Technique de biopsie conjonctivale et d’immunofluorescence directe pour le diagnostic de la pemphigoïde de la muqueuse

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de prélèvement et de traitement de la biopsie conjonctivale afin d’identifier la membrane muqueuse pemphigoïde.

Résumé

La pemphigoïde de la muqueuse oculaire (MMP) se présente sous la forme d’une conjonctivite cicatrisante chronique qui, si elle n’est pas traitée, peut entraîner la cécité. Un diagnostic précoce et un traitement immunosuppresseur préviennent la progression de la maladie. La coloration par immunofluorescence directe (DIF) de la biopsie conjonctivale pour le dépôt de complexes immunitaires dans la membrane basale est un diagnostic de MMP. Le taux de positivité à la biopsie dépend des caractéristiques de la biopsie, de la latéralité, de la vieillesse et de l’activité de la maladie. L’article sur les méthodes actuelles décrit la technique de prélèvement de la biopsie conjonctivale et l’utilisation de cartouches remplies de milieu à température de coupe optimale pour le transfert d’échantillons et la préparation de blocs. Une biopsie est effectuée à partir d’une région non cicatricielle, non impliquée ou relativement moins impliquée de la conjonctive dans les deux yeux. La taille habituelle de la biopsie est de 4 à 5 mm de long, 2 à 3 mm de large et doit avoir un minuscule tissu sous-conjonctival sous-jacent afin que la membrane basale ne soit pas manquée. Nous recommandons d’effectuer une coloration périodique à l’acide de Schiff pour confirmer la présence de la membrane basale. À l’aide d’un protocole spécifié, les cryosections des biopsies sont colorées avec des anticorps conjugués fluorescents IgG, IgM, IgA et des facteurs du complément C3c et C4c. Une biopsie positive montre une fluorescence verte positive dans la membrane basale, et même si l’un des anticorps est positif, il est positif à la MMP. Une biopsie négative n’exclut pas la possibilité d’une pemphigoïde ; cependant, un résultat positif confirme le MMP et le différencie de la conjonctivite cicatrisante induite par le médicament ou de la pseudopemphigoïde.

Introduction

La pemphigoïde des muqueuses (MMP) est une maladie conjonctivale cicatrisante chronique d’étiologie auto-immune et affecte les muqueuses du corps ^1,2. La conjonctivite cicatrisante chronique a différentes étiologies, et la différenciation de la MMP du SJS, de la sarcoïdose, de la néoplasie épidermoïde oculaire et de la pseudopemphigoïde est nécessaire car la première nécessite une immunosuppression^{systémique3,4}. De plus, la MMP est une maladie potentiellement cécitante où les patients se présentent souvent tardivement et sont mal diagnostiqués au départ ^1,2,5. Seule une atteinte oculaire sans atteinte systémique peut être observée chez 27,4 % des patients atteints de MMP oculaire⁶. Le diagnostic de MMP nécessite une biopsie conjonctivale pour montrer la présence d’auto-anticorps dans la membrane basale ^2,5. L’immunofluorescence directe (DIF) est un outil de diagnostic essentiel pour identifier les maladies auto-immunes affectant la conjonctive, telles que la MMP. La DIF permet de détecter le dépôt in situ d’immunoglobulines et de composants du complément au niveau de la zone de la membrane basale (BMZ), une caractéristique de la MMP. Les taux de positivité des DIF varient de 30 % à 80 %^1,5. Cependant, certains patients peuvent avoir une biopsie négative, en particulier ceux avec une MMP oculaire uniquement, mais la documentation clinique de la progression de la maladie est traitée de la même manière que les cas de MMP oculaire positive^à la biopsie ^7,8. Par conséquent, Dart et al. ont souligné la nécessité de critères de diagnostic distincts pour le MMP⁸ uniquement oculaire.

Les raisons avancées pour expliquer le faible taux de positivité dans les études sont une maladie avancée avec une cicatrisation étendue de la surface oculaire, des techniques de traitement ou de coloration des tissus inadéquates et une variante de la maladie négative^à la biopsie 8,9,10,11. Une analyse rétrospective des biopsies de 27 patients suspectés d’une MMP oculaire n’a révélé qu’un taux de positivité de 30 %, et 63,7 % n’avaient qu’une atteinte oculaire¹². DIF nécessite un protocole spécifique ; Tous les laboratoires de diagnostic ne sont pas à l’écoute de cela. Il existe des différences concernant le site de la biopsie, s’il faut effectuer une biopsie d’un œil ou des deux, et les solutions de transfert d’échantillon 13,14,15. Dans une analyse rétrospective des biopsies conjonctivales dans notre centre, le taux de positivité du DIF était de 54,1 %, avec plus de résultats positifs lors des biopsies bilatérales (59 % contre 45 %)⁸. Bien qu’une biopsie soit critique, les signes cliniques et la cicatrisation progressive de la surface oculaire aident à confirmer le diagnostic de MMP. Il est plus facile à diagnostiquer lorsqu’un site extraoculaire est impliqué, tel que buccal ou cutané, rapporté chez 40 % et 18 % des patients, respectivement⁵.

Il existe des variations dans la littérature existante, et le protocole présenté ici peut servir de guide de référence avec des modifications introduites pour réduire le besoin d’un support de transfert unique¹⁴. Les biopsies sont transférées dans un milieu à température de coupe optimale (OCT) et congelées dans la même cartouche de transfert dans le laboratoire de pathologie, ce qui évite d’avoir besoin d’un milieu de transfert supplémentaire. Le présent article décrit la méthodologie de coloration DIF du tissu conjonctival, le prélèvement de tissus et le protocole de transfert d’échantillons.

Protocole

Le protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine du comité d’éthique de la recherche humaine de l’Institut LV Prasad Eye.

1. Technique de biopsie conjonctivale

1. Planifier une biopsie des deux yeux du patient suspecté de pemphigoïde sous anesthésie topique ou locale et au microscope opératoire.
2. Demandez le consentement éclairé du patient et énumérez les effets secondaires possibles des saignements, des cicatrices et la nécessité de commencer à prendre des stéroïdes topiques après la chirurgie.
3. Placez 1 à 2 gouttes de proparacaïne à 0,5 % dans les deux yeux et attendez 5 minutes avant de commencer la procédure.
4. Assurez-vous que le patient ne ressent pas de douleur lorsqu’il touche la conjonctive avec des pinces fines. Si le patient ressent toujours de la douleur après l’application de proparacaïne topique, injecter 0,2 mL de lidocaïne sous-conjonctivale à 2 % avec une seringue de tuberculine de 1 mL.
5. Placez un spéculum dans l’œil droit ou l’œil gauche, selon ce qui est choisi en premier.
6. Examinez la surface oculaire à la recherche de zones de cicatrisation et de kératinisation. Sélectionnez la zone de biopsie qui n’est pas touchée et qui n’est pas cicatrisée ou kératinisée.
   REMARQUE : Dans cette étude, la conjonctive bulbaire supérieure éloignée du limbe est préférée comme site de biopsie, suivie de la conjonctive bulbaire inférieure.
7. Utilisez la pince de Lim pour soulever la sclérotique de la conjonctive et excisez linéairement avec les ciseaux de Westcott, mesurant 4 à 5 mm de long et 2 à 3 mm de large.
8. Transférez immédiatement l’ensemble de la biopsie dans un milieu de coupe optimal (OCT).
   REMARQUE : On peut transférer les biopsies dans une solution saline normale ou dans un milieu de transport Michel.
9. Prenez une cartouche et un moule en tissu plastique avec un puits au centre, nettoyez-le avec une solution saline et faites-le sécher à l’air.
10. Remplissez la cartouche avec du milieu OCT séparément pour l’œil droit et l’œil gauche. Immergez le tissu conjonctival excisé dans le milieu OCT et envoyez-le en pathologie.
11. Répétez également les étapes similaires pour le côté controlatéral.

2. Transfert du tissu

1. Intégrer les échantillons de biopsie de la conjonctive dans un milieu OCT pour préserver l’architecture tissulaire et l’antigénicité s’ils sont reçus dans le milieu de transport de Michel ou une solution saline normale.
2. Congelez les échantillons incrustés à l’aide d’azote liquide ou de glace sèche et conservez-les à -80 °C pendant la nuit.

3. Préparation et section des tissus

1. Sectionner le tissu congelé en tranches de 4 à 6 μm (au nombre de 7) à l’aide d’un cryostat à -20 °C à -25 °C.
2. Montez les sections sur des lames de microscope recouvertes de polylysine chargée positivement pour assurer l’adhérence et conservez-les à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient colorées dans une feuille d’aluminium.

4. Coloration immunofluorescente

1. Décongeler les lames à température ambiante (RT) pendant 10 min et fixer dans de l’acétone froide (100 %) pendant 10 min pour préserver les antigènes et prévenir les lésions tissulaires.
2. Rincer trois fois avec 1x PBS, à chaque fois pendant 5 minutes pour éliminer l’excès de milieu OCT et d’acétone.
3. Appliquez des anticorps conjugués anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM et anti-C3 dilués (fibrinogène-1:10 [contrôle positif], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10) sur des lames.
   REMARQUE : Les anticorps sont dilués dans 1x PBS.
4. Pour les contrôles négatifs, évitez l’application d’anticorps conjugués et suivez les étapes restantes mentionnées ci-dessous.
5. Suivez les directives du fabricant pour diluer les anticorps et normalisez avec des contrôles positifs et négatifs connus.
6. Incuber les lames dans une chambre humidifiée à 37 °C pendant 45 à 60 min.
7. Laver les lames avec du PBS (3× pendant 5 minutes chacune) pour éliminer les anticorps non liés.
8. Contre-coloration avec un milieu de montage contenant du DAPI (4',6 -diamidino-2-phénylidole) pour la visualisation nucléaire.
9. Placez une lamelle sur les lames et laissez-les durcir pendant 20 min.
10. Examiner les lames à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé de filtres adaptés aux fluorophores utilisés (filtre vert d’excitation pour 488 nm).
11. Documentez les résultats à l’aide de micrographies numériques.

5. Coloration périodique rapide à l’acide - Schiff

1. Préparation de Schiff acide périodique (PAS)
   1. Dissoudre 1 g de fuschin basique dans 100 mL d’eau distillée chaude.
   2. Ajouter 10 ml d’acide chlorhydrique et 2 g de disulfite de potassium pour décolorer le colorant.
   3. Après refroidissement, ajoutez 0,5 g de charbon actif, remuez et filtrez la solution pour obtenir un réactif de Schiff acide périodique clair. Conserver dans une bouteille sombre.
      REMARQUE : Pour tester le réactif de Schiff, versez 10 ml de formol à 37 % dans un verre de montre et ajoutez quelques gouttes de Schiff à tester. Un bon réactif de Schiff prendra rapidement une couleur rouge-violet. Une détérioration du réactif de Schiff provoquera une réaction retardée et le produit sera d’un bleu-violet profond.
2. Technique de coloration PAS
   1. Hydratez les lames dans de l’eau.
   2. Oxyder dans une solution acide périodique à 0,5 % pendant 5 min.
   3. Rincer à l’eau distillée.
   4. Placez dans le réactif de Schiff pendant 15 min (les sections sont légèrement roses pendant cette étape)
   5. Laver à l’eau tiède du robinet pendant 5 min (les sections deviennent rose foncé).
   6. Appliquer une contre-coloration dans l’hématoxyline de Mayer pendant 1 min.
   7. Laver à l’eau du robinet pendant 5 min.
   8. Déshydratez les lames dans les solutions suivantes : une fois dans de l’alcool éthylique à 80 % pendant 1 min, deux fois dans de l’alcool éthylique à 90 % pendant 1 min, deux fois dans de l’alcool éthylique à 100 % pendant 1 min.
   9. Déshydratez les lames trois fois dans du xylène pendant 1 min chacune.
   10. Placez une lamelle sur les glissières à l’aide d’un support de montage synthétique (par exemple, un support de montage DPX)
   11. Observez les résultats du PAS au microscope à fond clair.

Résultats

L’interprétation de la DIF nécessite la confirmation de la présence de la membrane basale dans les coupes de tissus (Figure 1). Dans les lames colorées au PAS, la membrane basale apparaîtra comme une membrane rose vif située dans la région basale de l’épithélium conjonctival (Figure 1C). La continuité et l’architecture de la membrane sous-sol sont également à commenter. La positivité de DIF sera observée sous la forme d’un BM vert vif (Figur...

Discussion

La technique de biopsie conjonctivale décrite ici utilise le milieu OCT comme milieu de transfert, évitant ainsi le besoin d’un milieu de transfert supplémentaire et évitant la manipulation de la biopsie pour le transfert dans le milieu OCT pour la cryosection. Un moule à cartouche en plastique rempli de milieu et de biopsie est directement congelé pour faire des blocs de tissus, puis sectionné. Les avantages de l’OCT sont qu’il gèle rapidement avec un minimum de dommages causés par la f...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 N Acide chlorhydrique  ;	Finar  ; chemical Limited  ;	7647-01-0
Acétone  ;	Qualigens	Question n°33517
Albumine	DAKO	F0117
Fuchsin de base	Qualigens	Référence n°39402
C3c	Biosystèmes de diagnostic  ;	F003
C4c	Biosystèmes de diagnostic  ;	F005
Cartouche	Polysciences	25376-500
Activé au charbon de bois  ;	Sigma	C-5260
Cryostat  ;	Leica  ;	CM1860UV
Pales de cryotome  ;	Leica  ;	818
DAPI	Abcam  ;	Ab104139
Fibrinogène  ;	Biosystèmes de diagnostic  ;	F006
Fluorescence Microscope	Olympe	CX43
Forceps  ;	Joja chirurgical	JS1528A
Chambre d’humidité  ;	Biosystèmes de diagnostic  ;	SM365
IgA	Biosystèmes de diagnostic  ;	F007
IgG	Biosystèmes de diagnostic  ;	F008
Igm	Biosystèmes de diagnostic  ;	F009
IHC Lames de verre adhésives  ;	Tomo  ;	33140455
Pince de Lim	Speedway  ;	Réf. S-7223
Michel’s tansport medium	Pêcheur Scinitique  ;	NC0253304
Verre de protection microscopique	Étoile bleue	https://www.bluestarslides.com
OCT Medium  ;	Cryomatrice  ;	6769006
PBS  ;	DAKO	DM831
Acide périodique  ;	Sigma	Référence 375810-25G
Disulfite de potassium	Sigma	P2522-500G
Proparacaïne 0,5 %	Sunway Private  ;	G/1118A
Ciseaux de Westcott	Instruments Gurgical Pillig  ;	423480