Conception de systèmes de fermentation à l’état solide pour la production d’enzymes extracellulaires hydrolytiques de polymères par des champignons filamenteux

Summary

Ce protocole utilise le son de blé dans un système de fermentation rotatif à l’état solide pour améliorer la production d’enzymes. Le substrat, complété par des inducteurs tels que la chitine, favorise la croissance fongique dans des conditions contrôlées. Les résultats démontrent des rendements enzymatiques 4 à 6 fois plus élevés que ceux de la fermentation submergée, ce qui démontre l’adaptabilité et l’efficacité de la méthode pour diverses applications biotechnologiques.

Abstract

La fermentation à l’état solide (SSF) est un processus de bioconversion qui utilise un substrat solide qui ne se dissout pas dans un milieu aqueux. Les micro-organismes se développent à la surface du substrat et pénètrent dans sa matrice solide pour en extraire les nutriments essentiels à leur développement. Les SSF se caractérisent par un minimum d’eau libre, avec une teneur en humidité du substrat maintenue au-dessus de 70 %, et impliquent trois phases interconnectées : gazeuse, liquide et solide. Ce protocole décrit l’utilisation du son de blé, un sous-produit agro-industriel, comme substrat de base pour la production d’enzymes dans un système rotatif. Le substrat est complété par un inducteur, tel que la chitine, le chitosane, l’amidon ou la cellulose, pour favoriser la synthèse des protéines hydrolytiques. Le système est hautement adaptable, permettant l’utilisation de différentes formes fongiques, notamment le mycélium, les spores ou les granulés. Dans la méthodologie décrite, l’inducteur et le substrat sont mélangés dans un rapport de 1:100 (p/p), stérilisés par autoclave et ajustés au niveau d’humidité souhaité avec de l’eau stérile. L’inoculum fongique est ensuite ajouté et le système rotatif fonctionne à 10 tr/min pour assurer un mélange et une oxygénation adéquats. Le système est incubé pendant 6 à 8 jours dans des conditions de croissance optimales pour les champignons mésophiles ou thermophiles/thermotolérants, ce qui améliore sa polyvalence. Après l’incubation, l’enzyme est facilement extraite à l’aide d’un tampon froid approprié (par exemple, acétate, citrate ou phosphate), selon le type d’enzyme. L’extrait est clarifié par centrifugation et filtration pour obtenir un surnageant acellulaire. L’enzyme peut ensuite être concentrée ou purifiée selon les besoins. Les résultats ont démontré une augmentation de 4 à 6 fois de l’activité enzymatique par rapport à la fermentation submergée (SmF), soulignant l’efficacité du système. Son adaptabilité à différents substrats, inducteurs et espèces fongiques en fait un outil précieux pour diverses applications biotechnologiques.

Introduction

La fermentation à l’état solide (SSF) est devenue une technologie de bioconversion prometteuse et durable pour produire des enzymes de grande valeur, des composés bioactifs et des métabolites secondaires. Cette technique implique la croissance de micro-organismes sur des substrats solides avec un minimum d’eau libre, simulant leur environnement naturel et permettant une activité métabolique efficace¹. L’objectif principal de ce protocole est d’optimiser la production d’enzymes grâce à un système SSF rotatif qui garantit une meilleure utilisation du substrat, une diffusion d’oxygène et une évolutivité du processus. L’utilisation du son de blé, un sous-produit agro-industriel abondant, comme substrat de base, contribue à la valorisation des résidus agricoles et favorise les pratiques de bioéconomie circulaire².

La SSF présente des avantages significatifs par rapport à la fermentation submergée (SmF), notamment une consommation d’énergie et d’eau plus faible, une concentration de produit plus élevée et une compatibilité avec une large gamme de résidus agricoles peu coûteux tels que le son de blé, les balles de riz et la bagasse de canne à sucre³. Contrairement à la SmF, qui nécessite de grands volumes d’eau et des milieux nutritifs coûteux, les systèmes SSF exploitent des matrices solides qui servent non seulement de surfaces de croissance microbienne, mais fournissent également des nutriments essentiels à l’activité microbienne. De plus, l’eau libre limitée dans les SSF minimise les risques de contamination, ce qui en fait une option plus robuste pour la production d’enzymes dans les environnements industriels⁴. En plus de ses avantages opérationnels, la SSF présente des avantages environnementaux et économiques importants par rapport à la fermentation submergée (SmF). Des études ont montré que les SSF réduisent la consommation d’eau de 50 à 70 % et les coûts énergétiques de plus de 30 % en raison de l’absence de grands volumes d’eau nécessitant une agitation et une aération constantes. De plus, l’utilisation de résidus agro-industriels comme substrats minimise les coûts des matières premières et favorise les pratiques d’économie circulaire en réutilisant les sous-produits agricoles ^2,4.

SSF a été largement validé pour son efficacité et son évolutivité. Par exemple, des études ont rapporté une augmentation de 4 à 6 fois de l’activité enzymatique utilisant la SSF par rapport à la SmF, soulignant les avantages économiques et environnementaux de cette technique ^2,5. De plus, le processus en aval est simplifié, car l’extraction enzymatique nécessite généralement moins d’eau et moins d’étapes de purification. Cela rend les SSF particulièrement attrayants pour les industries qui visent à réduire les coûts d’exploitation et l’impact environnemental⁶.

Le système SSF rotatif décrit dans ce protocole offre plusieurs améliorations par rapport aux méthodes SSF statiques traditionnelles. Alors que les systèmes statiques sont souvent confrontés à des défis tels que la colonisation inégale du substrat et la limitation de l’oxygène, la configuration rotative assure un mélange et une aération complets, favorisant une croissance microbienne uniforme ^7,8,9. Par exemple, ce système a été utilisé avec succès pour produire des enzymes hydrolytiques telles que les chitinases, les amylases et les protéases en utilisant des espèces fongiques comme Aspergillus et Trichoderma².

L’une des principales caractéristiques de ce système SSF est son adaptabilité. L’utilisation du son de blé comme substrat de base démontre le potentiel des résidus agro-industriels pour une bioconversion rentable³. De plus, la supplémentation du substrat avec des inducteurs tels que la chitine, le chitosane et l’amidon améliore encore la synthèse enzymatique en stimulant des voies métaboliques spécifiques ^2,10. Le système est également compatible avec différentes formes de champignons, notamment les spores, le mycélium et les granulés, ce qui permet aux utilisateurs d’adapter le processus à^{leurs besoins} spécifiques2.

La pêche artisanale offre un large potentiel d’application dans divers domaines tels que la biotechnologie alimentaire, la production de biocarburants et l’assainissement de l’environnement¹¹. Son intégration de substrats rentables, ses rendements enzymatiques exceptionnels et sa grande flexibilité de processus font de la SSF une approche essentielle pour les innovations biotechnologiques à l’échelle industrielle.

Protocol

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation du substrat

REMARQUE : Utiliser une marque commerciale de son de blé pour minimiser les variations importantes des caractéristiques du substrat. Chaque lot de son de blé varie en raison de multiples facteurs, ce qui en fait un matériau hétérogène difficile à standardiser, ce qui entraîne des fluctuations dans sa teneur en composants. Si un matériau standardisé est nécessaire, choisissez une matrice alternative ou effectuez une analyse chimique immédiate de chaque lot de son de blé afin de l’ajuster en fonction des besoins.

1. Lavez le son de blé trois fois avec de l’eau distillée stérile pour éliminer les résidus de matière organique, les débris et la poussière. Cela permet également d’éliminer les sucres simples qui pourraient interférer avec la fermentation.
2. Étalez le son lavé sur une plaque en aluminium et séchez-le au four à 60 °C pendant 24 h.
3. Une fois séché, placez le son de blé dans un tube conique stérile de 50 ml.

2. Préparation de l’inoculum

REMARQUE : Ce protocole décrit trois méthodes de préparation de l’inoculum : la suspension de spores, l’inoculation directe avec des disques de mycélium et la suspension cellulaire. Établissez la concentration initiale de l’inoculum et quantifiez les niveaux de protéines pour des calculs de rendement précis.

1. Préparation de la suspension de spores
   1. Transvaser un disque de gélose de 5 mm de diamètre saturé de mycélium sur une plaque de gélose fraîche au dextrose de pomme de terre. Incuber la plaque à 28 °C pendant 5 à 7 jours, ou jusqu’à ce que le mycélium sature le milieu. Certains champignons peuvent nécessiter un temps d’incubation plus long.
   2. Ajouter 5 mL d’eau distillée stérile dans la plaque et détacher mécaniquement les spores à l’aide d’une boucle stérile.
   3. Préparez une dilution de 1:100 de la suspension de spores. Placez 10 μL au centre d’une chambre Neubauer et comptez les spores au microscope. Calculez la concentration des spores (spores/mL) en fonction du facteur et de la dilution de la chambre.
2. Culture du mycélium en milieu liquide
   1. Transvaser une disquette de gélose de 5 mm saturée de mycélium sur une plaque fraîche de gélose pomme de terre-dextrose-incuber et incuber à 28 °C jusqu’à saturation.
   2. Préparez 25 ml de bouillon de pommes de terre et de dextrose dans une fiole stérile de 125 ml et un autoclave.
   3. Transférez un disque de mycélium de 5 mm de la plaque saturée dans le bouillon stérile.
   4. Incuber le ballon sur un agitateur à 125 tr/min pendant 24 à 48 h, selon la souche fongique. Prolongez le temps d’incubation pour les champignons à croissance lente.
   5. Prélever 2 mL pour l’inoculum et 2 mL pour la détermination du poids sec.
3. Inoculation directe de disques de mycélium
   1. Placez un disque de gélose de 5 mm saturé de mycélium sur une plaque fraîche de pomme de terre-dextrose-gélose. Incuber à 28 °C jusqu’à saturation.
   2. Utilisez un disque de mycélium comme inoculum et un autre pour déterminer le poids sec.

3. Préparation du système SSF

REMARQUE : Les inducteurs peuvent être naturels ou commerciaux. Les inducteurs commerciaux purifiés sont préférés pour minimiser les impuretés qui pourraient altérer l’efficacité de la fermentation. Ajustez les ajouts d’eau pour maintenir une humidité relative d’au moins 90 %.

1. Mélanger les composants suivants dans un tube conique stérile de 50 mL : 5 g de son de blé sec ; 0,2 g de l’inducteur (p. ex., chitine commerciale) ; 5,5 mL d’eau (ajuster en fonction de la capacité d’absorption d’eau de l’inducteur) ; 5 mL d’une solution saline stérile contenant 16 g/L de phosphate de potassium monobasique, 4 g/L de sulfate de sodium, 2 g/L de chlorure de potassium, 1 g/L de chlorure de calcium, 400 mg/L de chlorure de zinc, 60 mg/L d’acide borique, 40 mg/L de molybdate de sodium, 150 mg/L de chlorure de magnésium, 100 mg/L de chlorure ferrique et 400 mg/L de sulfate de cuivre.
2. Mesurez l’humidité relative à l’aide d’un hygromètre à électrodes, en veillant à ce qu’il y ait un minimum de 90 % d’humidité. Insérez la sonde d’électrode directement dans le réacteur à différentes profondeurs pour obtenir une mesure représentative de la distribution de l’humidité.
   1. Suivez les étapes pour ajuster l’humidité si elle est inférieure à 90 % :
      1. Ajouter graduellement de l’eau distillée stérile par tranches de 1 mL par 10 g de substrat. Après chaque ajout, bien mélanger pour assurer une répartition uniforme de l’humidité.
      2. Laissez le substrat s’équilibrer pendant 10 à 15 min. Remesurez le taux d’humidité.
      3. Répétez les étapes ci-dessus jusqu’à ce que l’humidité cible de 90 % soit atteinte. Évitez de trop mouiller le substrat tout au long du processus.
   2. Suivez les étapes pour ajuster l’humidité si elle est supérieure à 90 % :
      1. Étalez finement le substrat dans un environnement stérile. Éliminez l’excès d’humidité en (1) exposant le substrat à un flux d’air laminaire, ou (2) en le plaçant dans une chambre de séchage à 30 °C pendant 10 à 15 min.
      2. Vous pouvez également mélanger doucement le substrat pour favoriser une redistribution uniforme de l’humidité. Après le traitement, réévaluez le taux d’humidité.
      3. Répétez l’étape de séchage ou de mélange au besoin jusqu’à ce que l’humidité atteigne 90 %. Ne procédez à la fermentation qu’une fois que l’humidité cible est atteinte.
3. Autoclave le tube à 15 psi pendant 15 min.
4. Après refroidissement, inoculer le substrat avec l’un des éléments suivants : 1 mL de suspension de spores (1 x 10^6-1 x 10⁷ spores/mL), 2 mL de suspension cellulaire ou un disque de mycélium de 5 mm.

4. Procédure de fermentation à l’état solide (SSF)

REMARQUE : Pour les études cinétiques ou les évaluations de paramètres à différents moments, préparez des tubes distincts pour chaque point temporel afin d’assurer la représentativité.

1. Évitez l’agglutination du substrat en faisant tourbillonner les tubes à vitesse maximale pendant 5 min par cycles de 1 min.
2. Placez les tubes dans un mélangeur rotatif à axe horizontal. Assurez-vous que le substrat se déplace librement à l’intérieur des tubes. Réglez le mélangeur pour qu’il fonctionne à 10 tr/min.
3. Incuber le mélangeur dans un incubateur à la température de croissance optimale du micro-organisme. Maintenez la température signalée pour une activité enzymatique optimale lors de l’utilisation d’inducteurs sensibles à la chaleur.

5. Extraction des enzymes

REMARQUE : Les principes fondamentaux de l’extraction sont basés sur la solubilité et l’activité au pH maximal de l’enzyme extracellulaire. Comme la SSF évite le milieu aqueux, l’enzyme extracellulaire est impliquée dans l’eau entourant la matrice solide, ce qui signifie que la concentration est plus élevée que dans la SmF. Dans ce contexte, la sélection du meilleur tampon d’extraction dépend de la connaissance de l’activité souhaitée. L’optimisation des extractions dépend de la concentration enzymatique finale et du type de tampon d’extraction utilisé.

1. Après la période de fermentation souhaitée, remettre le substrat en suspension dans 20 mL de tampon pré-refroidi. Exemples : tampon d’acétate 0,1 M, pH 5,6, pour l’extraction de la chitinase ; Tampon phosphate 0,02 M, pH 6,9, pour l’extraction de l’amylase.
2. Vortex les tubes par cycles : 1 min à vitesse maximale, suivi de 1 min sur glace. Répétez 10 fois.
3. Filtrer la suspension à l’aide de filtres en papier et extraire mécaniquement le surnageant par pression.
4. Clarifier le surnageant par centrifugation à 3000 x g pendant 15 min à 4 °C.
5. Utilisez l’extrait brut directement ou purifiez davantage l’enzyme via la chromatographie sur colonne ou des filtres centrifuges. Des études cinétiques sont également recommandées pour déterminer la constante de Michaelis (Km) et le taux maximal de transformation enzymatique (Vmax)¹².

6. Processus d’optimisation

REMARQUE : Optimisez ce protocole en évaluant et en ajustant la qualité et la concentration des inducteurs, ainsi que le type et la concentration de l’inoculum.

1. Déterminez le temps de fermentation idéal et affinez les étapes d’extraction pour améliorer l’efficacité.
2. Contrôlez et ajustez avec précision les conditions environnementales, y compris la température, le pH et l’aération.
3. Testez divers tampons et conditions d’extraction pour améliorer le rendement et la stabilité de l’enzyme.
4. Effectuer des analyses statistiques, telles que la méthodologie de surface de réponse, pour identifier les variables les plus influentes et obtenir une production enzymatique optimale.

Results

La figure 1A présente la représentation schématique du mélangeur rotatif utilisé dans ce système, qui a une capacité de six tubes coniques de 50 ml. La figure 2B illustre les changements qui se produisent dans le son de blé pendant le conditionnement avant d’entrer dans le processus de fermentation à l’état solide. Comme nous l’avons vu, aucun changement structurel significatif n’a été observé.

La figure 2

Discussion

Cette étude décrit un protocole pertinent pour optimiser la production d’enzymes par des systèmes de fermentation à l’état solide (SSF), spécifiquement conçus pour les champignons filamenteux. Ci-dessous, les aspects critiques de la méthodologie sont discutés, ainsi que son importance, ses limites et ses applications potentielles.

Le succès du protocole dépend fortement d’étapes clés telles que la préparation du substrat et de l’inoculum. Un lavage et un sécha...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Erlenmeyer de 125 mL	Sigma-Aldrich	CLS431684	Pour la culture du mycélium en milieu liquide.
Tube conique de 50 mL	Sigma-Aldrich	CLS430921	Pour le stockage et la préparation des substrats et de l’inoculum.
Tampon acétate, pH 5,6	Sigma-Aldrich	320866	Pour l’extraction de la chitinase.
Filtres Centricon	Millipore	UFC905024	Pour une purification supplémentaire des enzymes.
Chambre de comptage des cellules	Sigma-Aldrich	Z359629	Utilisé pour compter les spores au microscope.
Papier filtre	Whatman	1001-110	Pour filtrer l’extrait enzymatique.
Hygromètre	Todomicro	-	Pour mesurer l’humidité relative du substrat.
Inducteur (p. ex., chitine commerciale)	Sigma-Aldrich	Référence C9752	Utilisé pour améliorer la production d’enzymes pendant la fermentation.
Tampon phosphate, pH 6,9	Sigma-Aldrich	P5379 (en anglais)	Pour l’extraction de l’amylase.
Gélose pomme de terre-dextrose	Sigma-Aldrich	P2182	Milieu de culture pour la culture du mycélium fongique.
Bouillon de pommes de terre-dextrose	Sigma-Aldrich	Réf. P6685	Milieu de culture liquide pour la culture du mycélium fongique.
Mélangeur rotatif	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	Pour maintenir le substrat en mouvement pendant la fermentation.
Composants de solution saline (p. ex., KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Multiple	Pour la préparation d’une solution saline stérile, voir la recette détaillée dans le protocole.
Son de blé	Marché commercial  ;	-	Substrat pour la fermentation à l’état solide.