Interfaces électriques et optoélectroniques bidirectionnelles dans des cœurs de rat ex vivo sains et ischémiques

Résumé

Ce protocole décrit la fabrication de matériaux avancés et les méthodes ex vivo de cœur de rat pour la biointerface bidirectionnelle optique et électrique, permettant une stimulation cardiaque précise, l’enregistrement et la modélisation de l’infarctus pour la recherche bioélectronique.

Résumé

Les études électrophysiologiques sont essentielles pour explorer les interactions entre les matériaux et les biointerfaces cardiaques. Les progrès récents ont introduit divers nouveaux matériaux conducteurs et semi-conducteurs pour les interfaces bidirectionnelles avec des modèles cardiaques, facilitant la stimulation de faible intensité parallèlement à des enregistrements spatio-temporels élevés et à un rapport signal/bruit (SNR) élevé. Le modèle de cœur de rongeur ex vivo sert de plate-forme efficace pour valider les fonctionnalités de nouveaux matériaux et dispositifs, en faisant le lien entre les résultats in vitro et les connaissances translationnelles tout en minimisant les préoccupations éthiques et administratives. Dans ce protocole, nous détaillons l’isolement et la perfusion ex vivo de cœurs de rats adultes à l’aide d’un appareil de Langendorff, en établissant une stimulation bidirectionnelle précise et un enregistrement avec des semi-conducteurs et des conducteurs haute performance, y compris du silicium nanoporeux, du carbone nanoporeux et des réseaux de microélectrodes flexibles en forme de maille. De plus, nous présentons un modèle d’infarctus du myocarde induit par une lésion d’ischémie-reperfusion (I/R), évalué par l’enregistrement et la cartographie multicanaux ainsi que par la coloration de l’infarctus, permettant des études pertinentes sur les maladies cardiaques et des explorations thérapeutiques potentielles. Cette méthodologie offre des informations précieuses sur la recherche sur l’interface matériaux-bio et le développement de la bioélectronique cardiaque de nouvelle génération.

Introduction

Le domaine de la bioélectronique cardiaque progresse rapidement, poussé par la nécessité de développer des matériaux et des dispositifs permettant des communications bidirectionnelles précises et efficaces avec le cœur 1,2,3,4. Les études électrophysiologiques jouent un rôle central dans cette entreprise, fournissant des informations essentielles sur la façon dont les matériaux interagissent avec les biointerfaces cardiaques par le biais de la modulation et de la détection. Alors que les modèles in vitro, tels que les lignées cellulaires HL-1 cultivées et les cardiomyocytes primaires de rongeurs, offrent un environnement contrôlé pour les évaluations initiales ^5,6,7,8, leur simplicité ne parvient souvent pas à reproduire les conditions complexes et dynamiques d’un cœur vivant. Ces modèles n’ont pas l’architecture 3D du cœur, cruciale pour la conduction électrique coordonnée et la génération de force mécanique, et ne peuvent pas imiter les cycles rythmiques de contraction-relaxation ou la dynamique de perfusion essentielle à l’apport d’oxygène et de nutriments⁹. À l’inverse, les modèles in vivo fournissent les informations les plus pertinentes sur le plan physiologique, mais s’accompagnent d’importants défis éthiques, administratifs et techniques, notamment la nécessité d’une formation approfondie, de configurations chirurgicales sophistiquées et du respect de cadres réglementaires stricts¹⁰.

Pour combler cette lacune, les modèles cardiaques ex vivo, tels que le cœur de rat adulte perfusé par Langendorff, offrent une alternative convaincante à la recherche scientifique^11,12. Ces modèles combinent la pertinence physiologique des systèmes in vivo avec la contrôlabilité et l’accessibilité des installations in vitro. En isolant le cœur et en le maintenant dans un état fonctionnel, l’appareil de Langendorff permet aux chercheurs de mener des études de haute fidélité sur l’électrophysiologie cardiaque dans des conditions contrôlées avec précision. L’absence de variables systémiques telles que les entrées neuronales et les hormones circulantes simplifie l’interprétation des résultats tout en préservant les aspects clés de la physiologie cardiaque. De plus, les modèles ex vivo atténuent de nombreuses préoccupations éthiques et réduisent la charge des ressources, ce qui en fait une plate-forme polyvalente et pratique pour la recherche translationnelle¹³.

En plus de son potentiel translationnel, ce protocole constitue une référence pour l’évaluation des performances des matériaux. En incorporant des stratégies matérielles représentatives, telles que des plates-formes optoélectroniques pour la photostimulation sans fil et des systèmes électroniques pour la stimulation et l’enregistrement filaires, il établit un cadre reproductible pour les études comparatives. Cette normalisation facilite non seulement l’innovation, mais améliore également la reproductibilité et la fiabilité des résultats entre les groupes de recherche. Dans le passé, de nombreuses photoélectrodes et électrodes haute performance se sont révélées très prometteuses pour les études bioélectriques, telles que PEDOT : PSS¹⁴, MXene¹⁵, oxydes d’iridium¹⁶, platine¹⁷, molybdène¹⁸, silicium 19,20,21, points quantiques 22,23,24 et semi-conducteurs organiques ²⁵. Ici, ce protocole présente des matériaux représentatifs et de pointe, notamment du silicium nanoporeux²⁶, du carbone nanoporeux²⁷ et des réseaux de multiélectrodes en or (MEA) flexibles en forme de ^{maillage28,29}, qui s’intègrent dans le protocole pour démontrer leurs capacités dans les interfaces cardiaques bidirectionnelles. Ces matériaux permettent une stimulation supraseuil de faible intensité, une résolution spatio-temporelle élevée et des enregistrements à SNR élevé, démontrant ainsi leur potentiel pour faire progresser la bioélectronique cardiaque. De plus, l’inclusion d’un modèle d’infarctus du myocarde induit par une lésion I/R fournit un cadre solide pour les études pertinentes sur la maladie et les explorations thérapeutiques.

Ce travail présente des méthodes détaillées de fabrication et d’application de matériaux avancés pour la photostimulation sans plomb et la stimulation électrique et la détection avec des cœurs de rats ex vivo (Figure 1A). Des membranes de silicium nanoporeuses ont été fabriquées par photolithographie, gravure ionique réactive (RIE) et libération d’acide fluorhydrique tamponné (HF) à partir de plaquettes de silicium sur isolant (SOI) avec une couche de dispositif de 5 μm, suivie d’une gravure par coloration et d’un transfert sur des membranes souples de polydiméthylsiloxane (PDMS)²⁶. Pour la stimulation électrique et l’enregistrement, le carbone nanoporeux a été développé par ablation laser de substrats de cellulose incubés au sel, suivie d’un transfert en phase aqueuse et d’une stratification thermique, offrant des capacités de stockage et d’injection de charge améliorées par rapport aux électrodes d’or traditionnelles²⁷. De plus, des MEA flexibles ont été fabriqués sur des plaquettes de Si recouvertes de polyimide à l’aide de la photolithographie, de la métallisation par faisceau d’électrons, de la gravure, de l’encapsulation et des procédés de libération pour permettre l’enregistrement et la cartographie épicardiques résolus dans l’espace^28,29.

Au-delà de la fabrication, le protocole fournit un protocole étape par étape pour l’isolement, la perfusion, la surveillance et l’interfaçage du cœur du rat adulte. Les appareils ont été testés sur des cœurs isolés, démontrant des résultats représentatifs en matière de stimulation et d’enregistrement pour l’évaluation électrophysiologique. Ce protocole introduit également une méthode de création d’un modèle d’infarctus du myocarde par I/R, validé par des enregistrements physiologiques, des colorations et des évaluations morphologiques. Cette méthodologie complète établit un cadre reproductible pour l’évaluation des matériaux et des dispositifs dans les biointerfaces cardiaques. La figure 1B-D décrit les flux de travail de fabrication des matériaux pour l’évaluation dans ce modèle cardiaque ex vivo. La figure 2A-C illustre les résultats attendus en images des dispositifs tels que fabriqués.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Chicago (numéro de protocole 72378).

1. Fabrication de membranes de silicium nanoporeuses (Figure 1B, Figure 2A, Figure 3)

1. Concevez le motif de photomasque dans le logiciel AutoCAD (Figure 3). Assurez-vous que la taille de l’appareil correspond à l’échelle de longueur de la cible biologique. Pour le cœur de rat, utilisez une taille d’appareil de 2 à 10 mm. Dans la conception, ajoutez de petits réseaux de trous de 20 à 100 μm de diamètre pour faciliter la libération de la couche de dispositif Si dans le HF tamponné. Faites les trois grands trous de 200 à 1000 μm de diamètre, en formant une lettre L chirale pour aider à identifier le bon côté de la membrane.
2. Nettoyez la plaquette SOI avec de l’acétone et de l’alcool isopropylique (IPA) pendant 3 minutes chacune dans le bain à ultrasons. Effectuez la cuisson de déshydratation à 200 °C pendant 20 min sur la plaque chauffante.
3. Étalage par centrifugation de la résine positive épaisse AZ40XT-11D à 3000 tr/min pendant 45 s, cuisson à 115 °C pendant 3 min. Attention à ne pas verser trop de résine photosensible sur la plaquette. Après l’enrobage par centrifugation, nettoyez les résidus à l’arrière de la plaquette à l’aide d’écouvillons d’acétone.
   REMARQUE : AZ40XT-11D est une résine photosensible positive très visqueuse.
4. Utilisez l’enregistreur direct Heidelberg MLA150 pour exposer le motif de résine photosensible à 375 nm et une dose de 800 mJ/cm². Effectuez la cuisson post-exposition à 110 °C pendant 2 min.
5. Développez le motif dans le développeur AZ 300MIF pendant 2 min. Rincez la plaquette avec de l’eau déminéralisée (DI) pendant 60 s, puis séchez-la avec de l’air N₂ .
6. Gravez le SOI découvert à l’aide d’un procédé RIE SF₆/CHF₃ (20 sccm :50 sccm) pendant 12 min à l’aide d’un plasma à couplage inductif à 600 W et d’une radiofréquence de 60 W dans un graveur de fluorure à plasma à couplage inductif avec une pression de chambre de 10 mT, ce qui permet d’obtenir une vitesse de gravure d’environ 660 nm/min.
7. Décaper la résine photosensible à l’aide de l’AZ NMP dans un bain à ultrasons à 80 °C pendant 10 min et nettoyer la plaquette dans un bain à ultrasons pendant 3 min dans de l’acétone, puis 3 min dans de l’IPA, et séchée avec de l’azote compressé.
8. Immergez l’échantillon dans du HF tamponné à température ambiante pour éliminer les couches d’oxyde enfouies. L’appareil se libère en 4 à 8 heures. Augmentez légèrement la température de la solution (40 °C) pour faciliter la libération.
9. Transférez avec précaution les membranes libérées avec du papier filtre de 1 cm x 1 cm dans deux bains-marie DI séparés de manière séquentielle pour éliminer tout HF résiduel.
   REMARQUE : L’expérience peut être interrompue ici. Faites tremper la membrane dans un bain d’alcool isopropylique pour la conserver à 4 °C.
10. Transférez la membrane à l’aide de papier filtre dans une boîte de Pétri avec de l’eau désionisée (DI). La membrane flottera à la surface de l’eau en raison de l’hydrophobicité et de la tension superficielle.
    REMARQUE : Les membranes en silicone peuvent passer rigoureusement de l’IPA à l’eau en raison de l’effet Marangoni³⁰.
11. Dans une boîte de Pétri séparée, préparez la solution de gravure contenant un rapport volumique de 100:1 de HF concentré et d’acide nitrique concentré (par exemple, 10 mL de HF et 0,1 mL de HNO₃). Mélangez bien avant de graver.
12. Transférez la membrane avec du papier filtre dans la solution de mordançage et dépolissez pendant 30 s. Faites attention au côté de la membrane Si en notant l’orientation de la lettre L formée par les trois trous principaux. La membrane Si doit flotter sur l’agent de gravure, où un seul côté de la membrane est gravé.
13. Transférez la membrane avec du papier filtre dans deux plats d’eau DI séparés pour éliminer les résidus HF.
    REMARQUE : L’expérience peut être interrompue ici. Transférez la membrane sur de l’IPA pour l’entreposer à 4 °C.
14. Fabriquez un substrat de support avec des PDMS minces. Mélanger la partie A (polymère de base) et la partie B (agent de durcissement) dans un rapport poids de 10:1 et dégazer pendant 30 min.
15. Couche sacrificielle de PMMA (495 A6) sur lame de verre à 2 000 tr/min pendant 45 s. Cuire au four à 180 °C pendant 60 s.
16. Sping coat PDMS à 4 500 tr/min pendant 45 s sur le verre revêtu de PMMA, ce qui devrait donner une épaisseur de 10 à 20 μm. Durcir au four à 80 °C ou sur une plaque chauffante pendant 2 h.
    REMARQUE : Pour atténuer les dommages mécaniques, le PDMS a été utilisé comme substrat souple pour accueillir les membranes de silicium nanoporeuses, offrant une protection contre les dommages potentiels causés par la manipulation directe avec une pince à épiler.
17. Transférez la membrane Si dépolie de l’IPA au PDMS. Utilisez un chiffon propre pour éliminer l’excès d’IPA, et la membrane Si se fixera fermement au PDMS après l’évaporation de l’IPA. Faites attention au côté de la membrane Si en identifiant l’orientation de la lettre L formée par les trois trous principaux. Le Si poreux gravé doit faire face à l’extérieur, et le Si non gravé doit s’interfacer avec PDMS.
18. Coupez le PDMS sur la circonférence à l’aide d’une lame de rasoir contenant la membrane Si. Laissez suffisamment d’espace et veillez à ne pas endommager la membrane Si.
19. Trempez l’appareil dans de l’acétone jusqu’à ce que le Si/PDMS soit libéré. Évitez de tremper trop longtemps, car cela pourrait provoquer un gonflement du PDMS. Rincez-le à l’eau DI et séchez-le avec du N₂. Effectuer un traitement au plasma O₂ à 400 W pendant 10 min.

2. Fabrication de réseaux de microélectrodes flexibles (Figure 1C, Figure 2B, Figure 4)

1. Concevez la structure des MEA flexibles dans AutoCAD (Figure 4). Nous présentons deux modèles différents présentant la même zone de projection d’électrode mais des structures de substrat différentes (Figure 2B, Figure 4).
2. Nettoyez le substrat de la plaquette de silicium avec de l’acétone et de l’IPA pendant 3 minutes chacun dans un bain à ultrasons.
   REMARQUE : Ce protocole ne nécessite pas de traitement de surface supplémentaire pour améliorer l’adhérence entre le polyimide (PI) et la plaquette de Si afin de faciliter la libération du dispositif. Le traitement au plasma d’oxygène peut être utilisé pour améliorer l’adhérence si nécessaire.
3. Verser 4 mL de la solution de précurseur PI de poly (dianhydride-co-4,4′-oxydianiline pyromellite) sur la plaquette. Essorage de la plaquette à 1 500 tr/min pendant 45 s. Utilisez du NMP ou de l’acétone pour retirer le précurseur à l’arrière de la plaquette.
4. Précuire à 110 °C pendant 3 min, puis à 180 °C pendant 3 min. Faites durcir la plaquette revêtue de PI dans le four de réserve avec un mode profilé. Commencez à température ambiante, chauffez jusqu’à 250 °C à la vitesse de rampe de 4 °C/min et maintenez pendant 30 min. Chauffez ensuite la plaquette à 350 °C à la vitesse de rampe de 2,5 °C/min, et maintenez-la à 350 °C pendant 60 min, puis refroidissez lentement jusqu’à RT. Le résultat est un film PI d’environ 5 μm d’épaisseur.
5. Étalage par centrifugation de la plaquette revêtue de PI avec AZ nlof 2020 à 2 000 tr/min pendant 45 s. Faites cuire la gaufrette à 110 °C pendant 2 min. Utilisez l’enregistreur direct Heidelberg MLA150 pour exposer le motif de photorésine à 375 nm et une dose de 200 mJ/cm².
6. Effectuez la cuisson post-exposition à 110 °C pendant 2 min. Développez le motif dans AZ 300MIF Developer pendant 1 min. Rincez la plaquette à l’eau DI pendant 60 s, puis séchez-la avec de l’air N₂ .
7. Déposez 10 nm de titane et 200 nm d’or à l’aide d’un évaporateur à faisceau d’électrons. Décaper la résine photosensible à l’aide de l’AZ NMP dans un bain à 80 °C pendant 3 h et nettoyer la plaquette dans un bain à ultrasons pendant 3 min dans de l’acétone, puis 3 min dans de l’IPA et séchée avec de l’azote comprimé.
8. Appliquez une couche de centrifugation sur l’épaisse résine positive AZ40XT-11D à 3 000 tr/min pendant 45 s. Nettoyez la résine photosensible à l’arrière de la plaquette à l’aide d’acétone. Faites cuire la gaufrette à 115 °C pendant 3 min.
9. Utilisez l’enregistreur direct Heidelberg MLA150 pour exposer le motif de résine photosensible à 375 nm et une dose de 800 mJ/cm². Effectuez la cuisson post-exposition à 110 °C pendant 2 min.
10. Développez le motif dans AZ 300MIF Developer pendant 3 min. Rincez la plaquette à l’eau DI pendant 60 s, puis séchez-la avec de l’air N₂ .
11. Gravez le PI découvert à l’aide d’un procédé RIE SF₆/CHF₃ (20 sccm :50 sccm) pendant 20 min avec un plasma à couplage inductif à 600 W et une radiofréquence de 60 W dans un graveur de fluorure à plasma à couplage inductif avec une pression de chambre de 10 mT.
12. Décaper la résine photosensible à l’aide d’AZ NMP dans un bain à 80 °C pendant 10 min et nettoyer la plaquette avec une sonication douce pendant 3 min dans de l’acétone, puis 3 min dans de l’IPA et séchée avec de l’azote compressé.
    REMARQUE : Utilisez des ultrasons de faible puissance pour éviter que l’appareil ne se détache. Évitez la sonication si l’IP montre des signes de détachement.
13. Passez la plaquette dans un four à hexaméthyldisilazane (HMDS) pour appliquer le traitement HMDS. Spin coat SU-8 2002 à 2 000 tr/min pendant 45 s. Il en résulte une épaisseur SU8 d’environ 2,5 μm.
14. Faites cuire la gaufrette à 95 °C pendant 20 min. Utilisez l’enregistreur direct Heidelberg MLA150 pour exposer le motif de résine photosensible à 375 nm et une dose de 950 mJ/cm².
15. Développez le motif dans le développeur SU-8 pendant 1 min. Rincez-le avec de l’eau IPA et DI, et séchez-le avec du gaz N₂ . Si des taches blanches apparaissent sur la plaquette pendant le rinçage de l’IPA, trempez la plaquette dans le révélateur SU8 jusqu’à ce que les taches blanches disparaissent.
16. Effectuez une cuisson dure à 160 °C pendant la nuit. Utilisez des temps de cuisson plus courts (~30 min) pour les expériences aiguës. Ne pas cuire en dessous de 150 °C ou au-dessus de 200 °C. Décollez le MEA flexible flexible soutenu par PI du substrat.

3. Fabrication de carbone nanoporeux (figure 1D, figure 2C, figure 5)

1. Concevez le motif du film de carbone dans le logiciel de conception (Figure 5).
   REMARQUE : Cette méthode contient le protocole de fabrication de deux types d’électrodes : l’électrode de stimulation nanoporeuse à base de carbone et l’électrode de détection.
2. Imprégner le papier filtre dans des solutions aqueuses de borate de sodium (0,15 M, pH 9,4) pendant 1 h, puis sécher à 60 °C pendant la nuit (figure 1D).
   REMARQUE : Le papier filtre Whatman de grade 1 a principalement servi de substrat poreux représentatif à base de fibres. Le borate de sodium est incorporé dans les fibres de cellulose après le processus d’imprégnation et de séchage. Le sel agit comme un catalyseur qui facilite la carbonatation photochimique sous synthèse laser²⁷.
3. Effectuez une synthèse laser à l’aide d’un laser CO₂ avec des motifs prédéfinis (Figure 5A). Effectuez des motifs en mode raster avec des paramètres optimisés : puissance = 1,8 W ; vitesse = 1,6 cm/s ; points par pouce = 1000.
4. Préparez un film en polyéthylène téréphtalate (PET) d’une épaisseur de 50 μm et nettoyez le film avec de l’acétone et de l’alcool isopropylique (IPA) pendant 3 minutes chacun dans le bain à ultrasons.
5. Déposez 5 nm de titane et 100 nm d’or à l’aide d’un évaporateur à faisceau d’électrons. Appliquer la procédure de transfert en phase aqueuse pour transférer le MEA sur le film PET (12,5 μm).
   REMARQUE : Le transfert en phase aqueuse a été effectué à l’aide de deux procédés consécutifs : la séparation en phase aqueuse et le transfert capillaire.
6. Immerger progressivement les substrats en papier dans l’eau DI pour le délaminage lors de la séparation en phase aqueuse.
   REMARQUE : L’énergie de déformation induite par le gonflement de la cellulose a facilité la séparation de la membrane de carbone du substrat de support en moins d’une seconde, la faisant flotter à la surface de l’eau.
7. Utilisez le substrat de support, par exemple un film PET, pour transférer les motifs dans l’eau pendant le transfert capillaire. Immergez le substrat dans l’eau et mettez-le en contact avec une extrémité de la membrane de carbone souhaitée pour former une ligne de contact (le front de transfert). Ensuite, tenez le substrat à la main et déplacez-vous dans une direction inclinée ou verticale à faible vitesse.
   REMARQUE : Pour les substrats de support hydrophobes, une force externe ou un traitement au plasma O₂ peut être appliqué pour aider à former la ligne de contact.
8. Après le transfert, appliquer environ 20 μL de solution polymère d’acide perfluorosulfonique (PFSA) (avec une concentration de ~5 % dans un mélange d’alcools aliphatiques inférieurs et d’eau) sur les motifs carbonés et laisser sécher dans des conditions de température ambiante (23 °C) et de pression (1 atm) pour la fixation.
9. Fixez l’électrode de stimulation nanoporeuse à base de carbone en la connectant à un fil de Cu à l’aide d’un adhésif conducteur à l’argent. Encapsulez la jonction exposée entre le fil Cu et l’électrode avec un adhésif silicone pour assurer l’isolation et la stabilité. Après un durcissement de 3 h à température ambiante, l’électrode de stimulation est prête à l’emploi. L’expérience peut être interrompue ici.
10. Concevez le motif carbone et MEA dans AutoCAD (Figure 5B). Fabriquez 4 x 4 réseaux de microélectrodes sur un film PI de 25 μm en utilisant la procédure de photolithographie standard décrite à l’étape 2.
    REMARQUE : Le film PI peut être créé à l’aide d’un précurseur PI ou en laminant un film PI commercial sur une plaquette Si à l’aide de la résine photosensible AZ2020. Le protocole pour la photolithographie et le dépôt de métal est le même que celui de l’étape 2.
11. Créez une membrane de carbone monolithique (2 cm x 2 cm) sur un substrat de papier après imprégnation au sel et écriture laser, comme aux étapes 3.1-3.3. Transférez le motif en carbone sur un film de support en PET préconçu en utilisant une méthode standard de transfert en phase aqueuse, comme aux étapes 3.6 à 3.9.
12. Appliquez une solution de polyéthylène-co-acétate de vinyle (EVA) à 10 % en poids dans de l’hexane sur le motif carbone et attendez le séchage à température ambiante (23 °C) et à pression (1 atm). Concevez et découpez au laser un gabarit en PET de 10 m d’épaisseur (avec un revêtement EVA sur la face inférieure) avec 16 trous alignés sur le motif MEA, servant de couche d’encapsulation.
13. Alignez le MEA, la couche d’encapsulation en PET et la membrane en carbone sur le support en PET. Pressez l’ensemble à l’aide d’une plastifieuse à chaud du commerce à une température de traitement de 120 °C pour le transfert et l’encapsulation.
14. Refroidissez l’électrode de détection nanoporeuse au carbone à température ambiante, retirez le résidu et rincez-la à l’éthanol et à l’eau 3 fois avant de l’utiliser.

4. Isolement, perfusion et surveillance du cœur du rat (figure 6)

1. Préparez les rats avant l’extraction du cœur (figure 6A). Ce protocole a utilisé des rats CD/SD mâles âgés de 3 à 4 mois, obtenus de Charles River.
2. Préparez la solution de Tyrode de l’acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (HEPES) en dissolvant les produits chimiques conformément au tableau 1. Ajustez le pH à 7,2-7,4 avec 2M de NaOH. Pré-oxygéner en faisant bouillonner l’oxygène gazeux pendant 0,5 à 1 h et poursuivre l’oxygénation jusqu’à la fin des expériences.
3. Placez trois tubes de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS, sans calcium, sans magnésium) sur de la glace. Préparez des instruments chirurgicaux propres (ciseaux tranchants, ciseaux pliés, deux hémostatiques, pince à épiler pointue, deux paires de petites pincettes).
   REMARQUE : La chirurgie n’est pas destinée à la survie, donc la stérilité n’est pas nécessaire.
4. Ramasser les rats mâles adultes CD/SD pesant entre 400 et 500 g dans l’animalerie. Administrer 0,5 mL d’héparine (1000 UI/kg) par voie intrapéritonéale dans le bas-ventre. Utilisez des gants épais pour tenir le rat pour le protéger.
5. Attrapez le rat par le haut de son dos, de sorte que l’abdomen soit exposé. Tenez le rat fermement, mais sans force excessive pour ne pas blesser l’animal. Injectez rapidement et avec précision la solution d’héparine. Attendre 20-30 min. Préparez l’appareil Langendorff pendant ce temps.
   REMARQUE : Le rat peut être anesthésié à l’avance pour assurer la bonne étape de préparation de l’intervention chirurgicale.
6. Avant de remplir à nouveau la solution HEPES Tyrode, lavez le sac de thérapie intraveineuse (IV) avec de l’eau et séchez-le complètement pour assurer la bonne composition finale. Remplissez le sac avec la solution pré-oxygénée HEPES Tyrode.
7. Allumez le thermostat et la circulation de l’eau dans l’appareil Langendorff à 37 °C (Figure 6A). Préparez la canule, la suture et placez la boîte de Pétri sur la compresse froide pour la section des tissus. Amorcez la canule avec du HBSS glacé avant de sectionner.
8. Préparez-vous à effectuer une thoracotomie chez le rat (Figure 6B). Anesthésier l’animal avec de l’isoflurane dans une configuration de cloche. Mettez 8 à 10 mL d’isoflurane dans un tube de 50 mL rempli d’un tampon de gaze. Enfermez l’animal avec le tube ouvert (avec de l’isoflurane) dans un récipient.
9. Observez l’évolution de l’anesthésie en testant le réflexe de pincement des orteils. Les animaux seront mis sous anesthésie et perdront connaissance dans les 2-3 minutes. Surveillez attentivement l’état du rat et transférez-le sur la planche chirurgicale immédiatement après qu’il ait perdu connaissance. Une anesthésie prolongée peut entraîner la mort du rat.
10. Transférez l’animal au conseil d’exploitation. Mettez-le sur le dos et placez 5 ml d’isoflurane dans un tube de 50 ml rempli d’un tampon de gaze sur la bouche du rat. Confirmez l’anesthésie générale en pinçant l’une des pattes. Continuer seulement si aucune réponse n’a été notée.
11. Fixez le haut et l’aval des bras à la planche chirurgicale à l’aide d’aiguilles. Faites une incision (~ 5 cm) pour ouvrir la cage thoracique du rat juste en dessous de la poitrine. Coupez soigneusement à travers le diaphragme pour exposer le cœur et les poumons.
12. Coupez les côtes des deux côtés pour ouvrir complètement la cage thoracique afin de fournir un accès complet. Fixez la cage thoracique au niveau du sternum à l’aide d’un hémostat. Tenez la veine cave par le dessous du cœur à l’aide d’un hémostat. Retirez le cœur en coupant sous l’hémostat avec des ciseaux émoussés pliés aussi près que possible du bas de la cage thoracique.
13. Transférez le cœur dans du HBSS glacé. Minimisez la durée de l’étape pour éviter une interruption prolongée de l’apport d’oxygène au cœur en contraction.
14. Préparez-vous à effectuer la perfusion et la surveillance de Langendorff. Remplissez complètement la canule et la boîte de Pétri avec du HBSS glacé. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le système.
15. Transférer le cœur dans la boîte de Pétri préremplie de HBSS pour la section. À l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux, retirez les poumons et d’autres tissus conjonctifs (figure 6C).
    REMARQUE : Une dissection émoussée est recommandée pour la procédure de sectionnement afin d’éviter tout dommage potentiel au cœur. Pour sectionner les tissus adjacents, utilisez deux ciseaux et déchirez soigneusement le tissu.
16. Localisez l’aorte en appuyant sur le cœur et en traçant le chemin du sang à sa sortie. Coupez sous la première artère ascendante et canulez l’aorte si l’arc aortique est préservé lors de l’extraction (Figure 6D). Fixez l’aorte à la canule avec un double nœud.
    REMARQUE : Évitez d’insérer la canule trop profondément pour vous assurer que la valve reste fermée. Ne positionnez pas la suture trop bas, car cela pourrait obstruer les artères coronaires.
17. Amorcez l’appareil Langendorff avec une solution de travail pré-oxygénée. Ouvrez le flux tampon et fixez la canule à l’appareil (Figure 6E). Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite. Le cœur commence à se contracter à ce stade.
    REMARQUE : Initialement, un peu de tampon peut éclabousser des ventricules, mais une fuite excessive n’est pas attendue. Ajustez la suture au besoin pour éviter les fuites de tampon. Aucune fibrillation cardiaque ne sera observée dans cette étape si la chirurgie et la préparation sont menées correctement.
18. Coupez les oreillettes. Dégonflez le ballonnet avant de l’insérer dans le ventricule gauche, puis remplissez-le d’eau à l’aide de la seringue connectée.
19. Connectez les sondes BP-100 à la ligne de perfusion et aux ballons remplis d’eau pour surveiller la perfusion et la pression ventriculaire gauche (LVP), respectivement (Figure 6F).
    REMARQUE : Les sondes BP-100 doivent être étalonnées avant d’être utilisées. Les bulles dans les ballons doivent être expulsées pour assurer une détection précise de la pression.
20. Surveillez la pression tampon du HEPES Tyrode et la base de référence du LVP. Assurez-vous que la pression du tampon est maintenue dans la plage optimale de 80 à 100 mmHg. Ajuster la LVP de référence à environ 20 mmHg en modifiant le volume d’eau injecté dans le ballonnet (figure 6F).
21. Connectez les électrodes ECG. Mettez la canule à la terre et positionnez l’électrode sur les côtés, le haut ou l’apex selon vos préférences (Figure 6F).
22. Amplifiez tous les signaux (perfusion, pression ventriculaire gauche et ECG) à l’aide d’un amplificateur IA-400D et interfacés avec un ordinateur à l’aide d’un numériseur avec le logiciel Clampex (Figure 6F).

5. Création d’un infarctus du myocarde à l’aide du procédé IR (Figure 6G, Figure 7)

1. Remplissez la chambre chauffée avec le tampon HEPES Tyrode préchauffé à 37 °C. Immergez le cœur dans le tampon à l’intérieur de la chambre chauffée et ajustez le robinet d’arrêt pour arrêter le flux tampon, induisant une ischémie globale. Ajustez la durée de l’ischémie en fonction des objectifs spécifiques de l’expérience.
2. Tournez le robinet d’arrêt pour rétablir le flux tampon dans le cœur après 30 min d’ischémie, initiant ainsi la reperfusion. Laisser la reperfusion du cœur pendant 45 minutes avant de mettre fin à l’expérience de coloration pour évaluer la taille de l’infarctus (Figure 6G).
   REMARQUE : Le temps d’ischémie ou de reperfusion est déterminé sur la base des objectifs expérimentaux.
3. Vérifiez le succès de l’induction de l’ischémie en observant la réduction de la fréquence cardiaque et les schémas ECG irréguliers (Figure 7A). Une arythmie ou une fibrillation ventriculaire sera observée.
4. Administrer lentement 10 mL de HBSS à 4 °C par l’orifice latéral du robinet d’arrêt pour arrêter le cœur. Retirez le cœur de la colonne de perfusion, coupez tout tissu auriculaire restant et placez le cœur dans une matrice de tranchage tissulaire.
5. Recouvrez la matrice d’un film transparent et congelez le cœur à -80 °C pendant environ 8 minutes ou jusqu’à ce qu’il atteigne une consistance semblable à celle d’une guimauve. Sortez la matrice de tranchage du papier du congélateur et insérez des lames de rasoir pour couper le cœur en sections de 2 mm d’épaisseur.
6. Retirez les tranches de tissu de la matrice de tranchage une par une et stockez-les à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires pour des expériences biochimiques.
7. Effectuez la coloration de l’infarctus (Figure 7B). Incuber les tranches de cœur dans 10 mL de chlorure de triphényltétrazolium (TTC) à 1 % p/v à 37 °C pendant 30 min.
8. Transférez la tranche de tissu dans du formol tamponné à 10 % et laissez-la se fixer à température ambiante pendant la nuit. Pour de meilleurs résultats, retirez le cœur du formol et imagez le tissu dans les 24 heures. Minimisez l’exposition à la lumière pendant cette étape pour éviter la dégradation de la tache.
9. Photographiez la tranche colorée et utilisez un logiciel tel qu’ImageJ pour estimer la taille de l’infarctus.

6. Établissement d’interfaces optoélectriques bidirectionnelles entre les dispositifs et le tissu cardiaque (Figure 8, Figure 9)

1. Placez la membrane optoélectronique en silicium à l’endroit souhaité pour la stimulation. La membrane de silicium s’auto-fixe à l’épicarde avec la force capillaire (Figure 8A). Si la fixation est difficile, utilisez des adhésifs pour tissus humides pour faciliter la fixation.
   REMARQUE : La réduction du taux de perfusion pourrait réduire la quantité d’eau à la surface du cœur, ce qui facilite la fixation. Une fois fixée à la surface du cœur, la membrane de silicium se fixe généralement à la position prédéterminée pendant le fonctionnement.
2. Connectez les électrodes aux systèmes RHD ou à d’autres plates-formes électrophysiologiques pour l’enregistrement des données. Les MEA sont dotés de pads d’E/S à 16 canaux avec un pas de 0,5 mm à une extrémité, qui sont connectés via un connecteur à force d’insertion nulle (ZIF) à une carte d’adaptation. La carte d’adaptation est ensuite reliée à la tête par un connecteur Omnetics.
3. Placez les MEA flexibles sur les surfaces ventriculaires du cœur de rat isolé (Figure 8A). Placez les MEA à l’intérieur de la fenêtre si vous utilisez une membrane de silicium en forme de fenêtre (Figure 8B).
4. Programmez la source laser de 635 nm avec la fréquence souhaitée (par exemple, 4 Hz) et le rapport cyclique (par exemple 0,4 %, durée d’impulsion de 1 ms) à l’aide de signaux TTL (Transistor-Transistor Logic). Focalisez le spot laser sur la membrane de silicium, avec une taille de spot d’environ 1 mm. Portez des lunettes de protection laser. Commencez par une faible intensité pour la mise au point.
5. Démarrez le protocole d’enregistrement et de stimulation. Augmentez progressivement l’intensité du laser jusqu’à ce qu’une stimulation ininterrompue soit observée (Figure 8C).
   REMARQUE : Dans les normes de ce protocole, il définit l’intensité seuil à laquelle le laser permet 10 s de stimulation ininterrompue.
6. Programmez le profil laser avec différentes durées d’impulsion pour obtenir le profil d’intensité en fonction de la durée afin d’évaluer les performances de l’appareil (Figure 8D). La configuration permet l’enregistrement multicanal de l’ECG, du TTL et du LVP (Figure 8E).
7. Modifiez l’emplacement de la membrane de silicium ou du point lumineux et répétez les étapes 6.3 à 6.6 pour étudier comment les différents emplacements de stimulation affectent les formes d’onde stimulées et la conduction cardiaque (Figure 9A).
8. Identifiez les pics QRS rythmés de chaque site d’enregistrement pour construire l’isochrone ou la carte de retard d’activation. Identifiez le pic QRS le plus précoce et définissez cet emplacement sur retard zéro pour tracer la carte de retard d’activation (Figure 9B-C).
   REMARQUE : Bien que la carte du retard d’activation dans le rythme sinusal (sans stimulation) puisse servir de référence, son modèle peut varier considérablement en fonction des conditions cardiaques et du placement de la MEA^18,30. Les résultats sont plus significatifs lorsqu’une source de stimulation claire, telle qu’une stimulation externe, est présente.

7. Établissement d’interfaces électriques bidirectionnelles entre les dispositifs et le tissu cardiaque (Figure 10)

1. Connectez les électrodes de stimulation (0,5 cm x 0,5 cm) dans une configuration à deux électrodes, en plaçant l’électrode de travail sur la paroi ventriculaire gauche tandis que la contre-électrode se trouve sur la paroi ventriculaire droite.
2. Délivrer des formes d’onde de courant carré (par exemple, 1 mA, durée d’impulsion de 1 ms) à travers un potentiostat jusqu’à ce que la stimulation réussisse (Figure 10A-B). Effectuez des tests pour obtenir les graphiques du courant de stimulation en fonction de la durée d’impulsion et de la tension de stimulation en fonction de la durée d’impulsion afin d’évaluer l’efficacité de la stimulation du matériau (Figure 10C-D).
3. Effectuez un enregistrement électrique à l’aide d’un réseau de microélectrodes 4 x 4 (espacement de 2 mm entre les électrodes) et enregistré à l’aide d’une carte d’interface USB RHD et d’un headstage d’enregistrement d’entrée RHD 16 canaux. Enregistrez les signaux à 10 kéch./s dans la bande passante 0,1-100 Hz.
4. Mesurez le bruit de chaque électrode d’enregistrement (Figure 10E). Calculez le rapport signal/bruit à l’aide de l’équation suivante (Figure 10F) :
   ou
   où Signal est l’amplitude du signal et le_bruit std est l’écart-type des niveaux de bruit. Lors de l’enregistrement, le filtre coupe-bande de 60 Hz est désactivé pour refléter les résultats bruts.
5. Effectuez des analyses supplémentaires et tracez des cartes isochrones de la propagation électrique à l’aide de Python.
6. Déterminez un horodatage de la déviation maximale (complexe QRS rythmé) pour chaque contraction et calculez la moyenne de plusieurs signaux. Utilisez l’interpolation gaussienne pour le rendu de la carte afin d’améliorer la lisibilité.

Résultats

L’électrophysiologie de stimulation d’une large gamme de matériaux optoélectroniques et électroniques peut être validée efficacement à l’aide du système cardiaque ex vivo , qui fournit une configuration pratique et contrôlée (Figure 1A). Les matériaux à injection de charge élevée tels que le silicium poreux et le carbone poreux facilitent la modulation bioélectrique avec une faible intensité optique et une stimulation à basse tension, assurant la sécurité et le fonctionnement capacitif à charge équilibrée.

Le silicium nanoporeux présente une génération de photocourant nettement plus élevée que les structures de silicium conventionnelles, telles que les jonctions p-n ou p-i-n (Figure 11A), en raison de son hétérojonction²⁰ activée par la porosité, de sa capacité de stockage de charge améliorée, de son impédance réduite et de son absorption optique améliorée. Ces photocourants principalement capacitifs permettent une stimulation biosûre et équilibrée en charge³¹ (Figure 12A-B), réalisant une stimulation optique des cœurs de rats ex vivo à 240 bpm avec une intensité lumineuse de 0,51 mW/^mm2 et une durée d’impulsion de 1 ms (Figure 8C), ou aussi faible que 0,167 mW/mm² avec une durée d’impulsion de 10 ms (Figure 11B) - valeurs comparables ou inférieures aux méthodes optogénétiques et bien inférieures aux seuils de sécurité laser^{31, 32. Planche 32}. En dessous de ces intensités, des impulsions lumineuses peuvent être partiellement ou non capturées. En revanche, d’autres matériaux, tels que les membranes de silicium p-i-n ou les membranes de silicium p-i-n décorées d’or, nécessitent des intensités optiques nettement plus élevées pour provoquer une stimulation (Figure 11B). La stimulation continue avec du silicium nanoporeux augmente la contraction mécanique, comme l’indique une LVP élevée (Figure 8E). De plus, dans sa forme monolithique, le dispositif démontre une injection de photocourant à haute résolution spatiale sous des impulsions lumineuses localisées, permettant des études de stimulation multisites et potentiellement à accès aléatoire²⁶.

Dans les études bidirectionnelles à membrane de silicium en forme de fenêtre (Figure 3D, Figure 8B), la stimulation multisite produit des profils d’enregistrement multiélectrodes et des modèles de conduction cardiaque distincts, validant l’originalité de la propagation des ondes à partir de chaque point de stimulation (Figure 9). Cette caractéristique met en évidence la capacité du système à analyser des voies de conduction cardiaque complexes avec une grande précision et la capacité de diagnostiquer des affections cardiaques anormales telles que l’infarctus du myocarde.

Les MEA fabriqués ont une épaisseur d’environ 10 μm et intègrent des structures macroporeuses ou des interconnexions serpentines pour minimiser la rigidité en flexion et améliorer la flexibilité ou l’extensibilité (Figure 4)^33,34. Les réseaux se composent de 16 sites d’enregistrement indépendants disposés dans une configuration 4 x 4, couvrant une zone de 6 mm x 6 mm. Ces réseaux permettent l’enregistrement direct du signal épicardique à plusieurs endroits à la surface du cœur. Un enregistrement représentatif à 16 canaux est illustré à la figure 13. Les cartes isochrones construites à partir des enregistrements visualisent la conduction électrique à la surface du cœur, avec ou sans stimulation localisée. La stimulation localisée induit souvent des retards de conduction qui remplacent le rythme sinusal intrinsèque et les voies de conduction du cœur ex vivo (Figure 9B).

Les matériaux en carbone nanostructuré présentent une solution efficace pour améliorer les performances des dispositifs bioélectroniques en raison de leur capacité de stockage de charge élevée et de leur faible impédance (Figure 14). Notre méthode de transfert laser assisté par le sel permet de modeler facilement et de transférer instantanément des dispositifs en carbone nanoporeux sur des substrats flexibles ou des électrodes Au traditionnelles pour améliorer les performances bioélectroniques. La caractérisation de l’impédance a également confirmé que le revêtement de carbone réduisait considérablement l’impédance de l’électrode Au d’environ 2 ordres de grandeur, passant de 7244,4 Ω à 63,1 Ω à une fréquence de 100 Hz pertinente pour les signaux ECG (figure 14A-B). La capacité de Helmholtz de l’électrode Au a considérablement augmenté après l’enrobage de carbone, passant de 0,025 mF/cm² à 1,98 mF/cm² (Figure 14C). L’augmentation de la capacité à l’aide de cette stratégie de revêtement de microcondensateur peut réduire efficacement la tension de polarisation par rapport à l’électrode Au traditionnelle (Figure 14D).

Ce protocole établit une plate-forme à base de carbone nanoporeux pour des biointerfaces efficaces vers la modulation électrique ou la détection des systèmes cardiaques (Figure 10). Pour évaluer les performances de l’électronique du carbone nanoporeux pour la stimulation cardiaque, l’électrode Au ou Au-C a été placée sur la paroi ventriculaire gauche (VG) pour l’injection de charge aux formes d’onde de courant carré biphasique³⁵ (Figure 10A). Lors d’une stimulation à 4 Hz (1 mA), les électrodes Au et Au-C ont atteint une stimulation d’overdrive efficace (Figure 10B). Cependant, une amplitude ECG nettement plus élevée, indicatrice de la force de contraction, a été observée dans le groupe Au-C. Les deux électrodes ont démontré une diminution exponentielle du courant de seuil pour la stimulation avec durée d’impulsion. Les seuils de stimulation, qui indiquent les tensions les plus basses pour une modulation de fréquence efficace, ont également été mesurés sur diverses largeurs d’impulsion (figure 10C-D). La courbe résistance-durée a été modélisée à l’aide de l’équation :

où I(t) fait référence au courant de stimulus à la durée d’impulsion (t), I_rheobase est le courant de seuil à une durée d’impulsion infiniment longue (rheobase), et τ est la constante de temps membranaire³⁶. Le calcul utilise la charge minimale nécessaire pour une stimulation réussie à la chronaxie comme . Q_min. Les valeurs ont été déterminées à 0,79 et 0,71 μC pour les électrodes Au et Au-C, respectivement (figure 10C). À un courant de stimulation de 4 mA/cm², des tensions seuils pour une stimulation efficace ont été observées à 1,32 V et 0,90 V pour les électrodes Au et Au-C, respectivement (Figure 10D). La réduction de 30,3 % de la tension de seuil suggère une diminution potentielle du stress oxydatif lors d’une stimulation prolongée³¹, facilitant ainsi des applications bioélectroniques plus sûres avec des lésions tissulaires minimales. De plus, une électrode Au à 16 canaux greffée au carbone a été développée pour améliorer la détection du signal ECG épicardique (Figure 10E-F). Le transfert de carbone nanostructuré a considérablement amélioré le rapport signal/bruit de 8,0 fois par rapport aux électrodes Au traditionnelles, démontrant l’efficacité des revêtements nanoporeux à base de carbone pour la bioélectronique haute fidélité.

L’induction réussie de modèles d’infarctus I/R a été validée soit sur place pendant l’expérience, soit après l’expérience par la surveillance des signaux physiologiques ou la coloration TTC, respectivement. Après le tranchage et la coloration, le cœur infarctus présentera une région de couleur blanche, représentant des lésions myocardiques et correspondant à la taille de l’infarctus (Figure 7B). En revanche, un cœur sain manquera de régions blanches après la coloration. Lors de la surveillance en temps réel, un modèle d’ischémie réussi affichera une fréquence cardiaque considérablement réduite, évidente dans les lectures LVP et ECG. De plus, la cartographie MEA du cœur ischémique révélera une diminution de la vitesse de conduction électrique à travers l’épicarde, entraînant une augmentation du temps de retard³⁷ (Figure 7A).

Figure 1 : Illustration schématique du protocole et du flux de travail de fabrication. (A) Illustration schématique de la configuration ex vivo du cœur de rat et de l’interfaçage du dispositif. (B) Processus de fabrication d’une membrane de silicium poreuse (étape 1). La fabrication de la membrane poreuse Si commence par une plaquette SOI, où une couche de résine photosensible est modelée par photolithographie pour définir des caractéristiques hexagonales. L’ERE élimine sélectivement le silicium exposé, suivi d’un processus de décollage dans du HF tamponné pour libérer les membranes Si. La membrane subit une coloration gravée dans une solution à base de HF, générant une structure nanoporeuse en Si. La membrane Si poreuse résultante est soigneusement détachée et transférée sur un substrat PDMS pour un support mécanique. Enfin, le traitement au plasma modifie les propriétés de surface pour des photocourants améliorés. (C) Procédé de fabrication de réseaux multiélectrodes macroporeux flexibles (étape 2). La fabrication de MEA flexibles commence par un revêtement PI sur une plaquette de silicium pour servir de couche de substrat flexible. Le photopatterning est effectué à l’aide de la résine photosensible AZ 2020 pour définir les zones d’électrodes. Le dépôt de métal (Au/Ti) est effectué par évaporation par faisceau d’électrons pour créer des traces conductrices, suivi d’une autre étape de photopatterning à l’aide de l’AZ 40XT-11D pour protéger les régions sélectionnées des RIE afin de former un substrat macroporeux. Une étape de photopatterning SU-8 et de cuisson dure ajoute l’encapsulation avant que le processus final de décollage ne libère le MEA flexible de la plaquette Si. (D) Flux de travail de structuration et de transfert de membrane de carbone (étape 3), englobant le traitement des fibres par imprégnation de sel, la microfabrication par synthèse laser et le transfert de motifs assisté par l’eau d’un substrat de papier vers d’autres supports. La figure 1D a été modifiée au lieu de²⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images optiques et MEB des dispositifs tels que fabriqués. (A) MEB en coupe transversale (en haut) et image microscopique optique (en bas) de Si nanoporeux. (B) Images optiques de réseaux de multiélectrodes macroporeux avec des conceptions creuses (en haut) et serpentines (en bas). (C) Image microscopique optique en coupe transversale (en haut) et photo (en bas) de substrats carbonisés. La figure 2A a été modifiée par rapport à^{la figure 26}. La figure 2C a été modifiée au lieu de²⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Conceptions CAO du dispositif à membrane Si. La figure détaille les paramètres pour (A) les dispositifs à membrane de silicium (A) petits, (B) moyens, (C) grands et (D) en forme de fenêtre ouverte. Unité : mm. Ce chiffre a été modifié par rapport à²⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Conception CAO des AEM macroporeux. (A) Les dessins de conception et les annotations pour le MEA de forme creuse. (B) Les dessins de conception et les annotations de l’AEM en forme de serpentin. Unité : mm. La figure 4A a été modifiée au lieu de²⁶. La figure 4B a été modifiée au lieu de²⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Schémas et conceptions des réseaux d’électrodes à base de carbone pour l’interfaçage cardiaque. (A) Conception des interfaces des électrodes de stimulation (étape 3). Lors d’une stimulation typique, les électrodes de stimulation ont été connectées dans une configuration à deux électrodes. L’électrode de travail (motif de carbone nanoporeux serpentin) a été placée sur la paroi ventriculaire gauche, tandis que la contre-électrode a été placée sur la paroi ventriculaire droite et connectée au sol. Les formes d’onde de courant carré étaient délivrées par un potentiostat. (B) Les MEA à 16 canaux pour le masquage et le transfert d’électrodes de carbone (étape 3). La couche 1 indique le motif Au d’un MEA à 16 canaux sur un substrat PI. La couche 2 indique le film d’encapsulation PET. Ce chiffre a été modifié au lieu de²⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Représentation schématique et photographique de l’installation ex vivo et du processus expérimental. (A) Appareils et outils utilisés pour la configuration ex vivo, y compris les flacons coniques, les instruments chirurgicaux, les systèmes de perfusion et les systèmes de contrôle de la température (étape 4). (B) Processus d’extraction du cœur de rat : anesthésier l’animal avec de l’isoflurane ; Sécurisez les bras du rat ; ouvrir la cage thoracique du rat ; Récoltez le cœur de rat. (C) Retrait du tissu adipeux environnant du cœur extrait pour le préparer au montage expérimental. (D) Fixation du cœur extrait au système de perfusion ex vivo. (E) Configuration de perfusion montrant le cœur connecté au système pour simuler des conditions physiologiques. (F) Configuration de l’enregistrement ECG cardiaque. (G) Les processus d’ischémie-reperfusion (I/R) sont démontrés par la configuration (étape 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Comparaison entre un cœur isolé sain et un cœur I/R. (A) Des retards de propagation de la LVP, de l’ECG et de l’ECG ont été enregistrés chez des cœurs sains fictifs et des cœurs d’ischémie/reperfusion (I/R). (B) Photographies représentatives de coupes de cœur sain et de cœurs I/R colorés au chlorure de triphényltétrazolium (TTC). La zone blanche indique la taille de la zone infarctus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Stimulation optoélectronique bidirectionnelle et enregistrement électrique d’un cœur de rat ex vivo à l’aide d’une membrane de silicium poreuse et de MEA flexibles. (A) Photographie montrant la fixation de la membrane de silicium et le placement de MEA en forme de serpentine à côté de la membrane de silicium sur le cœur. (B) Photographie montrant la fixation d’une membrane de silicium en forme de fenêtre ouverte et de MEA de forme creuse installés dans la fenêtre Si. (C) stimulation optique sur le cœur de rat ex vivo montrant la non-capture, la capture partielle et la capture complète à trois intensités différentes à 240 bpm et une durée d’impulsion de 1 ms. (D) Graphique de l’intensité en fonction de la durée pour évaluer le seuil de stimulation de l’appareil. (E) Profils de stimulation optiques d’une intensité inférieure à 0,24 mW/mm² et durée d’impulsion de 10 ms. Les figures 8B-D ont été modifiées au lieu de²⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Stimulation et cartographie multisites dans des interfaces bidirectionnelles. (A) Positions des sites de stimulation et d’enregistrement. (B) La carte isochrone montre le retard d’activation du signal électrique après photostimulation de huit endroits différents sur un dispositif Si monolithique structuré en fenêtre ouverte. (C) Le contrôle exemplaire et les tracés ECG à 16 canaux cadencés à différents endroits de stimulation. En stimulant divers endroits, l’activation spatiale a induit des retards temporels dans l’évolution du QRS détectés dans les tissus de différents sites d’enregistrement. Ceux-ci peuvent être représentés sous la forme d’une carte de retard d’activation, permettant d’examiner les voies de conduction à la surface du cœur. Ce chiffre a été modifié par rapport à²⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 10. Bioélectronique nanoporeuse à base de carbone pour la stimulation et l’enregistrement cardiaques. (A) Image optique d’une électrode Au (Au-C) greffée à membrane de carbone poreuse pour la stimulation cardiaque. L’image en médaillon montre la vue agrandie d’un microcondensateur à structure serpentine sur l’électrode Au. (B) Réponse ECG d’un cœur de rat isolé à une stimulation biphasique de forme d’onde à courant carré à une fréquence de 4 Hz. Sous la même densité de courant de 4,0 mA/cm², le cœur a montré des réponses ECG différentes sous stimulation à partir d’électrodes Au ou Au-C. (C) Les courbes durée-intensité des électrodes de stimulation Au et Au-C et leur ajustement de courbe sont présents à une fréquence de stimulation de 4 Hz. (D) La tension de seuil appliquée aux électrodes pour une stimulation efficace à différentes durées pour les électrodes Au et Au-C. (E) Courbes de référence des signaux ECG enregistrés avec l’électrode Au et l’électrode Au-C. (F) Le rapport signal/bruit (S/B) est calculé à partir des courbes ECG enregistrées. Les figures en médaillon montrent les images optiques du réseau d’électrodes Au et Au-C utilisé pour l’enregistrement ECG (taille de l’électrode : 1 mm ; étape 7.5). Ce chiffre a été modifié au lieu de²⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Comparaison des photocourants pour différents dispositifs Si et évaluation du seuil de stimulation. (A) Comparaison des amplitudes de photocourant entre quatre dispositifs à base de Si. Les traces bleues représentent les photocourants moyens de N = 8 appareils indépendants, et les traces grises superposées illustrent les mesures individuelles des appareils. Le graphique à barres ci-joint montre les valeurs de photocourant de crête (en bleu) et les injections de charge intégrées (en orange). Les graphiques à barres sont exprimés en moyenne ± écart-type. Barre d’échelle, 10 ms. (B) La stimulation cardiaque ex vivo a été réalisée à l’aide des trois appareils différents. La stimulation a été effectuée avec une fréquence de 240 b.p.m. et une largeur d’impulsion de 10 ms. Ce chiffre a été modifié par rapport à²⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12 : Caractérisation de l’équilibre de charge par intégration de la charge injectée et renvoyée. (A) Illustration du processus de charge et de décharge dans la trace de photocourant caractéristique. (B) Calcul du total des charges impliquées dans l’injection et le retour de charge. Les résultats ont montré dans l’ensemble un bon équilibre de charge sous différentes durées de stimulation. Ce chiffre a été modifié par rapport à²⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 13 : Les signaux électriques représentatifs collectés par chaque électrode dans le MEA à 16 canaux. Les signaux électriques dans 16 canaux (Ch) montrent les informations de l’électrocardiogramme (ECG) du cœur battant ex vivo. Le chiffre a été modifié au lieu de²⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 14. Propriétés électrochimiques de la bioélectronique nanoporeuse à base de carbone. (A) L’interface électrochimique entre les tissus excitables et les interfaces carbonées à motifs. (B) Spectres d’impédance et de phase des électrodes Au et Au-C avec des courbes ajustées selon le circuit affiché en A. (C) Mesure CV de motifs Au et C de même géométrie, avec une plage de tension de -0,2 à 0,4 V par rapport à une électrode standard Ag/AgCl. (D) Changements de tension des électrodes Au et Au-C au cours d’un cycle de stimulation galvanostatique biphasique. Ce chiffre a été modifié au lieu de²⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composé	Variété recommandée	Conc. [mM]	MW	Pour 1 L	Par 2 L
NaCl	Sigma (S9625)	126	58.4	7.36	14.7
Kcl	Sigma (P4504)	5.4	74.6	0.4	0.8
Glucose	Sigma (G7021)	10	180	1.8	3.6
HEPES	Sigma (H4034)	10	238	2.383	4.766
MgCl2.7H2O	Sigma (M9272)	1	203	1 mL	2 mL
				Crosse 1 M	Crosse 1 M
CaCl2.2H2O	Sigma (C3881)	2	147	1 mL	2 mL
				Crosse 2 M	Crosse 2 M
NaH2PO4	Sigma (S0751)	0.39	120	1 mL	2 mL
				Crosse 0,39 M	Crosse 0,39 M

Tableau 1 : Composants de la solution HEPES Tyrode.

Discussion

Ce protocole a introduit la plate-forme cardiaque ex vivo chez le rat (Figure 1A) et le modèle I/R pour offrir des études électrophysiologiques rapides et pratiques au niveau des organes afin d’accompagner les efforts de recherche et les demandes en croissance rapide en bioélectronique³⁸. Il détaille la fabrication et la validation de trois systèmes de dispositifs, à savoir le silicium nanoporeux, les réseaux multiélectrodes flexibles et le carbone nanoporeux (figures 1B-D), comme référence pour les interrogations électrophysiologiques bidirectionnelles. Le silicium nanoporeux permet une stimulation spatio-temporelle de faible intensité, capacitive et élevée, les réseaux multiélectrodes flexibles permettent l’enregistrement multicanal et la cartographie des activités épicardiques, et le carbone nanoporeux permet une stimulation à basse tension et un enregistrement SNR élevé lorsqu’il est combiné avec des MEA²⁷.

La stimulation optique a déjà été démontrée à l’aide de l’optogénétique, une méthode qui nécessite une modification génétique pour exprimer des canaux ioniques sensibles à la lumière dans les tissus cibles³³. Bien qu’efficace, l’optogénétique introduit une complexité importante en raison de la nécessité de vecteurs viraux ou d’approches transgéniques, ce qui soulève des préoccupations en matière de sécurité, d’éthique et de réglementation, en particulier pour les applications cliniques. En revanche, la biostimulation non génétique à base de semi-conducteurs offre une alternative plus simple et plus viable sur le plan translationnel 39,40,40,42. Des matériaux comme le silicium et d’autres semi-conducteurs organiques permettent une modulation optoélectronique directe des tissus sans altération génétique, en exploitant les photocourants capacitifs pour une stimulation biosûre et équilibrée. Cette approche permet d’obtenir des performances comparables, voire supérieures, à celles de l’optogénétique en termes d’intensité de stimulation, fonctionnant bien en dessous des seuils de sécurité laser pour minimiser les lésions tissulaires^31,32 (Figure 8). La nature non génétique de la biostimulation à base de semi-conducteurs élimine les obstacles associés à la modification génétique, ouvrant la voie à une adoption plus large dans les milieux cliniques et à diverses applications en ingénierie tissulaire et en médecine bioélectronique. Cependant, les dispositifs doivent être soigneusement conçus pour s’intégrer au tissu, où la biocompatibilité doit être soigneusement prise en compte, ainsi que le lieu d’interface pour une stimulation et un enregistrement efficaces (Figure 8A-B). De plus, la présence de matière à la surface du tissu peut entraver la possibilité d’imagerie en temps réel, à moins qu’un dispositif ne puisse être conçu pour être transparent à la fenêtre d’excitation-émission de certains agents d’imagerie.

Le silicium nanoporeux se distingue des photostimulateurs à semi-conducteurs car il ne nécessite pas d’électrode de retour artificielle, contrairement aux matériaux précédemment signalés²⁶. Cette propriété unique provient de sa capacité à former des régions de cathode et d’anode résolues dans l’espace en fonction de la taille et de l’emplacement du point lumineux. La surface éclairée sert de site d’injection cathodique, tandis que les régions périphériques environnantes facilitent le retour du courant anodique. Ce mécanisme permet une stimulation multisite sur des membranes monolithiques sans pixels, permettant une stimulation précise et localisée. Notamment, la stimulation lumineuse localisée, plutôt que l’éclairage global, est essentielle pour créer des profils de stimulation bipolaire efficaces. De plus, la taille de l’appareil a un impact significatif sur les performances ; Les appareils plus grands génèrent des courants plus élevés dans les mêmes conditions de stimulation, ce qui améliore encore leur polyvalence fonctionnelle.

L’échec de la stimulation optique peut résulter de divers facteurs, même dans des modèles biologiques sains, principalement liés à l’intégrité du dispositif et au couplage de la biointerface. Tout d’abord, une caractérisation approfondie du photocourant est essentielle avant la stimulation cardiaque. Des photocourants plus faibles que prévu peuvent résulter de la dégradation du matériau, de la passivation de l’oxyde⁴³ après un stockage prolongé, d’un décapage excessif pendant le processus de gravure par coloration, de fractures du dispositif lors de la manipulation ou du transfert, ou d’une orientation incorrecte du dispositif lors de l’entoilage. Pour atténuer les dommages mécaniques, le PDMS a été utilisé comme substrat souple pour accueillir les membranes de silicium nanoporeuses, offrant une protection contre les dommages potentiels causés par la manipulation directe avec une pince à épiler. Deuxièmement, il est essentiel d’établir une interface transparente avec l’épicarde, qui est perfusé avec des biofluides dans cette configuration. Une épaisse couche de biofluide peut entraver une bonne fixation et compromettre l’efficacité de la stimulation. Pour améliorer le couplage de biointerface, des bioadhésifs^42,43 ou des sutures peuvent être utilisés pour stabiliser la connexion et assurer une stimulation fiable. Notamment, le silicium nanoporeux utilisé dans notre étude est biodégradable, soutenant des applications de stimulation temporaires, mais dégradant ses performances en 1 à 2 jours dans des conditions physiologiques. Pour une stabilité à plus long terme, il faut envisager une passivation de surface⁴⁴ ou l’utilisation de matériaux semi-conducteurs plus durables.

Au cours de la stimulation ex vivo, l’augmentation progressive de la LVP (figure 8E) à des fréquences plus élevées (par exemple, 4 Hz) résulte probablement d’une contractilité myocardique accrue, d’une accumulation de calcium et du mécanisme de Frank-Starling⁴⁵. Des taux de stimulation élevés améliorent le cycle intracellulaire du calcium et la dynamique de remplissage ventriculaire, augmentant la force de précharge et de contraction⁴⁶. Bien que cela puisse augmenter la demande en oxygène du myocarde et le risque d’arythmie, ces effets peuvent être atténués par une pré-oxygénation suffisante, une surveillance ECG étroite et des paramètres de stimulation contrôlés. Dans nos expériences, aucun effet indésirable significatif n’a été observé.

Dans l’enregistrement multiélectrode, il est crucial de spécifier l’emplacement des électrodes sur le cœur et leurs positions relatives par rapport à l’électrode de stimulation pour une analyse significative. Il est essentiel d’éliminer la diaphonie entre les électrodes pour assurer la capture de formes d’onde distinctes et de motifs résolus dans le temps. Les réseaux d’électrodes flexibles établissent généralement une bonne interface avec l’épicarde ; Cependant, l’adhérence peut être encore améliorée à l’aide de revêtements adhésifs ioniquement conducteurs, tels que de fines couches d’hydrogel^28,43 pour améliorer la stabilité et la qualité du signal.

Les matériaux nanostructurés graphène/carbone, avec de grandes surfaces pour le stockage et l’injection de charge, peuvent améliorer les performances des dispositifs bioélectroniques en réduisant l’impédance aux jonctions électrodes-salines et en augmentant les capacités d’injection de charge³⁵. Les méthodes actuelles de structuration des matériaux en graphène sur des électrodes flexibles (par exemple, Au) comprennent l’électrodéposition, le revêtement par centrifugation et la sérigraphie⁴⁷. Cependant, ces méthodes sont généralement associées à des processus de fabrication complexes, à des capacités de structuration limitées et à des performances réduites en raison du volume mort des liants. Une méthode de synthèse laser a été utilisée pour générer des motifs de carbone nanostructurés sur un substrat de cellulose, puis les transférer sur d’autres films souples afin de créer une biointerface conforme, ce qui constitue un moyen facile et efficace de fabriquer de la bioélectronique. La combinaison de revêtements de carbone à motifs avec de petites tailles géométriques jusqu’au niveau de la cellule unique, qui augmenteraient le champ électrique localisé, et de structures hautement poreuses de la membrane de carbone pour diminuer la résistance à l’interface électrode-tissu, permettra d’obtenir en synergie une stimulation biologique et un enregistrement efficaces à^l’avenir.

Bien qu’il s’agisse d’un modèle de maladie pratique, le modèle ex vivo I/R de Langendorff manque d’interactions systémiques, isolant le cœur des réponses neurohormonales et immunitaires, et repose sur une perfusion artificielle avec des tampons, qui peuvent modifier des conditions physiologiques telles que l’apport d’oxygène et la fonction endothéliale. Sa viabilité limitée limite les études aux événements aigus. Néanmoins, le modèle offre un environnement hautement contrôlé avec des réglages précis des paramètres et une bonne reproductibilité. Il permet également de mesurer la fonction cardiaque en temps réel, ce qui en fait un outil précieux pour explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les cardiopathies ischémiques. Par exemple, on pourrait envisager des dispositifs électroceutiques pour préconditionner le cœur, l’entraîner à supporter des environnements sévères d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), ou pour atténuer les niveaux de ROS afin d’améliorer la récupération. L’efficacité de ces traitements pourrait être évaluée à l’aide de paramètres tels que les battements cardiaques, les formes d’onde ECG et la vitesse de conduction. De plus, une plateforme de stimulation multisite pourrait fournir des informations spatiales sur l’infarctus du myocarde, permettant une évaluation plus détaillée des régions touchées. Cette approche pourrait également mettre en évidence des seuils de stimulation améliorés, corrélés à la gravité de l’infarctus, offrant un cadre complet d’évaluation et d’optimisation thérapeutique.

Bien que le protocole ait mis en évidence l’utilisation des trois dispositifs dans des modèles cardiaques bidirectionnels ex vivo , leur applicabilité s’étend bien au-delà des tissus cardiaques. Ces dispositifs peuvent être facilement adaptés pour être utilisés avec d’autres tissus ou organes électriquement excitables, tels que les tissus neuraux, les muscles squelettiques et les systèmes gastro-intestinaux, où une modulation électrique précise est essentielle, ce qui en fait des outils polyvalents pour la recherche et les applications translationnelles en médecine bioélectronique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
16 canaux Headstage	Intan Technologies	Réf. C3334
Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium	Sigma Aldrich	T8877-5G	chlorure de triphényltétrazolium
2-Propanol (IPA)	Fischer Scientific	Réf. A451-4
Laser 635 nm, 500 mW	Lueur laser	NA
Acétone	Fischer Scientific	Réf. A18-4
Évaporateur à faisceau d’électrons Angstrom Evovac	Angström	NA
AZ 300MIF Développeur	Microchimiques	18441123163	Promoteur
AZ nlof 2020	Microchimiques	Référence 1A002020
AZ NMP	Microchimiques	NA	Dissolvant de résine photosensible
AZ40XT-11D	Microchimiques	1000300	Photorésine
HF tamponné	Thermo Scientific	AA44627K2
CaCl2.2H2O	Sigma Aldrich	(C3881)
Laser CO2	Systèmes laser universels	VLS 4.60
Peinture argentée conductrice	PELCO	16062	Adhérence conductrice entre l’électrode et le fil de connexion Cu
Fil de cuivre encapsulé 0,1 mm	Amazone	https://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/ B09TNM51S5/ref=asc_df_B09 TNM51S5 ?mcid=155de761ea4 c389ea86d45ba61a83e8d& Tag =hyprod-20& linkCode=df0& hvadid =693675076770& hvpos=& hvnetw =g& hvrand=664358781094905 4431& hvpone=& hvptwo=& hvqmt =& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9021716& hvtargid= PLA-1878323158943& PSC=1
Numériseur Digidata 1550	Dispositifs moléculaires	NA
Glucose	Sigma Aldrich	Réf. G7021
HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol	Thermo Scientific	14175095
Heidelberg MLA150 rédacteur direct	Heidelberg	NA
héparine (1000 UI/kg)	Sagent Pharmaceuticals	1009655
HEPES	Sigma Aldrich	(N° H4034)
Hexane	Sigma Aldrich	Référence 52750-10ML	Solvant
HF	Fisher Scientific	N° A513-500	Nuance Tracemetal
Four HMDS Vapor Prime	Systèmes d’ingénierie du rendement	NA
HNO3	Fisher Scientific	A509P500	Nuance Tracemetal
Plastifieuse à chaud	Dépôt de bureaux	L410-A	Encapsulation multicouche
Systèmes Intan RHD	Intan Technologies	Réf. C3100
iWorx ECG	iWorx	IA-400D
Sonde iWorx LVD	iWorx	BP-100
Préamplificateur iWorx	iWorx	C-ISO-256
Kcl	Sigma Aldrich	(Réf. P4504)
Ballon en latex (taille 4)	Radnoti	170404
MgCl2.7H2O	Sigma Aldrich	(M9272)
NaCl	Sigma Aldrich	(S9625)
Solution contenant du nafion 117	Sigma Aldrich	31175-20-9	Réactif de fixation pour motif de carbone nanoporeux
NaH2PO4	Sigma Aldrich	(S0751)
NaOH	Sigma Aldrich	221465
PDMS	Fisher Scientific	NC9285739
Graveur de fluorure à plasma à couplage inductif Plasma-Therm	Plasma-Therm	NA
PMMA (495 A6)	Microchimiques	M130006
poly (dionhydride-co-4,4'-oxydianiline pyromellite)	Sigma Aldrich	575801	Précurseur de l’IP
Poly(éthylène-co-acétate de vinyle)	Sigma Aldrich	Réf. 437247-250G	Polymère pour l’infiltration
Poly(alcool vinylique)	Sigma Aldrich	Référence 341584-25G
Polyéthylène téréphtalate (PET)	Amazone	KS-6304-21-11	Feuille PET transparente de type D .0005 » Epaisseur x 27 » Largeur x 10 Ft Longueur 1 pièce
Potentiostat	Biologique	SP-200	Stimulation électrique
Résister au four	Expédier	LCC1-15-5
Microscopie électronique à balayage	Carl Zeiss	Faucon émerillon	Instrument de caractérisation morphologique
Plaquette de silicium	Matériaux électroniques NOVA	HS39626
Adhésif silicone	WPI	KWIK-SIL-S	Encapsulation
Sodium Borate	Sigma Aldrich	SX0355
Plaquette SOI	Ultrasil	3-10541	Type-Orient :P/B(100) DT :7+/-1um DR :<. 005 ohmcm HT :300+/-10um HR :1-30 ohmcm Boîte :1um+/-5 % UD-13998/UH-13962
SU-8 2002	Microchimiques	Série SU-8 2000
Développeur SU-8	Microchimiques	Série SU-8 2000
Adhésif pour tissus humides	3M	1469SB
Papier filtre qualitatif Whatman, Grade 1	Sigma Aldrich	WHA1001150	Substrat pour motif de carbone