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Article de méthode

Évaluation de l’impact du cadmium sur l’état redox et le profil métabolique de l’oursin Paracentrotus lividus

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DOI :

10.3791/68300

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29 juillet 2025

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1Higher Institute of Biotechnology - Sidi Thabet, Laboratory of Biotechnology and Valorization of Bio-Geo-Resources, University Manouba, 2Faculty of Sciences of Tunis, Laboratory of Ecology, Biology and Physiology of Aquatic Organisms LR, University Tunis El Manar, 3Laboratory of Mass Spectrometry, National Institute of Research and Physical-Chemical Analysis (INRAP) Biotechpole Sidi Thabet, 4Department of Chemistry, College of Sciences at Bisha, University of Bisha, 5Department of Applied Medical Sciences, Applied College at Bisha, University of Bisha

Dans cet article

Résumé

Ce protocole met en évidence les méthodes d’extraction et de caractérisation des composés bioactifs de l’oursin Paracentrotus lividus (Echinoderm) ainsi que la détermination des paramètres de stress oxydatif après exposition au cadmium.

Résumé

Le cadmium (Cd) est l’un des métaux lourds les plus nocifs pour les organismes aquatiques et un polluant répandu dans le biote marin. En raison de sa biodisponibilité élevée, de sa persistance et de sa capacité à se bioaccumuler, le cadmium (Cd), un métal lourd toxique rejeté par le ruissellement minier, les rejets industriels et les intrants agricoles, est l’un des polluants les plus nocifs pour les organismes aquatiques et un polluant commun dans le biote marin. La présente étude a évalué les effets potentiellement toxiques du cadmium sur les biomarqueurs du stress oxydatif et les profils de métabolites dans les gonades de Paracentrotuslividus exposées à une gamme de concentrations (0,0183, 0,183 et 1,83 mg/L) sur 96 h. Les résultats ont montré que le Cd induisait un stress oxydatif en augmentant les niveaux de malondialdéhyde, de peroxyde d’hydrogène et d’hydroperoxyde lipidique par rapport au groupe témoin, ainsi qu’en augmentant les activités antioxydantes (réduction du glutathion et de la catalase). De plus, sur la base de l’analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse, 74 métabolites ont été identifiés dans les extraits gonadiques des oursins traités et du témoin. L’analyse discriminante partielle des moindres carrés a révélé une séparation de classe claire et a distingué neuf métabolites pertinents par le biais des scores VIP. L’analyse de la carte thermique réalisée a mis en évidence une perturbation des niveaux de stérols et de composés d’acides gras tels que Cholest-5-en-3-ol(3.beta.)-, le démostérol, et le (23S)-éthylcholest-5-en-3.-ol et l’acide eicosapentaénoïque (EPA), ainsi que les défenses antioxydantes telles que l’acide rétinoïque et la régulation des stéroïdes telles que Pregna-5-en-20-one, 3-hydroxy-,(3β). Dans l’ensemble, nos données ont révélé la grande sensibilité des gonades au Cd, même à des concentrations relativement faibles.

Introduction

L’environnement marin peut également être considéré comme un puits important pour plusieurs produits chimiques toxiques, tels que les métaux lourds. En raison de leur lipophilie, ces éléments ont tendance à se lier aux matières particulaires en suspension et à s’accumuler progressivement dans les sédiments marins, où ils présentent une mobilité et une biodisponibilité réduites. Par conséquent, les sédiments marins constituent un important puits de métaux lourds1. Parmi ces contaminants, le cadmium (Cd) est reconnu depuis longtemps comme un polluant mondial majeur de l’eau qui menace les écosystèmes et leurbiote 2. Un tiers du Cd présent dans les écosystèmes aquatiques provient de la fabrication et de l’utilisation d’engrais phosphatés2. D’autres sources de rejet de cadmium dans l’environnement comprennent le secteur minier, les entreprises de galvanoplastie et les processus naturels de la croûte terrestre3. Ce polluant est très répandu en raison de sa capacité à être facilement transporté dans les milieux aqueux et de sa mobilité relativement grande par rapport à d’autres métaux lourds2. D’après la littérature, les concentrations de Cd varient entre 12 et 16 x 10−3 μg/L dans la mer Baltique4, et entre 13,4 x 10−3 et 1,49 μg/L dans un site très contaminé le long des côtes galiciennes (nord-ouest de la péninsule ibérique)5. Des niveaux beaucoup plus élevés de Cd ont été enregistrés dans certaines zones polluées de la mer Méditerranée, où les concentrations peuvent atteindre 80,4 x 10-3 μg/L près de l’île de Sicile (Italie)6, et 48 μg/L dans le golfe de Gabès (Tunisie)7. Ce métal de transition persistant, bioaccumulable et non essentiel est reconnu pour sa capacité à causer de graves problèmes de santé aux organismes humains et aquatiques8. Le cadmium peut exercer directement sa toxicité en se liant aux protéines, en inhibant les activités enzymatiques et en interférant avec l’homéostasie du calcium9. Il peut également agir indirectement par la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), entraînant des dommages oxydatifs aux biomolécules telles que les lipides, les protéines et l’ADN10. Plusieurs études scientifiques ont rapporté que la contamination par le Cd peut déclencher des troubles structurels et fonctionnels chez les organismes aquatiques11.

Comme pour les autres invertébrés benthiques marins, les oursins sont particulièrement exposés à la pollution marine. Malgré leur capacité à accumuler des niveaux élevés de métaux lourds, les oursins peuvent faire face à la contamination par les métaux et survivre dans des environnements pollués12. Ainsi, ils sont communément reconnus comme des organismes sentinelles et sont largement utilisés comme modèles pour les études écotoxicologiques et environnementales13. De nombreuses études ont examiné l’impact de l’exposition au Cd sur plusieurs espèces d’oursins à différents stades de leur vie, y compris les organismes adultes, les embryons et les larves13. Il a été constaté que l’exposition au cadmium peut entraîner divers effets indésirables allant de la réduction du taux de fécondation des œufs, des anomalies dans le développement des embryons et des larves, du stress oxydatif, à l’apoptose et à l’autophagie13. La plupart de la littérature disponible se concentre sur l’effet du Cd sur les embryons en développement des oursins13,14 ; Cependant, seules quelques études15ont été réalisées pour comprendre les effets de ce métal sur le profil métabolique des oursins adultes, et aucune information n’est disponible sur le métabolisme des lipides.

L’exposition continue d’embryons de Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816) à des concentrations subaiguës/sublétales de cadmium provoque un développement anormal avec des défauts d’allongement et de structuration du squelette, associés à une réduction générale de la synthèse des protéines et à une expression différentielle de la métallothionéine16.

La méthode proposée améliore l’évaluation de la toxicité du cadmium (Cd) et du stress oxydatif chez les organismes marins en combinant des tests biochimiques avec un profilage métabolomique ciblé et non ciblé à l’aide de la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). Par rapport aux approches traditionnelles qui reposent uniquement sur des biomarqueurs uniques tels que la peroxydation lipidique ou les activités enzymatiques antioxydantes (par exemple, SOD, CAT), l’ajout d’un dépistage des métabolites basé sur la GC-MS fournit une empreinte biochimique complète de l’état physiologique de l’organisme17. Cette intégration permet une détection plus sensible et systémique des effets sublétaux, même à de faibles concentrations de Cd, et peut détecter des perturbations précoces du métabolisme énergétique, du renouvellement des acides aminés et des voies oxydatives qui se produisent avant les dommages toxicologiques observables. Il est important de noter que cette méthode complète les évaluations toxicologiques existantes en fournissant des données à plus haute résolution et en permettant d’identifier de nouveaux biomarqueurs que les tests traditionnels peuvent manquer18. Il favorise également la compréhension mécaniste par l’analyse au niveau de la voie, ce qui améliore les modèles d’écotoxicologie prédictive19. Cette méthode permet de détecter l’exposition au cadmium dans la gamme de 1 à 100 μg/L, ce qui est pertinent pour les systèmes côtiers et estuariens pollués20. Cette approche est la plus appropriée pour les expositions contrôlées en laboratoire ou les études de terrain modérément complexes. Cependant, l’interprétation peut être difficile dans les matrices fortement contaminées où plusieurs facteurs de stress (p. ex., métaux lourds, HAP, contaminants émergents) interagissent et peuvent fausser la spécificité des biomarqueurs. Malgré cela, lorsqu’ils sont correctement conçus, la robustesse et la spécificité de la GC-MS, combinées à l’analyse de données multivariées (p. ex., PCA, PLS-DA), confèrent un fort pouvoir discriminatoire pour résoudre les effets de chevauchement.

Cette plateforme biochimique-métabolomique intégrée est particulièrement utile pour la surveillance des espèces sentinelles et les évaluations des risques écologiques dans des cadres tels que la Directive-cadre stratégique pour le milieu marin (DCSMM) et est cohérente avec les efforts actuels visant à faire progresser la surveillance environnementale fondée sur les omiques21.

Dans la présente étude, nous avons utilisé l’oursin violet P. lividus, qui est l’une des espèces les plus exploitées et les plus importantes économiquement sur toute la côte atlantique et méditerranéenne22, pour évaluer l’effet de la contamination par le Cd sur l’état redox et le profil métabolomique des gonades.

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Protocole

1. Échantillons et plan d’expérience

  1. Collecter un total de 40 spécimens adultes d’oursins P. lividus (20 mâles et 20 femelles, longueur moyenne : 45 ± 4 mm, âge moyen : 2,0 ± 0,5 ans, poids moyen : 22,54 ± 2,50 g) par des plongeurs à une profondeur de 5 à 7 m en mai 2023 depuis les côtes de Bizerte (mer Méditerranée, Tunisie).
  2. Transférez au laboratoire les oursins P . lividus de sexe mixte collectés, dont l’âge est estimé à environ 12-18 mois en fonction de la taille et conservez-les dans de l’eau de mer naturelle aérée à 16 ± 1 °C avec une salinité naturelle de ~38 PSU, un pH de 7,8-8,0 et une photopériode de 12:12. Surveillez les paramètres quotidiennement tout au long de la période d’exposition pour assurer la stabilité de l’environnement et minimiser les variations externes.
  3. Injecter 1 mL de KCl 0,5 M dans la région péristomiale pour induire la ponte et identifier visuellement les gamètes. Rincez les personnes avec de l’eau de mer filtrée et acclimatez-les pendant 3 jours dans des conditions contrôlées sans apport de nourriture.
  4. Divisez au hasard les oursins en quatre groupes de neuf individus (trois individus par réservoir en trois exemplaires) et répartissez-les dans des aquariums en verre de 50 L. Déterminer la taille de l’échantillon en se fondant sur des études publiées antérieurement23,24 qui ont évalué le stress oxydatif, les biomarqueurs et les réponses métabolomiques chez les invertébrés marins, et utiliser des réplicats biologiques comparables ou inférieurs.
    REMARQUE : Ce niveau de réplication garantit une forte représentation biologique et des résultats statistiquement significatifs.
  5. Après acclimatation, exposer les animaux pendant 96 h à une gamme de concentrations de chlorure de cadmium (CdCl2) comme suit : Groupe I (Ctrl) : oursins conservés dans de l’eau non CdCl2 ; Groupe II (Tr1) : oursins exposés à une concentration de CdCl2de 0,0183 mg/L ; Groupe III (Tr2) : oursins exposés à une concentration de CdCl2de 0,183 mg/L ; Groupe IV (Tr3) : oursins exposés à une concentration de CdCl2de 1,83 mg/L.
  6. Pour maintenir la stabilité de l’eau pendant l’expérience, changez 50 % de l’eau toutes les 24 h, retirez l’eau avec précaution à l’aide d’un siphon et remplacez-la par de l’eau fraîchement préparée tout en maintenant les concentrations de CdCl2.

2. Préparation des tissus

  1. Effectuer, en utilisant le protocole décrit par Telahigue et al.23, la préparation des homogénats de tissu d’oursin.
  2. Disséquez sur de la glace des oursins de chaque groupe à la fin de l’expérience. Utilisez des ciseaux stériles pour faire une coupe circulaire autour de la bouche afin d’ouvrir le test.
  3. Retirez soigneusement les cinq gonades à l’aide d’une spatule et conservez-les pour une analyse plus approfondie. Laver à l’eau distillée froide pour éliminer les débris et les contaminants de surface
  4. Homogénéiser à l’aide d’un sonificateur à sonde réglé à 40 % d’amplitude, en 3 rafales de 10 s chacune avec 20 s de repos entre les rafales, 300 mg de fractions gonadiques avec tampon Tris-HCl (20 mM, pH 7,4) dans des conditions froides.
  5. Divisez chaque échantillon de gonade en deux portions : une pour l’analyse biochimique (fraîche) et une pour l’analyse métabolomique (lyophilisée).
  6. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 20 min. Stockez les surnageants à - 80 °C pour l’analyse des paramètres biochimiques.
  7. Lyophiliser d’autres fractions de gonades à l’aide d’un lyophilisateur avant l’analyse GC-MS. Maintenir pendant 48 h à -50 °C avec un vide de moins de 0,1 mbar jusqu’à ce que le séchage complet soit terminé.
  8. Utilisez la méthode Lowry pour déterminer la teneur totale en protéines de chaque échantillon en utilisant la BSA comme norme. Déterminer le niveau de LOOH à 560 nm et exprimer en mmol/mg de protéines.
    REMARQUE : Cette quantification a été effectuée avant tous les essais biochimiques afin de normaliser les niveaux de biomarqueurs.

3. Réduction du dosage du glutathion

  1. Estimation de la teneur réduite en glutathion (GSH) selon la méthode d’Ellman25, d’après l’absorbance de l’acide 2-nitro-5-mercapturique résultant de la réduction de l’acide 5-50-dithio-bis-2-nitrobenzoïque (DTNB) par le groupe thiol (SH) du glutathion.
  2. Centrifugeuse à 1600 x g pendant 15 min un mélange d’homogénats de tissus dans un tampon phosphate et d’acide sulfosalicylique (4 %).
  3. Prendre un volume de 500 μL du surnageant obtenu et l’ajouter au réactif d’Ellman (DNTB) à l’aide de 0,025 mL. Lire à 412 nm l’absorbance du mélange obtenu.
  4. Évalue la teneur en GSH en mg par g de tissu. Exprimer la teneur totale en GSH en μg/mg de tissu. Calculez les niveaux de GSH à l’aide d’une courbe d’étalonnage standard basée sur les concentrations connues de glutathion réduit.
    REMARQUE : L’objectif est de quantifier la réduction du glutathion (GSH) dans les homogénats gonadiques en tant que marqueur de stress oxydatif après une exposition au cadmium.

4. Activité de la catalase

  1. Effectuer la configuration de la réaction selon la méthode d’Aebi26. Préparez le milieu réactionnel composé de 2,9 mL de tampon phosphate 100 mM (pH 7,4) et de 20 μL de surnageant de tissu gonadique. Prééquilibrez le fluide réactionnel à la température ambiante.
  2. Démarrez la réaction en ajoutant 80 μL de solution de peroxyde d’hydrogène 0,5 M (H2O2) fraîchement préparée dans la cuvette. Mélangez immédiatement soigneusement le contenu et enregistrez la diminution de l’absorbance à 240 nm pendant 1 mi à des intervalles de 10 s à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis.
  3. Calculer l’activité CAT en fonction du taux de décomposition de H2O2, déterminé en surveillant la diminution de l’absorbance à 240 nm au fil du temps. Utilisez la formule suivante : Activité CAT = (ΔA/min x V) / (ε x l x C)
    où : ΔA/min = variation de l’absorbance par minute à 240 nm, V = volume total de l’essai (en L), ε = coefficient d’extinction molaire de H2O2 (43,6 M-1/cm), l = longueur du trajet de la cuvette (généralement 1 cm), C = concentration en protéines en mg/mL.
  4. Utilisez le coefficient d’extinction molaire de 43,6 M/cm. Exprimer l’activité CAT sous forme de nmol H2O2 décomposée par minute par mg de protéine (nmol H2O2/min/mg de protéines).
    REMARQUE : L’objectif est de quantifier l’activité de la catalase dans les homogénats gonadiques de P. lividus comme mesure de la réponse enzymatique antioxydante à l’exposition au cadmium.

5. Mesure de la génération de peroxyde d’hydrogène

  1. Mesurer les niveaux de peroxyde d’hydrogène (H2O2) dans les gonades de P. lividus à l’aide d’un dosage par oxydation ferreuse-xylénol orange selon la méthode décrite par Ou et Wolff27.
  2. Déterminer la concentration de H2O2dans le surnageant à l’aide d’un spectrophotomètre à 560 nm. Exprimer les résultats en nmol/mg de protéines.

6. Dosage du malondialdéhyde

  1. Préparez les échantillons comme décrit dans la méthode Draper et Hadley28. Mélanger 500 μL d’homogénat de gonades avec 1 mL d’acide trichloracétique (TCA) à 10 %. Centrifugeuse à 2500 x g pendant 10 min à 4 °C.
  2. Transvaser 1 mL du surnageant obtenu dans un nouveau tube et ajouter 1 mL de solution d’ATB à 0,67 %. Incuber le mélange au bain-marie à 100 °C pendant 15 min.
  3. Refroidissez les échantillons à température ambiante. Mesurez l’absorbance à 532 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
  4. Soustraire l’absorbance de fond à l’aide d’un blanc de réactif (TBA + TCA sans extrait de tissu). Préparer une courbe standard à l’aide du 1,1,3,3-tétraéthoxypropane (TEP) et exprimer la concentration de MDA en nmol/mg de protéines.

7. Mesure de l’hydroperoxyde lipidique

  1. Mesurer l’hydroperoxyde lipidique (LOOH) dans les tissus gonades en utilisant le dosage de l’oxydation ferreuse dans l’orange de xylénol, comme décrit par la méthode de Jiang et al.29.
    REMARQUE : L’objectif est d’évaluer les niveaux de peroxydation lipidique dans les tissus gonadiques en quantifiant le malondialdéhyde (MDA), un sous-produit des lésions oxydatives de la membrane.

8. Extraction de composés bioactifs à partir de gonades et criblage analytique

  1. Effectuez l’extraction méthanolique des composés lipophiles en trois exemplaires à partir du tissu gonadique séché de chaque groupe en triple exemplaire en trempant le matériau dans du méthanol de qualité analytique (≥99,8 % ; 1:25 p/v) sur un agitateur rotatif à 150 tr/min à température ambiante.
  2. Centrifuger tous les extraits pendant 15 min à 700 x g, 4 °C, après évaporation des fractions MeOH par évaporation rotative à une température de bain d’eau de 40 °C et une vitesse de rotation réglée à 100 tr/min. Remettre l’extrait brut en suspension dans 1 mL de MeOH, puis le conserver dans des flacons scellés à 4 °C.

9. Analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse d’extraits gonadiques

  1. Faites une aliquote de 500 μL dans un flacon en utilisant l’extrait méthanolique qui a été stocké.
  2. Effectuer des analyses par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) sur un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse. La colonne GC était composée de 5 % de phényl-méthylsiloxane : 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm d’épaisseur de film.
  3. Utiliser l’hélium comme gaz vecteur à un débit constant de 1 mL/min. Réglez le volume d’injection à 1 μL en mode split dans un rapport de 100:1. Programmez la température du four de 4 à 280 °C à 5 °C/min.
  4. Faites fonctionner le spectromètre en mode impact d’électrons (EI), l’énergie d’ionisation était de 72 eV, la température de la source d’ions était de 250 °C, le temps de balayage de 1 s et la plage de masse de 45 à 550 amu.
  5. Effectuer l’identification des composés en comparant leurs spectres de masse avec ceux de la bibliothèque NIST98MS et de la base de données Willy Library275.

10. Analyse statistique

  1. Évaluez d’abord la normalité de l’ensemble de données à l’aide du test de Shapiro-Wilk et l’homogénéité des variances à l’aide du test de Levene.
  2. Prétraitez les données avec MetaboAnalyst 6.030, à l’aide de procédures de normalisation standard, de la transformation logarithmique et de la mise à l’échelle de Pareto pour répondre aux hypothèses ANOVA telles que la distribution normale et l’homogénéité de la variance.
  3. Effectuez une analyse statistique multivariée à l’aide de Metaboanalyst, utilisez la méthode du taux de fausses découvertes (FDR) de Benjamini-Hochberg pour la correction de plusieurs tests afin de tenir compte des erreurs de type I liées à de nombreuses comparaisons biochimiques, et garantissez la robustesse statistique.
  4. Utilisez l’analyse de variance à un facteur (ANOVA) pour comparer les résultats entre les groupes. Les différences entre les moyennes étaient considérées comme significatives lorsque p <0,05.
  5. Utilisez l’analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA) pour distinguer des groupes comparables. Déterminez l’importance de la variable dans la projection (VIP) pour tous les composés.
  6. Calculez les valeurs p à l’aide du test t de Student apparié pour l’analyse statistique unidimensionnelle de variables standardisées.

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Résultats

La validité et l’efficacité de nos méthodes ont été assurées par l’utilisation de réplicats biologiques et techniques, qui ont permis des mesures cohérentes et fiables. Les analyses ont démontré une faible variabilité, avec des écarts-types généralement inférieurs à 10 %, indiquant une répétabilité élevée. Pour garantir une quantification précise des métabolites, les analyses GC-MS comprenaient des courbes d’étalonnage et des étalons internes. Toutes les techniques utilisées sont basées s...

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Discussion

Cette étude avait pour but d’évaluer l’effet toxique du Cd sur les gonades de l’oursin P. lividus en analysant les biomarqueurs biochimiques et les métabolites actifs. L’exposition de P. lividus à différentes concentrations de Cd a produit une réponse au stress oxydatif. Ces résultats sont similaires à ceux des rapports précédents indiquant des corrélations étroites entre l’augmentation des niveaux d’antioxydants dans les sols d’oursins et les niveaux de contaminants

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants au décanat des études supérieures et de la recherche scientifique de l’Université de Bisha d’avoir soutenu ce travail par le biais du programme de soutien à la recherche accélérée.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
LyophilisateurBiobaseBK-FD12PTLyophilisation
Chromatographe en phase gazeuseAgilent TechnologiesChromatographe en phase gazeuse HP 6890Détecteur à ionisation de flamme (FID)
Colonne GCAgilent TechnologiesHP-5 (5 %-Phényl)-méthylsiloxane ColonneNon-polaire  ; colonne  ; qui offre des performances exceptionnelles dans une large gamme d’applications
Spectromètre de masseAgilent TechnologiesSpectromètre de masse HP 5973Quadripole  ;MS

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