Article de méthode

Modèle murin de maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique avec fibrose

DOI :

10.3791/68294

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18 juillet 2025

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1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Modèle murin de maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) avec dysfonctionnement métabolique, modifications de l’expression génique hépatique et altérations histopathologiques hépatiques ressemblant à la MASLD humaine, y compris une fibrose qui progresse vers le stade 3 de fibrose avancée. Ce modèle peut être utilisé dans les études de physiopathologie du MASLD et dans les études précliniques de nouvelles thérapies.

Résumé

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La fibrose hépatique est le prédicteur le plus important des résultats indésirables de la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD). Dans les études précliniques sur le MASLD, les souris sont le modèle de maladie le plus couramment utilisé. Cependant, dans ces modèles, la fibrose hépatique est difficile à induire. Ce protocole décrit un modèle murin de MASLD dans lequel des souris Ay hyperphagiques sont nourries avec un régime riche en graisses et en fructose, ce qui ressemble au régime alimentaire moyen aux États-Unis. Les souris développent une stéatose hépatique, des blessures, une inflammation et une fibrose. La fibrose progresse d’une fibrose péricellulaire de stade 1 après 16 semaines à une fibrose de stade 3 après 12 mois. Ces souris développent également l’obésité, l’hypertriglycéridémie, l’intolérance au glucose et l’hyperinsulinémie. Ce modèle de maladie reproduit l’histopathologie hépatique, les altérations de l’expression génique hépatique et le dysfonctionnement métabolique de la maladie humaine. Ce protocole comprend deux méthodes pour quantifier la fibrose : la coloration histologique du collagène par le rouge picro-sirius, et la quantification de la teneur hépatique en hydroxyproline. Ces méthodes peuvent être utilisées pour l’étude de la physiopathologie du MASLD et pour les études précliniques de thérapies potentielles.

Introduction

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La maladie hépatique stéatosique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) est la maladie hépatique la plus courante, avec une prévalence de 31 % à 40 % aux États-Unis et de 42 % dans le monde 1,2,3,4. Les patients atteints de MASLD peuvent développer une stéatohépatite associée à un dysfonctionnement métabolique (MASH), une stéatohépatite non alcoolique (NASH), une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire 5,6. Le MASLD augmente le risque de carcinome hépatocellulaire et, suite à l’augmentation récente de la prévalence du MASLD, il est devenu la maladie du foie la plus courante chez les patients qui développent un carcinome hépatocellulaire 7,8. Dans le MASLD, la fibrose est le principal prédicteur de la progression vers la cirrhose et des résultats cliniques défavorables, y compris la morbidité liée au foie (décompensation hépatique, insuffisance hépatique ou cancer du foie) et la mortalité liée au foie 6,9,10,11. En conséquence, la Food and Drug Administration encourage le développement de thérapies axées sur les MASH/NASH avec fibrose, ainsi que l’utilisation de modèles animaux appropriés12.

Dans les études précliniques de médicaments et dans les études mécanistes de MASLD, les modèles murins sont les plus couramment utilisés13. Des milliers de modèles murins de MASLD ont été décrits, suggérant un manque de consensus sur un modèle optimal13,14. L’établissement de modèles optimaux se heurte à plusieurs défis. Bien qu’il soit relativement facile d’induire l’obésité et la stéatose chez les souris en les nourrissant avec des régimes riches en graisses, la fibrose hépatique est plus difficile à induire 13,14,15,16. Dans les modèles MASLD pilotés par des régimes obésogènes, la fibrose se développe lentement17 Bien que cette progression lente puisse mieux imiter la maladie humaine18, elle augmente la durée et le coût des études animales. Les régimes à forte teneur en cholestérol (par exemple, 2 %) favorisent le développement de la fibrose ; Cependant, ils diminuent également la synthèse endogène du cholestérol, ce qui est l’opposé de l’augmentation décrite dans la maladie humaine15,16. Certains modèles MASLD utilisent des souris mutantes ou génétiquement modifiées ; Cependant, ils peuvent avoir des mises en garde : les souris OB/OB développent l’obésité, la stéatose et la résistance à l’insuline, mais elles manquent de leptine, qui est un médiateur de la fibrose ; Les souris nulles PTEN développent une stéatose mais ne développent pas de résistance à l’insuline15,17. Par conséquent, les modèles murins de MASLD nécessitent souvent de longues durées d’étude, des régimes à forte teneur en cholestérol ou des manipulations génétiques pour développer une fibrose significative14. Pour résoudre certains de ces problèmes, nous avons développé un modèle murin dans lequel les animaux développent une MASLD avec une fibrose qui progresse de la fibrose péricellulaire/périsinusoïdale (stade 1) à la fibrose de pontage (stade 3)19.

L’objectif de cet article est de décrire ce modèle de MASLD avec fibrose hépatique et deux méthodes pour quantifier la fibrose : la coloration histologique du collagène par rouge picro-sirius et la quantification de la teneur hépatique en hydroxyproline.

La raison d’être de l’élaboration de ce modèle était que les modèles animaux les plus utiles sont ceux qui reproduisent le mieux la maladie humaine, à la fois dans les facteurs de la maladie et dans les altérations de l’histopathologie et de l’expression des gènes. Par conséquent, nous avons utilisé un régime qui ressemble au régime alimentaire moyen aux États-Unis, comprenant des quantités modérément élevées de graisses et de fructose19,20. Nous avons donné ce régime à des souris porteuses de la mutation jaune Agouti (Ay), qui ont été largement utilisées comme modèles d’obésité21. Ces souris expriment de manière ubiquitaire la protéine agouti, un antagoniste des récepteurs de la mélanocortine, y compris MC4R, provoquant une hyperphagie et reproduisant l’augmentation de l’apport alimentaire qui est courante dans l’obésité humaine 21,22,23. Ce modèle récapitule les altérations qui définissent MASH, notamment la stéatose, les lésions hépatocellulaires, l’inflammation, la fibrose et le dysfonctionnement métabolique.

Les principaux avantages de ce modèle sont les caractéristiques qui le rendent similaire à la maladie humaine. Le modèle utilise un régime de type occidental, qui a été conçu pour ressembler au régime américain typique et s’est avéré être le régime le plus efficace pour reproduire le phénotype du MASLDhumain 14,20. Les souris développent des altérations histopathologiques hépatiques similaires à celles décrites dans le foie des humains avec MASH19,24. Les souris développent un dysfonctionnement métabolique, qui est un critère essentiel pour le diagnostic de MASLD5. Le foie des souris atteintes de MASH présente des changements dans l’expression des gènes qui récapitulent ceux des humains atteints de MASH/NASH19. Une étude récente a comparé 39 modèles murins de MASLD pour leur similitude avec la maladie humaine. Il comprenait des souris knock-out MC4R, qui partagent le même mécanisme d’hyperphagie et ont reçu le même régime alimentaire que le modèle que nous décrivons14. Ce modèle s’est classé cinquième (sur 39) pour sa similitude avec le MASLD humain, tel qu’évalué par le phénotype, l’histopathologie hépatique et la transcriptomique14.

Les autres avantages de ce modèle sont les suivants : Les souris Ay sont disponibles dans le commerce auprès du Jackson Laboratory et sont disponibles dans la souche C57BL/6J, qui est couramment utilisée dans les études métaboliques21,25 ; Les souris mutantes sont facilement identifiables par la couleur de leur pelage ; le modèle peut être combiné avec des modèles de gain ou de perte de fonction pour étudier le rôle de gènes spécifiques dans le développement de la MASLD ; et enfin, le modèle n’utilise pas les carences en nutriments (carence en choline ou en méthionine), les composants alimentaires inhabituels (acide cholique, éthionine), une teneur inhabituellement élevée en nutriments spécifiques (gras trans) ou les hépatotoxines (tétrachlorure de carbone), qui ne sont pas des causes courantes de MASLD et peuvent ne pas reproduire la maladie humaine 13,14,17.

Cette méthode est appropriée pour l’investigation des mécanismes qui contribuent au développement et à la progression de la MASLD ainsi que pour l’évaluation des interventions pour son traitement ou sa prévention. Ce modèle est particulièrement utile car les animaux développent non seulement une stéatohépatite et un dysfonctionnement métabolique, mais développent également une fibrose qui progresse jusqu’au stade 3. Le modèle peut ne pas être approprié pour l’étude des mécanismes qui affectent le comportement alimentaire (par exemple, les agonistes du GLP1R), car ces souris présentent une hyperphagie.

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Protocole

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Ce protocole suit les directives de soins aux animaux du Brooklyn College ; Numéro de protocole IACUC 318.

1. Modèle murin de MASLD avec fibrose

  1. Élevez des souris pour produire une progéniture Ay. Établissez des couples reproducteurs avec des souris Ay (B6. Cg-Ay/J). Notez la date de naissance des petits.
  2. Assurez-vous que les portées ont un nombre similaire de petits pour favoriser une alimentation et une croissance adéquates et uniformes. Essayez d’avoir cinq à six petits par portée, car il s’agit de la taille moyenne d’une portée pour les souris C57BL/6J. Les chiots supplémentaires, de préférence ceux du sexe qui n’en ont pas besoin, peuvent être euthanasiés ou placés en famille d’accueil.
    REMARQUE : L’utilisation de mâles Ay et de femelles de type sauvage (C57BL / 6J Jax 0000664) peut améliorer l’efficacité de la reproduction car les souris femelles C57BL / 6J de type sauvage sont faciles à obtenir et peuvent être de meilleurs reproducteurs que les souris femelles Ay.
  3. Installez des cages pour les expériences comme décrit ci-dessous.
    1. Identifiez les souris Ay par la couleur jaune de leur pelage. Attribuez une identification unique à chaque souris et marquez-la ou marquez-la.
      REMARQUE : L’allèle jaune agouti (Ay) du gène agouti confère une couleur de pelage jaune. L’allèle est semi-dominant chez les hétérozygotes. L’homozygotie provoque la létalité embryonnaire. Par conséquent, les souris avec une couleur de pelage jaune sont hétérozygotes pour le gène Ay.
    2. Sevrez les souris à l’âge de 21 jours. Regroupez les souris qui seront logées dans la même cage pendant l’étude. Hébergez trois ou quatre souris Ay par cage, selon le poids corporel prévu et les directives de l’établissement.
    3. Donnez de la nourriture standard et de l’eau. Souris domestiques à température standard (20-23 °C) et à humidité relative (40 % à 60 %) avec un cycle de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité.
  4. Nourrissez les souris Ay avec un régime riche en graisses et en fructose (régime riche en graisses et en fructose, HFFD) à partir de l’âge de 8 semaines, comme décrit ci-dessous.
    1. Fournir aux souris Ay le régime occidental, qui est riche en graisses et en saccharose (calories ajustées Western Diet Inotiv TD.88137) ad libitum.
    2. Préparez une solution contenant du fructose (23 g/L) et du glucose (19 g/L) dans l’eau potable. Stérilisez la solution par filtration à travers un filtre de 0,2 μm et conservez-la dans des flacons stériles. Une fois ouvert, conservez la solution au réfrigérateur.
    3. Fournissez aux souris la solution contenant du fructose et du glucose à boire, dans des bouteilles stériles. Remplacez la solution et les bouteilles au moins une fois par semaine, en vérifiant la croissance de micro-organismes.
    4. Utilisez de la litière de cage sans valeur nutritive (p. ex., copeaux de bois).
  5. Donnez aux souris témoins un régime pauvre en graisses et en fructose comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Le type de souris témoins à utiliser dépend de la conception de l’étude : Si des souris Ay-HFFD sont utilisées pour évaluer l’effet de médicaments, les souris témoins peuvent être des souris Ay-HFFD traitées avec un placebo. Si le modèle est utilisé pour étudier l’effet d’une modification génétique sur le développement de la fibrose, les souris Ay-HFFD sans modification génétique peuvent être utilisées comme témoins. Si vous souhaitez des contrôles sans MASH, suivez les étapes décrites ici.
    1. Utilisez des souris de type sauvage qui sont des compagnons de portée des souris Ay. Ils peuvent être identifiés par la couleur de leur pelage noir.
    2. Nourrissez les souris avec un régime témoin (régime de contrôle faible en gras Inotiv TD.08485 ; appelé régime faible en gras et en fructose, LFFD) commençant au même âge. Fournissez aux souris de l’eau potable régulière.
  6. Surveillez le développement de l’obésité en pesant les souris chaque semaine, en plaçant les animaux éveillés dans un récipient taré sur une balance de laboratoire et en enregistrant leur poids.
  7. Assurez-vous que les souris ont suffisamment de nourriture et de solution pour boire à tout moment. Surveillez et enregistrez la consommation de solutions alimentaires et abreuvées pour estimer l’apport calorique, si vous le souhaitez.
  8. Prélevez les tissus comme décrit ci-dessous.
    1. Effectuez un prélèvement de tissus après 16 semaines de régime HFFD. Euthanasier la souris par inhalation de dioxyde de carbone (ou d’autres méthodes approuvées par l’IACUC de l’établissement).
      REMARQUE : Après 16 semaines, les souris Ay nourries avec le régime HFFD ont généralement une fibrose de stade 1 ; Prolonger le temps entraînera une plus grande fibrose, progressant vers le stade 3 après 9 à 12 mois.
    2. Pesez la souris et notez le poids19.
    3. Prélever du sang si nécessaire. Pour ce faire, prélevez du sang de la veine cave inférieure à l’aide d’une seringue de 1 ml et d’une aiguille de 27 G après avoir ouvert l’abdomen et avant de disséquer le foie (ou utilisez toute autre méthode approuvée par l’IACUC).
    4. Disséquez le foie en ouvrant l’abdomen avec une incision médiane, en tenant le foie par son hile avec des pinces et en coupant les ligaments qui lient le foie au diaphragme et au rétropéritoine avec des ciseaux. Pesez le foie et notez le poids.
    5. Rincer le foie dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée. Photographiez le foie et incluez une règle ou un autre objet comme référence de taille dans l’image. Placez le foie dans une boîte de Pétri placée sur de la glace.
    6. Disséquer des échantillons (environ 100 à 150 mg par échantillon) de plusieurs lobes, y compris le lobe médian, le lobe gauche et le lobe droit. Assurez-vous que les échantillons ont une épaisseur ne dépassant pas 4 mm pour faciliter la fixation. Placez-les dans une solution fixatrice (formol 10 % ou formaldéhyde 4 %) pendant 24 h et traitez-les pour une analyse histopathologique (voir ci-dessous).
    7. Disséquez des échantillons supplémentaires de plusieurs lobes. Placez-les dans des tubes (1,5 ou 2 mL), congelez-les en les immergeant dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C. Ces échantillons seront utilisés pour mesurer la teneur en hydroxyproline.
    8. Prélever des échantillons d’autres organes si désiré (tissu adipeux, muscle, etc.)

2. Coloration histochimique du collagène et quantification morphométrique

REMARQUE : Les étapes qui nécessitent l’utilisation de produits chimiques dangereux et/ou volatils doivent être effectuées dans une hotte. Toutes les lames doivent être traitées en parallèle à l’aide de plats de coloration et de porte-lames.

  1. Préparez des coupes de foie comme décrit ci-dessous.
    1. Fixez le tissu hépatique en le maintenant dans du formol (ou du formaldéhyde) pendant 24 h à température ambiante. Utilisez un volume de fixateur 20 fois supérieur au volume du tissu. Ensuite, transférez les tissus à 70 % d’éthanol. Le protocole peut être mis en pause à ce stade.
      REMARQUE : Les tissus peuvent être placés dans des cassettes d’histologie qui sont ensuite placées dans un récipient avec fixateur ou, alternativement, dans des récipients ou des tubes individuels.
    2. Incorporez les tissus dans la paraffine. Cela est généralement fait par une installation centrale ou un service d’histopathologie.
    3. Obtenir des sections d’une épaisseur de 0,5 μm montées sur des glissières (les glissières non chargées sont suffisantes). Laissez sécher les sections en les exposant à l’air à température ambiante. C’est généralement ce qu’effectue une plateforme ou un service d’histopathologie. Le protocole peut être mis en pause à ce stade.
  2. Déparaffiniser et réhydrater les sections comme décrit ci-dessous.
    1. Déparaffiniser les sections en les immergeant dans deux changements de solution de déparaffination/clarification (xylène ou citrisolv), pendant 5 à 15 minutes dans chacun.
    2. Réhydratez-vous en immergeant successivement les lames dans de l’éthanol à 100 %, de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 70 % et de l’eau, pendant 5 minutes chacune.
  3. Techez les sections de rouge picro-sirius comme décrit ci-dessous.
    1. Immerger des sections dans une solution de rouge Sirius (rouge direct 80) 1 g/L dans de l’acide picrique à 1,3 % pendant 1 h. Ne colorez pas beaucoup plus longtemps, car le rouge direct peut tacher des structures autres que le collagène (par exemple, les noyaux). Ajouter du vert rapide (1 g/L) à la solution de coloration si une contre-coloration est souhaitée26. Vous pouvez également colorer les noyaux avec l’hématoxyline27 de Weigert.
    2. Remettre la solution de picro-sirius rouge dans un récipient fermé en verre foncé ou en plastique pour le stockage. La solution peut être réutilisée plusieurs fois (pendant au moins 20 ans27).
  4. Immerger les échantillons dans de l’éthanol (100 %) pendant 5 min pour les déshydrater. Répétez l’opération avec un deuxième changement d’éthanol.
  5. Immerger dans une solution éclaircissante (xylène ou citrisolv) jusqu’à ce qu’ils soient retirés individuellement pour le montage.
  6. Retirez une lame à la fois de la solution éclaircissante et retirez l’excès de liquide en épongeant sur du papier absorbant. Ajouter un support de montage (environ 50 à 100 μL). Couvrez la section avec une lamelle et appuyez doucement sur la lamelle pour éliminer les bulles d’air. Laissez sécher à l’air libre.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause à ce stade.
  7. Observez des coupes à l’aide d’un microscope optique avec un éclairage en fond clair et des objectifs de 4x à 20x - le collagène apparaît rouge sur un fond jaune-orange clair. Imagez les zones d’intérêt avec une caméra couleur, selon les instructions de la caméra.
  8. Effectuez l’imagerie avec la microscopie à lumière polarisée comme décrit ci-dessous.
    1. Engagez et ajustez les filtres du polariseur et de l’analyseur de manière orthogonale pour vous assurer que le collagène est visible et que le signal de fond est minimal. Le collagène est visible sous forme de blanc, de jaune ou d’orange sur un fond sombre. Dans les sections avec peu ou pas de fibrose, le collagène dans les parois des vaisseaux sanguins sera visible. Gardez les paramètres, y compris l’intensité de l’éclairage, les mêmes pour tous les échantillons à comparer.
    2. Image à l’aide d’un appareil photo monochrome ou du mode monochrome dans un appareil photo couleur. Utilisez un objectif à grossissement 4x. Prenez plusieurs images par section. Évitez les zones proches du hile si elles ont de gros vaisseaux sanguins. Utilisez les mêmes paramètres pour toutes les images à comparer.
  9. Effectuez une quantification morphométrique à l’aide de Photoshop (alternative a) comme décrit ci-dessous.
    1. Quantifiez la zone blanche dans les images, qui correspond au collagène. Dans Photoshop, cliquez sur Sélectionner > Plage de couleurs, puis sur Tons clairs et ajustezles paramètres Flou et Plage pour sélectionner les pixels blancs, correspondant au collagène. Ensuite, sélectionnez Fenêtre > Histogramme > Vue développée et enregistrez le nombre de pixels sélectionnés, affiché à côté du paramètre Pixels. Utilisez les mêmes paramètres pour toutes les images à comparer.
    2. Quantifiez la surface totale de l’image. Dans Photoshop, cliquez sur Sélectionner > Tout, puis enregistrez le nombre total de pixels comme vous l’avez fait précédemment.
    3. Calculez le pourcentage de la surface de l’image correspondant au collagène en divisant le nombre de pixels blancs par le nombre de pixels totaux. Les valeurs sont généralement exprimées en pourcentages de surface.
  10. Effectuez une quantification morphométrique à l’aide d’ImageJ (alternative b) comme décrit ci-dessous.
    1. Sélectionnez les zones blanches des images qui correspondent au collagène. Ouvrez l’outil Seuil en cliquant sur Image > Ajuster > seuil (ou appuyez sur Maj + T). Définissez la plage de seuil pour vous assurer que seules les zones tachées de collagène (zones blanches) sont mises en évidence en rouge (par exemple, seuil minimum 64 ; seuil maximum : 255) et cliquez sur Appliquer. Cela binariser l’image, convertissant la région du collagène en noir et l’arrière-plan en blanc.
    2. Mesurez la surface totale de l’image en cliquant sur Analyser > Définir les mesures. Cochez la zone et affichez l’étiquette. Cliquez sur OK. Cliquez sur Analyser > mesure (ou appuyez sur la touche M du clavier). La fenêtre Résultats affichera la zone totale de l’image.
    3. Pour mesurer la surface et le pourcentage de collagène, activez d’abord l’option Limiter au seuil en cliquant sur Analyser > définir les mesures. Vérifiez la surface, la fraction de surface (ImageJ calculera automatiquement le % de collagène), la limite au seuil et l’étiquette d’affichage. Cliquez sur OK. Cliquez ensuite sur Analyser > mesure (ou appuyez sur M). La fenêtre des résultats affichera : Zone de collagène (nombre absolu de pixels) et Fraction de surface (pourcentage de collagène de l’image totale).
    4. Enregistrez les résultats en sélectionnant Enregistrer sous ou copiez-les dans le presse-papiers et collez-les dans une feuille de calcul.

3. Quantification de l’hydroxyproline hépatique

REMARQUE : Les étapes qui nécessitent l’utilisation de bases fortes et d’acides doivent être effectuées avec un équipement de protection individuelle approprié.

  1. Peser les échantillons de foie préparés à l’étape 1.8.7 et consigner les poids. Placez les aliquotes de tissu dans un tube approprié pour l’homogénéisation. Ajouter de l’eau déminéralisée en utilisant un rapport eau/tissu de 900 μL d’eau pour 100 mg de tissu.
  2. Homogénéiser par battement de billes ou par une autre méthode selon les instructions du fabricant jusqu’à ce que le tissu soit complètement homogénéisé, tel qu’évalué par observation visuelle. Le protocole peut être mis en pause à ce moment-là et les homogénats peuvent être stockés à -20 °C.
  3. Effectuez la précipitation des protéines comme décrit ci-dessous. Les étapes suivantes sont effectuées à température ambiante, sauf lorsqu’une température différente est spécifiée.
    1. Transférez environ 500 μL à 1000 μL d’homogénat dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL. Transférez le même volume pour tous les échantillons.
    2. Ajouter de l’acide trichloracétique pour obtenir une concentration finale de 12 % (p. ex., ajouter 120 μL d’acide trichloracétique à 880 μL d’homogénat)28. Vortex brièvement pour mélanger.
    3. Incuber les échantillons dans un bain d’eau et de glace pendant 30 min. Centrifugeuse à 6 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Un précipité contenant la protéine se forme. Éliminer le surnageant par aspiration. Gardez les tubes sur de la glace.
    4. Ajoutez 1 mL d’éthanol glacé (100 %) pour laver la pastille. Remettez le granulé en suspension par sonication (ou autre méthode) et vérifiez visuellement que le matériau est remis en suspension. Centrifuger à 6 000 x g à 4 °C pendant 10 min et éliminer le surnageant par aspiration. Utilisez les paramètres de sonication conformément aux instructions de l’équipement (p. ex., à l’aide d’un sonificateur Branson SFX 150 doté d’une micropointe de 3,2 mm de diamètre, une amplitude de 70 % pendant 10 s est efficace pour la plupart des échantillons). Répétez le lavage 2 fois.
    5. Laissez sécher le granulé à l’air libre pendant 10 minutes, ou plus longtemps si nécessaire.
  4. Effectuez l’hydrolyse des protéines comme décrit ci-dessous.
    1. Ajouter 800 μL d’acide chlorhydrique 6 N dans les tubes contenant le précipité protéique. Remettez la pastille en suspension par sonication (ou autre méthode), en utilisant les mêmes réglages qu’à l’étape 3.3.4.
    2. Transférer la suspension de protéines dans des tubes ou des flacons en verre avec des bouchons à vis ; Fermez hermétiquement. Incuber les tubes au four à 110 °C pendant 22 ± 2 h29.
    3. Tubes à centrifuger à 16 000 x g pendant 10 min ; Les particules formeront une pastille. Cela nécessite généralement de transférer l’hydrolysat des flacons en verre dans des tubes à centrifuger avant la centrifugation.
    4. Transférez le surnageant, qui contient de l’hydroxyproline, dans des tubes de 1,5 ml. Le protocole peut être mis en pause à ce stade. Les hydrolysats peuvent être stockés à 4 °C.
  5. Préparez une courbe standard pour la concentration d’hydroxyproline. Pour les échantillons de foie présentant une fibrose de stade 1 à 3, en utilisant les quantités de tissu indiquées dans le présent protocole, des concentrations standard allant jusqu’à 125 μg/mL sont adéquates (p. ex., dilutions en série de 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,81, 3,91, 1,95 et 0 μg/mL). Préparez les étalons en diluant l’hydroxyproline dans de l’acide chlorhydrique 6N.
  6. Transférez 40 μL de chaque échantillon et étalon dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL étiquetés. Ajouter 10 μL d’hydroxyde de sodium 10 N à chacun et agiter brièvement pour mélanger.
  7. Effectuez l’oxydation de l’hydroxyproline comme décrit ci-dessous.
    1. Préparez un tampon acétate-citrate contenant de l’acide acétique à 1,2 % v/v, de l’acide citrique à 46 g/L, de l’acétate de sodium trihydraté à 120 g/L et de l’hydroxyde de sodium à 34 g/L dans de l’eau désionisée, et ajustez le pH du tampon à 6,5.
    2. Préparez une solution de 12,7 g/L de chloramine T dans un tampon eau :n-propanol :acétate-citrate (1:1:8 v :v :v). Tout d’abord, dissolvez la chloramine T dans l’eau en mélangeant, puis ajoutez le n-propanol, mélangez, puis ajoutez le tampon acétate-citrate et mélangez.
    3. Ajouter 450 μL de solution de chloramine dans des tubes contenant des échantillons et des étalons. Mélanger par vortex. Incuber à température ambiante pendant 25 min30.
  8. Préparez le réactif d’Ehrlich avec 1 M 4-(Diméthylamino) benzaldéhyde dans de l’acide perchlorique :propanol 1:2 (v/v). Ajouter 500 μL de réactif d’Ehrlich aux échantillons et aux étalons. Mélanger par vortex.
  9. Incuber à 65 °C pendant 20 min dans un bloc chauffant, un bain-marie ou un incubateur. À la fin de l’incubation, laisser refroidir les échantillons et les étalons à température ambiante.
  10. Mesurer l’absorbance d’échantillons et d’étalons à une longueur d’onde de 550 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
  11. Tracez l’absorbance en fonction des quantités standard et utilisez une régression linéaire pour créer une courbe standard. Utilisez les paramètres de la courbe standard pour calculer la concentration d’hydroxyproline dans les échantillons.
  12. Calculer la quantité d’hydroxyproline dans les échantillons de foie en fonction du volume total de l’hydrolysat (étape 3.4) et normaliser par la masse de tissu correspondant au volume d’homogénat utilisé pour la précipitation des protéines (étape 3.3.1). Exprimer les résultats en ng d’hydroxyproline par mg de tissu. Alternativement, la concentration de protéines dans les homogénats peut être mesurée et les résultats exprimés en masse d’hydroxyproline par masse de protéines.

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Résultats

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Les souris nourries avec le HFFD prennent plus de poids que les souris de type sauvage nourries au LFFD et développent une obésité (Figure 1A). Ils prennent du poids plus rapidement au cours des 4 premières semaines d’alimentation HFFD, gagnant environ 3 à 4 g / semaine. Après 8 semaines, elles prennent du poids à un rythme similaire à celui des souris témoins (environ 0,6 g/semaine)19. Après 16 semaines, les souris Ay nourries avec l...

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Discussion

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Ce protocole décrit un modèle murin de MASLD avec fibrose hépatique qui réplique la maladie chez l’homme 5,6. Les souris développent une stéatose hépatique, comme le montrent une stéatose mixte micro- et macro-vésiculaire en histologie et une teneur hépatique élevée en triacylglycérol19. Les souris développent également l’obésité, l’hypertriglycéridémie, l’intolérance au glucose et l’hypertension artériell...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health K22CA178098, R03DK101863 et R15DK131627 et des fonds de démarrage du Brooklyn College (à JMC).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4-(Diméthylamino)benzaldéhydeSigma-AldrichD2004
Acide acétiqueDiversNA
Régime calorique ajustéInotivTD.88137Régime alimentaire contenant des graisses (42 % kcal) et du saccharose (34 % p/p). D’autres fournisseurs proposent des régimes avec la même composition
B6. Cg-ay/JLe laboratoire Jackson000021La souche présente la mutation jaune mortelle d’Agouti et un fond C57BL6/J. Actuellement, le Jackson Laboratory dispose de la souche crypropreservée.
C57BL/6JLe laboratoire Jackson000664
CentrifugeuseDiversNAAvec rotor pour tubes de 1,5 mL, réfrigéré, pouvant atteindre 16 000 xg.
CentrifugeuseDiversNA
Chloramine-T hydrateSigma-Aldrich857319
Acide citriqueDiversNA
Direct Red 80Sigma365548-5G
ÉthanolLaboratoires de décontamination2701
Solution de formol, neutrale tamponnéSigmaHT501128
FructoseSigma-AldrichF0127
GlucoseSigma-AldrichG8270
Équipements de traitement histologiqueNANAL’intégration et le coupement peuvent être effectués dans le laboratoire de l’enquêteur ou dans une installation externe
HomogénéiseurDiversNALes batteurs à billes sont efficaces pour traiter plusieurs échantillons. D’autres méthodes d’homogénéisation peuvent être utilisées
Acide chlorhydriqueDiversNA
HydroxyprolineSigmaH5534
Régime pauvre en graisses pour contrôlerInotivTD.08485Régime contrôle, pauvre en graisses (13 % en kcal) et en saccharose (12 % en p/p)
Microscope équipé pour la microscopie à lumière polariséeDiversNA
N-propanolDiversNA
Acide perchloriqueDiversNA
Moyen de montage permountFisher ScientificSP15-100
Acide picrique, solution aqueuse saturée, spectreFisher18612375
Trihydrate d’acétate de sodiumDiversNA
Hydroxyde de sodiumDiversNA
SonicatorDiversNALe Sonicator est utile pour resuspendre les granulés à l’étape 2.5, mais ce n’est pas absolument indispensable
Acide trichloroacétiqueDiversNA
Lunettes VWR Micro Cover, rectangulairesVWR  ;48393-081
Lames de microscope VWR Premium Superfrost Plus | VWRVWR  ;48311-703
Eau, déioniséeDiversNAL’eau déionisée provenant d’un système de purification ou achetée auprès d’un fournisseur.
XylènesFisher ScientificX3FAgent de compensation Citrisolv   ; (Fisher 22-143-975) est vendu comme une alternative respectueuse de l’environnement

Références

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