEB à un grossissement plus élevé pour faire la mise au point sur la zone carrée sélectionnée, centrée dans le champ de vision.
6. Répétez les étapes 4.4 et 4.5 si nécessaire jusqu’à ce que le MEB soit focalisé sur un motif distinctif, tel que le bord tranchant d’un film de carbone brisé.
7. Allumez le microscope à fluorescence et ajustez les coordonnées x, y, z pour qu’elles correspondent à la vue MEB.
8. Usinez un petit motif avec le FIB, par exemple, un petit rectangle ou un cercle.
9. Vérifiez que le motif est visible à la fois dans les vues FIB et au microscope fluorescent. Si nécessaire, ajustez l’alignement en suivant les étapes 4.3 à 4.7 si nécessaire.
   REMARQUE : L’alignement et l’enregistrement des microscopes optiques et ioniques sont terminés.

5. Localisation et fraisage de la cible

REMARQUE : Cette section est adaptée de Wang³⁹.

1. Passez à l’onglet Localisation du logiciel de microscopie optique et configurez les canaux fluorescents en activant les conditions d’excitation et de filtrage appropriées. Attribuez à chaque fluorophore un canal distinct et incluez un canal supplémentaire pour la lumière transmise (ou fond clair).
2. Identifiez la cible d’intérêt en réglant la puissance de la LED et le temps d’exposition pour chaque canal fluorescent. À titre de référence, lors de l’imagerie de la tubuline SiR, utilisez une exposition de 1,2 s avec un réglage de puissance LED constant de 30 mW.
   REMARQUE : Les paramètres peuvent varier entre les fluorophores. L’intensité optique doit rester inférieure à ~25-50 W/cm² sur l’échantillon. Une intensité supérieure à celle-ci peut entraîner un échauffement et une dévitrification significatifs de l’échantillon^37,40.
3. Une fois satisfait des paramètres, acquérez une pile en Z fluorescente de pré-fraisage dans la direction axiale. Ensuite, marquez l’objectif comme un retour sur investissement.
4. Passez au logiciel FIB-SEM pour dessiner une lamelle au ROI.
5. Effectuez un fraisage grossier pour enlever la majeure partie du matériau à environ 3 μm au-dessus et en dessous du retour sur investissement. Pendant ce temps, gardez le microscope à fluorescence allumé pendant l’usinage pour surveiller toute diminution du signal fluorescent.
6. Réduisez le retour sur investissement à ~2 μm en utilisant le mode de section efficace de nettoyage.
7. Ouvrez la boîte à outils interférométrique basée sur Python à partir du terminal pour surveiller le signal fluorescent tout en amincissant la lamelle (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)³⁶.
8. Pour le fraisage et le polissage ultérieurs, suivez l’une des deux approches décrites ci-dessous aux étapes 5.9 ou 5.10 pour diriger le fraisage en fonction des dimensions des cibles sélectionnées.
   1. Étendue axiale de la cible > 300 nm
      REMARQUE : Ici, nous utiliserons une approche semi-destructive pour le fraisage direct.
      1. Dans l’interface graphique Python, sélectionnez la cible qui vous intéresse dans la micrographie à fluorescence. Le logiciel commencera automatiquement à tracer la luminosité en fonction du temps à chaque nouvelle image.
      2. Surveillez l’intensité de la fluorescence à l’aide de la boîte à outils Python. Fraisez l’échantillon en mode section transversale de nettoyage par le bas pour enlever tout matériau de film de support restant, le cas échéant.
         REMARQUE : Lorsque le film de support est retiré, une augmentation de la fluorescence doit être observée.
      3. Utilisez des baisses rapides de l’intensité de la fluorescence - indiquant une perte de matériau fluorescent - comme indice pour savoir quand changer de direction de broyage. Par exemple, si vous observez un broyage de bas en haut et une forte diminution de la fluorescence, arrêtez le broyage et passez au broyage de haut en bas.
         REMARQUE : Si une structure est retirée trop rapidement, réduisez le courant de fraisage dans le logiciel FIB-SEM pour ralentir le retrait de la cible.
   2. Étendue axiale de la cible ≤ 300 nm
      REMARQUE : Ici, nous utiliserons l’effet interférométrique pour le fraisage direct³⁶.
      1. Dans l’interface graphique Python, sélectionnez la cible qui vous intéresse dans la micrographie à fluorescence. Le logiciel commencera automatiquement à tracer la luminosité en fonction du temps à chaque nouvelle image.
      2. Commencez par fraiser de haut en bas à travers une cible de test. Surveillez le contraste des franges juste avant de fraiser la cible grâce à l’intensité de fluorescence. La cible de fluorescence est continuellement ajustée à une gaussienne 2D, l’ajustement étant utilisé pour obtenir une intensité intégrée qui est ensuite tracée.
      3. Une fois la cible fraisée, ajustez les oscillations dans la trace d’intensité à la fonction de modèle suivante à l’aide de l’interface graphique Python :
         
         Où A est l’amplitude de l’oscillation, λ la longueur d’onde de l’excitation, k un terme amortisseur représentant la longueur de cohérence de la source lumineuse, un facteur de phase Φ et d est la distance à l’objet de capture. À partir de la cible de test, tous les termes peuvent être prédits dans des limites raisonnables de sorte que la distance, d, est la seule variable libre utilisée pour indiquer à l’utilisateur où se trouve l’objet fluorescent par rapport à son broyage. Voir Sica et al. pour plus de détails³⁶.
         REMARQUE : Pour les objectifs suivants, la boîte à outils adaptera en direct la trace d’intensité avec la même fonction de modèle et estimera où arrêter le broyage de haut en bas. Tous les montages sont effectués en même temps que le fraisage. L’objectif est d’arrêter le fraisage lorsque la cible se trouve à une profondeur égale à la moitié de l’épaisseur de lamelle souhaitée sous la surface supérieure.
      4. Une fois le fraisage descendant terminé, finalisez la lamelle en fraisant de bas en haut en mode section transversale de nettoyage jusqu’à ce que l’épaisseur souhaitée soit atteinte.
9. Prenez une image de fluorescence après l’usinage.

6. Microscopie optique corrélative et collection en série d’inclinaison

1. Après avoir transféré l’échantillon dans CryoTEM, collectez un atlas de la grille à 182x pour permettre une couverture suffisante de l’ensemble des grilles.
2. À un grossissement intermédiaire approprié allant de 6 500x à 11 000x, recueillir une série d’images de montage de la lamelle finale à 0° d’inclinaison.
3. Lisez les images de fluorescence multicanaux post-fraisage et l’image de projection de l’étape 6.2 dans un logiciel de transformation projective personnalisé pour l’enregistrement du retour sur investissement (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).
4. Choisissez un total de 8 à 10 paires de points de référence pour calculer avec précision la transformation projective de l’image.
   REMARQUE : Ces points peuvent être des caractéristiques évidentes (par exemple, des bords de lamelles, une contamination visible par la glace ou des trous de grille ouverts) qui sont présentes à la fois dans la microscopie optique à fond clair et la microscopie électronique.

7. Collection de la série d’inclinaison à fort grossissement

1. Utilisez cette image de microscopie électronique à fluorescence et à transmission superposée comme référence pour que les utilisateurs sélectionnent une zone d’imagerie dans la limite de la taille du cadre de l’appareil photo pour la collecte de la série d’inclinaison à fort grossissement.
2. Sélectionnez le grossissement et les paramètres de la série d’inclinaison en fonction de la question biologique.
   REMARQUE : Pour la démonstration, nous avons collecté des données de 54° avec des incréments de 2° à une taille de pixel de 3,5 Å 41,42,43.

Résultats

Nous avons marqué des cellules macrophages différenciées avec le marqueur de tubuline SiR-tubuline avant la congélation. En suivant le protocole, nous avons identifié le MTOC comme un seul punctum fluorescent de ~ 1 μm de diamètre sous le microscope à fluorescence (Figure 1A). De plus, nous avons observé des structures fluorescentes de type fibrille rayonnant du MTOC vers la périphérie cellulaire, ce qui correspond au réseau de microtubules (Figure 1A). Des instantanés de fraisage par étapes à différentes épaisseurs d’éprouvette sont illustrés à la figure 1B. Notamment, lorsque la lamelle a atteint une épaisseur d’environ 800 nm, le punctum MTOC unique s’est résolu en deux taches adjacentes, chacune d’environ 700 nm de diamètre. L’analyse ultérieure a confirmé que chaque moucheture correspondait à un centriole individuel.

L’imagerie et le fraisage simultanés nous ont permis de surveiller les changements d’intensité de fluorescence en temps réel. Notamment, nous avons observé une augmentation de la fluorescence après l’élimination du matériau non fluorescent en vrac et du film de support absorbant (Figure 1B-D). Au fur et à mesure que la lamelle s’amincissait de 2 μm à 800 nm, l’intensité de la fluorescence diminuait fortement, reflétant l’élimination progressive des structures marquées. Ce déclin s’est poursuivi lorsque la lamelle s’est encore amincie en dessous de 200 nm (figure 1B-D). L’image de fluorescence corrélée et l’atlas de microscopie électronique démontrent que notre flux de travail permet un ciblage précis pour l’usinage (Figure 2A). Des tomogrammes reconstruits et des modèles segmentés révèlent que les centrioles sont composés de triplets de microtubules, ce qui correspond aux rapports précédents 42,43,44,45 (Figure 2A,B). Dans les cas où un seul chatoiement fluorescent est conservé dans la lamelle finale, on observe un seul centriole dans le tomogramme correspondant (Figure 2B).

Figure 1 : Flux de travail de la cryoFM-FIB-SEM tri-coïncidente pour une localisation précise du centre organisateur des microtubules. (A) (à gauche) microscopie à cellules vivantes et (à droite) CryoFM du MTOC. Barre d’échelle = 10 μm. (B) Instantanés par étapes de CryoFM et CryoFIB pour un broyage ciblé. La vue FM en gros plan est indiquée par des cases pointillées jaunes. Les centrioles sont marqués par des flèches jaunes. Barre d’échelle = 5 μm. (C) Intensité de fluorescence du MTOC pendant le broyage CryoFIB. (D) Profil de la raie de fluorescence à travers le MTOC pris à différentes étapes du broyage CryoFIB. Abréviations : CryoFM-FIB-SEM = Microscopie cryogénique à fluorescence avec broyage par faisceau d’ions focalisés et microscopie électronique à balayage ; MTOC = centre organisateur des microtubules ; ROI = région d’intérêt. Cette figure est adaptée de Wang³⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Détails moléculaires du MTOC révélés par le flux de travail CryoFM-FIB-SEM tri-coïncident. (A) Modèle corrélé de FM, EM et de segmentation du MTOC. (a) Image FM post-fraisage. Il s’agit de la même image que celle du dernier panneau de la figure 1B, marquée à 180 nm, mais tournée pour correspondre à la reconstruction et à la segmentation de CryoET. Barre d’échelle = 5 μm ; (b) Vue agrandie de la zone pointillée en jaune à partir de (a). c) Projection FM et TEM corrélée de la zone pointillée en cyan indiquée en (2). Barre d’échelle = 1 μm. (d) Modèle segmenté de reconstruction tomographique à la région d’intérêt (jaune, centriole ; vert, microtubule). Barre d’échelle = 100 nm. (B) Images FM représentatives et coupes tomographiques de deux lamelles différentes présentant des orientations de centrioles différentes. FM : Barre d’échelle = 5 μm. Tranche tomographique : Barre d’échelle = 200 nm. Abréviations : CryoFM-FIB-SEM = Fraisage cryogénique par faisceau d’ions focalisés avec microscopie électronique à balayage ; MTOC = centre organisateur des microtubules ; FM = microscopie à fluorescence ; ET = transmission d’électrons ; MET = microscopie électronique à transmission. Cette figure est adaptée de Wang³⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nos résultats mettent en évidence l’utilité de la plateforme d’imagerie tri-coïncidente, qui permet l’imagerie par fluorescence et le fraisage simultanés. En tirant parti de ces commentaires, nous démontrons deux stratégies de fraisage guidé par fluorescence - semi-destructive et interférométrique - qui évitent le besoin d’approches lourdes et basées sur l’enregistrement qui font face à des limitations de précision fondamentales liées à l’inadéquation de l’indice de réfraction et au mouvement pendant le fraisage 12,33,46. De plus, étant donné que le guidage précis repose sur la microscopie à fluorescence plutôt que sur le MEB, le rayonnement optique n’entraîne pas de dommages détectables tant que l’intensité est maintenue en dessous du seuil qui conduit à la dévitrification^37,47. Les capacités démontrées ici élargissent les échantillons biologiques accessibles pour inclure des cibles d’intérêt rares et petites (<300 nm en étendue axiale) tout en rationalisant le flux de travail.

L’étape clé de ce protocole consiste à déterminer quand arrêter le broyage en fonction des changements de luminosité fluorescente d’une cible d’intérêt. Actuellement, il s’agit d’une intervention manuelle rapide pour arrêter le fraisage aux moments souhaités. Cette méthode s’est avérée suffisante pour les cibles actuelles qui ont été explorées, mais des modifications futures pourraient intégrer davantage la boîte à outils Python dans le système FIB pour arrêter directement le broyage. Cette modification peut être nécessaire si des vitesses de fraisage plus rapides sont requises, car cela donnera moins de temps pour l’intervention manuelle. Alternativement, si des vitesses de fraisage plus lentes peuvent être tolérées, cela donnera plus de temps pour une intervention manuelle si nécessaire.

Suite à la génération de structures biologiques d’intérêt contenant des lamelles, notre logiciel de transformation d’images personnalisé permet la corrélation au niveau CryoTEM, en utilisant des aperçus d’atlas des lamelles pour guider la collecte de données CryoET. Dans l’ensemble, le protocole présenté ici est essentiel pour l’imagerie de cibles biologiques rares, petites et marquées par fluorescence par tomographie électronique cryogénique dans des échantillons cellulaires eucaryotes épais. Par rapport aux systèmes Cryo-FIB non coïncidents existants, tels que l’Aquilos 2 avec iFLM, notre flux de travail atteint un taux de réussite plus élevé dans le ciblage de ces fonctionnalités.

Cette grande précision de ciblage se fait au détriment de l’efficacité. Parce que le fraisage est manuel plutôt qu’automatisé, le débit de génération de lamelles est limité. Au cours d’une séance de broyage de 8 heures, nous produisons généralement 6 à 8 lamelles, dont environ cinq contiennent une cible d’intérêt. Cependant, nous pensons que ce flux de travail pourrait être automatisé à l’avenir pour améliorer le débit. L’automatisation nécessiterait des scripts personnalisés pour surveiller en permanence les zones de fraisage actives dans l’image FIB et suivre l’intensité de la fluorescence en temps réel afin de garantir la rétention de la cible. Les principaux défis restent à relever, notamment l’établissement d’une communication efficace entre tous les scripts personnalisés et le logiciel de contrôle pour le CryoFIB-SEM et le microscope à fluorescence.

À l’avenir, il reste beaucoup de travail à faire pour intégrer d’autres techniques avancées de microscopie à fluorescence dont nous avons parlé précédemment, notamment les biocapteurs fluorescents, l’imagerie à super-résolution et la microscopie confocale. Néanmoins, nous prévoyons que les géométries tri-coïncidentes deviendront la norme dans les futurs instruments et que l’imagerie de fluorescence simultanée pendant l’usinage deviendra une routine. Si c’est le cas, ce protocole pourrait servir de guide précieux pour les chercheurs visant à capturer les détails à l’échelle moléculaire des petites et rares structures biologiques qui, malgré leur taille et leur abondance, sont au cœur de la biologie cellulaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aquilos 2 Cryo-FIB	ThermoFisher Scientific		https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m & gad_source=1& gad_campaignid=12 764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9& gclid= Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9 KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy 2EALw_wcB
Boîte cryo compatible Autogrid	Sciences de la microscopie électronique		https://www.emsdiasum.com/autogrid -compatible-cryo-grid-box ?srsltid= AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
Anneaux Autogrid et clips en C	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
Suite logicielle CLEM	Groupe de recherche Dahlberg à Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
Libellule 2022.1	Systèmes de recherche d’objets		https://dragonfly.comet.tech/
ENZEL	Délmique B. V.		Le système ENZEL est un instrument personnalisé et actuellement non disponible dans le commerce
IMOD 4.12	Université du Colorado		https://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4 azote liquide dewar	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Outil manipulateur de couvercle à goupille	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Boîte à outils Python	Groupe de recherche Dahlberg à Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, maillage 200, grille EM Au	Sciences de la microscopie électronique		https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
EM série	Université du Colorado Boulder		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Navire standard Spearlab (transfert dewar)	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
Pince à épiler	Sciences de la microscopie électronique		https://www.emsdiasum.com/style-3sa