Article de méthode

Isolement et évaluation par cytométrie en flux des interactions neuro-immunes dans un modèle murin de mini-AVC

DOI :

10.3791/68308

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20 juin 2025

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1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer la fonction des cellules immunitaires après un AVC ischémique à l’aide de l’analyse cytométrique en flux dans un modèle de mini-AVC. Cette méthode permet un examen détaillé des interactions neuro-immunes et peut être adaptée à l’étude d’autres maladies neurodégénératives, améliorant ainsi notre compréhension des réponses immunitaires dans la pathologie de l’AVC.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’AVC est l’une des principales causes de décès et d’invalidité à long terme dans le monde, l’AVC ischémique représentant la majorité des cas. À la suite d’un AVC ischémique, les cellules immunitaires résidentes et infiltrantes s’activent, ce qui contribue à d’autres lésions neuronales. Cependant, les rôles du système immunitaire dans la pathologie de l’AVC ischémique ne sont pas entièrement compris, en grande partie en raison de la régulation complexe et dynamique des réponses immunitaires en réaction aux changements du microenvironnement au cours de la neuroinflammation. Par conséquent, il est essentiel de surveiller et d’analyser l’activation des cellules immunitaires résidentes et infiltrantes au fil du temps après un AVC ischémique. Dans cette étude, nous présentons un protocole d’évaluation de la fonction de ces cellules immunitaires après un AVC ischémique à l’aide d’une analyse cytométrique en flux dans un modèle de mini-AVC. Nous microdisséquons le tissu cérébral infarctus à des moments précis, puis nous le dissocions en une suspension unicellulaire en utilisant des méthodes mécaniques et enzymatiques. Les cellules sont passées à travers une passoire cellulaire de 70 μm et marquées avec des cocktails d’anticorps marqués par fluorescence avant d’être quantifiées par analyse cytométrique en flux. Bien que ce test ait été spécifiquement développé pour étudier les interactions neuro-immunes après un accident vasculaire cérébral ischémique, il peut également être facilement adapté pour étudier les mécanismes neuro-immuns dans d’autres maladies neurodégénératives, telles que la sclérose en plaques, la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer.

Introduction

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L’AVC est une cause prédominante de mortalité et d’invalidité à long terme dans le monde, l’AVC ischémique représentant la grande majorité des cas 1,2,3. L’objectif global de cette méthode est d’améliorer notre compréhension des interactions neuro-immunes qui se produisent à la suite d’un AVC ischémique en fournissant une approche affinée pour évaluer l’activation des cellules immunitaires résidentes et infiltrantes dans un modèle murin de mini-AVC 4,5. L’interaction complexe entre ces cellules immunitaires et le microenvironnement neuronal est cruciale pour comprendre la physiopathologie de l’AVC ischémique. Cependant, les mécanismes précis sous-jacents à ces interactions neuro-immunes restent peu élucidés, principalement en raison de la nature dynamique et multidimensionnelle des réponses immunitaires déclenchées par la neuroinflammation6. Cette technique vise à élucider la dynamique complexe des réponses immunitaires dans le contexte de la neuroinflammation et leur impact ultérieur sur les lésions neuronales et les résultats de récupération.

La raison d’être du développement de cette technique découle du rôle essentiel que jouent les cellules immunitaires dans l’exacerbation des lésions neuronales et l’influence de la récupération après un événement ischémique. Les méthodes traditionnelles d’étude de ces interactions manquent souvent de la résolution nécessaire pour saisir les nuances temporelles et spatiales de l’activation des cellules immunitaires. En utilisant l’analyse cytométrique en flux sur des suspensions unicellulaires dérivées de tissus cérébraux infarctus microdisséqués, ce protocole offre une évaluation plus détaillée et dynamique des profils de cellules immunitaires au fil du temps 7,8. Cette approche permet d’identifier des populations spécifiques de cellules immunitaires et leurs états fonctionnels, qui sont essentiels pour comprendre la physiopathologie de l’AVC ischémique.

Par rapport à d’autres techniques telles que la coloration histologique ou le séquençage de l’ARN en vrac, qui peuvent fournir des informations limitées sur les contributions individuelles des types de cellules immunitaires, cette méthode de cytométrie en flux présente plusieurs avantages. Par exemple, des études antérieures ont montré que la cytométrie en flux permet une analyse à haut débit de plusieurs marqueurs simultanément, facilitant ainsi une caractérisation plus complète des phénotypes et des fonctions des cellules immunitaires 9,10,11,12,13. De plus, la capacité de cette méthode à s’adapter à une variété de maladies neurodégénératives - telles que la sclérose en plaques, la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer - démontre sa polyvalence et sa pertinence dans le corpus plus large de la littérature traitant des interactions neuro-immunes.

Pour les chercheurs qui envisagent l’application de cette méthode, il est essentiel d’évaluer les objectifs spécifiques de leur étude. Cette technique est particulièrement adaptée aux investigations nécessitant une analyse temporelle détaillée des réponses immunitaires dans le contexte d’un accident vasculaire cérébral ischémique ou de maladies neurodégénératives associées. Il est recommandé que les utilisateurs possèdent une compréhension de base de la cytométrie en flux et une expérience des modèles murins pour mettre en œuvre efficacement ce protocole et interpréter les données résultantes. En fournissant un cadre solide pour l’étude des interactions neuro-immunes, cette méthode contribue de manière significative aux efforts en cours pour délimiter les complexités de l’implication immunitaire dans la pathologie de l’AVC.

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Protocole

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Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’hôpital de l’amitié de Pékin, Université de médecine de la capitale. Nous recommandons que toutes les solutions soient soumises à une filtration stérile et que tous les tubes utilisés soient stériles.

1. Préparation des réactifs et du tampon

  1. Mélange d’enzymes de digestion : Dissoudre la collagénase IV pour obtenir une concentration de 0,25 % et diluer la DNase I pour atteindre une concentration finale de 2 U/mL.
  2. Tampon de tri cellulaire activé magnétique (MACS) : Dissoudre l’albumine sérique bovine (BSA) et l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour atteindre des concentrations de 0,5 % et 2 mM dans 1x PBS, respectivement.

2. Modèle d’AVC ischémique focal

REMARQUE : Des souris C57BL/6 J (âgées de 8 à 10 semaines) ont été utilisées pour établir un modèle d’AVC ischémique focal, comme décrit précédemment14. Les souris peuvent également être anesthésiées à l’aide d’une solution d’avertin à 1,25 % à la dose de 0,2 mL pour 10 g de poids corporel.

  1. Anesthésez les souris à l’aide d’isoflurane à 3 %, en maintenant une dose de 1,5 % à l’aide d’un appareil d’anesthésie gazeuse. Maintenez la température corporelle à 37 °C pendant toute la durée de la procédure à l’aide d’un coussin chauffant.
    REMARQUE : Cette étude souligne l’importance de vérifier l’atteinte du plan chirurgical avant le début de l’intervention. Cette étape est cruciale pour assurer un accès optimal à la zone ciblée et minimiser les complications potentielles pendant la chirurgie.
  2. Coupez la fourrure dans la région entre l’œil droit et l’oreille droite à l’aide d’un rasoir électrique. Créez une incision verticale dans la zone désignée adjacente aux yeux sous un microscope de dissection.
  3. Séparez doucement tous les tissus pour exposer le crâne et identifier la branche distale de l’artère cérébrale moyenne droite (ACM), caractérisée par une structure vasculaire verticale en forme de « Y ». Utilisez une perceuse électrique pour pénétrer le crâne, en prenant soin de le retirer avec précaution.
  4. Excise délicatement les méninges à l’aide de micro-pinces.
  5. Exposez la branche distale de l’artère cérébrale moyenne droite (ACM), puis effectuez une ligature permanente de la branche distale de l’ACM droite à l’aide d’une suture 10-0.
  6. Repositionnez le tissu dans son état d’origine et fermez l’incision de la peau du visage avec un adhésif tissulaire.
  7. Positionnez la souris en position couchée et coupez la fourrure dans la région du cou avec un rasoir électrique.
  8. Créez une incision horizontale dans la région du cou et écartez doucement les glandes sous-maxillaires.
  9. Disséquez soigneusement la gaine carotide à l’aide d’une micro-pince, en identifiant l’artère carotide commune et en la séparant du nerf vague.
  10. Enfilez une suture 4-0 dans l’artère carotide commune et fixez-la avec un nœud coulant.
  11. Répétez l’étape 10 sur l’artère carotide commune controlatérale. Occlure temporairement les artères carotides communes (ACC) bilatérales pendant 7 min.
  12. Replacez le tissu de la glande sous-maxillaire dans sa position d’origine et fermez l’incision du cou avec un adhésif tissulaire.
    REMARQUE : Le groupe d’opération simulée a subi des procédures identiques à celles du groupe AVC, à l’exception singulière que l’ACM distal et l’ACC n’étaient pas ligaturés.
  13. Surveillez la souris tout au long et après l’intervention chirurgicale, y compris sa respiration et sa température corporelle. Gardez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement réveillée.

3. Perfusion et dissection cérébrales

  1. Préparez une seringue de 50 ml et fixez une aiguille de 26 g à son extrémité. Remplissez la seringue d’une solution saline.
  2. Administrez une double dose de 1,25 % d’avertin pour obtenir une anesthésie profonde chez la souris.
    REMARQUE : La souris doit être soigneusement confirmée pour être complètement anesthésiée avant de passer à l’étape suivante.
  3. Positionnez la souris en position couchée sur une planche de mousse, en étendant ses membres antérieurs et postérieurs, en les fixant en place avec des aiguilles de 26 G.
  4. Une fois la souris complètement anesthésiée, saisissez la peau abdominale avec une pince ophtalmique et faites une incision latérale pour révéler le foie. Procédez à la coupe des deux côtés des côtes pour exposer le cœur.
  5. Insérez l’aiguille 26 G dans le ventricule gauche et sectionnez le pavillon de l’oreille, puis appuyez sur la seringue pour permettre au sang de s’écouler.
  6. Continuez le processus de perfusion jusqu’à ce que le sang qui s’écoule du pavillon de l’oreille soit clair.
  7. Décapitez la souris juste au-dessus de la moelle épinière à l’aide de ciseaux chirurgicaux droits.
  8. Créez une incision postéro-antérieure dans la peau de la tête pour découvrir le crâne. Faites deux incisions latérales à la jonction des parois latérales et de la base du crâne.
  9. Coupez le crâne le long de la suture sagittale et faites une incision entre les orbites.
  10. Utilisez des pinces pour retirer le crâne recouvrant chaque hémisphère, exposant ainsi le cerveau, et transférez-le dans une matrice cérébrale en acier de souris. Par la suite, sectionnez le cerveau en tranches coronales consécutives de 2 mm d’épaisseur.

4. Digestion du tissu cortical en suspension unicellulaire et coloration par anticorps pour la cytométrie en flux

  1. Introduire 500 μL de mélange d’enzymes de digestion dans chaque puits d’une plaque à 12 puits.
  2. Séparez délicatement le tissu de l’infarctus et transférez-le dans le mélange d’enzymes de digestion à l’aide de micro-pinces (Figure 1).
  3. Fragmentez minutieusement le tissu en les plus petits morceaux possibles à l’aide d’un ciseau ophtalmique et incubez à 37 °C pendant 20 min.
  4. À l’aide d’une pipette P1000, aspirez doucement et distribuez la solution 10 fois pour dissocier le tissu en cellules individuelles, puis passez la solution à travers une passoire cellulaire de 70 μm. Rincez continuellement la plaque à 12 puits et la crépine de cellules avec du HBSS glacé contenant du calcium et du magnésium.
  5. Centrifuger à 500 × g à 4 °C pendant 5 min, puis jeter soigneusement le surnageant.
    REMARQUE : Étant donné que les granulés produits sont assez lâches et faciles à déloger, veuillez vous abstenir de les déranger pour éviter toute perte de cellules.
  6. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de 1x PBS et répétez l’étape 5. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 150 μL de 1x PBS et transférez la suspension dans une plaque à 96 puits à fond rond. Puis centrifuger à nouveau à 500 × g à 4 °C pendant 5 min.
  7. Saisissez fermement la plaque à 96 puits et retournez-la rapidement pour jeter le surnageant.
  8. Diluez le colorant de fluorescence de viabilité cellulaire dans un rapport de 1:100 dans 1x PBS, puis remettez le granulé en suspension dans une aliquote de 150 μL. Incuber pendant 10 min à température ambiante (RT), à l’abri de la lumière.
  9. Centrifuger à 500 × g à 4 °C pendant 5 min et jeter le surnageant. Diluez le cocktail d’anticorps de surface cellulaire dans un tampon MACS. Sans laver les cellules, ajoutez le cocktail d’anticorps à la surface cellulaire et incubez pendant 15 à 20 minutes supplémentaires à 4 °C.
  10. Centrifuger à 500 × g à 4 °C pendant 5 min et jeter le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 150 μL de tampon MACS.
  11. Répétez l’étape 4.10 et transférez la suspension dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml ou des tubes à essai en polystyrène à fond rond de 5 ml.

5. Analyse et tri par cytométrie en flux

  1. Concevoir un panel de cytométrie en flux multicolore selon la configuration de l’instrument, en utilisant des techniques manuelles ou un outil de conception en ligne, afin d’optimiser la sélection de fluorophores conjugués à des anticorps et de minimiser le chevauchement spectral.
    REMARQUE : Plusieurs considérations essentielles doivent être prises en compte lors de la conception d’un panneau de cytométrie en flux multicolore. Tout d’abord, il est essentiel de se familiariser avec la configuration de l’instrument utilisé, y compris les lasers et les filtres, avant de commencer. Deuxièmement, utilisez des marqueurs fluorophores brillants sur les anticorps pour les antigènes de faible abondance, tout en optant pour des marqueurs fluorophores faibles sur les anticorps ciblant les antigènes fortement exprimés. Enfin, il est impératif d’inclure un colorant de viabilité cellulaire dans le panel afin d’exclure efficacement les cellules et les débris non viables des données. Notamment, pour assurer une signalisation appropriée des antigènes de faible abondance ou mal caractérisés, il faut utiliser des contrôles de fluorescence moins un (FMO)15. Les contrôles FMO englobent tous les marqueurs de lignage à l’exception de celui d’intérêt, ce qui facilite la délimitation précise entre les cellules colorées positivement et négativement16.
  2. Ajustez les paramètres des détecteurs de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) pour vous assurer que les cellules d’intérêt sont correctement affichées sur l’échelle et peuvent être fermées au besoin.
  3. Ajustez méticuleusement le FSC et le SSC pour éliminer les débris ou les bruits parasites. Différenciez les doublets des cellules simples dans un graphique à points qui illustre à la fois l’aire et la hauteur du FSC. Isolez des cellules viables en fonction du signal de fluorescence négatif de la viabilité cellulaire.
    REMARQUE : Les paramètres de divers instruments peuvent présenter de légères variations. Par exemple, certains trieurs de cellules utilisent la largeur et la hauteur du FSC pour distinguer les doublets des cellules simples, tandis que d’autres utilisent l’aire et la hauteur du FSC dans le même but.
  4. Ajustez la compensation pour chaque canal.
    REMARQUE : Des échantillons cellulaires et des billes de compensation disponibles dans le commerce peuvent être utilisés à des fins de compensation du débordement fluorescent.
    1. Comparez le contrôle d’autofluorescence (cellules non colorées) avec les contrôles positifs des cellules colorées pour vous assurer que les cellules colorées sont correctement mises à l’échelle pour chaque paramètre. De plus, affinez la compensation en analysant les échantillons de cellules multicolores, en surveillant les diagrammes à points à 2 couleurs et en ajustant les paramètres de compensation à la hausse ou à la baisse pour vous assurer que les populations de cellules sont alignées verticalement ou horizontalement les unes par rapport aux autres.
    2. Utilisez les signaux CD45 et CD11b pour distinguer les lymphocytes (CD11b-CD45élevés), les microglies (CD11b + CD45int), les cellules myéloïdes (CD11b + CD45élevé) et les astrocytes (CD11b-CD45- GLAST+)17,18.
    3. Utiliser du tissu cérébral fictif comme contrôle de l’auto-fluorescence et référence pour discriminer les lymphocytes. Si une cible spécifique est examinée, utilisez un contrôle FMO avec du tissu cérébral post-AVC.
  5. Commencez la collecte des données de contrôle et d’échantillonnage et assurez-vous qu’elles sont enregistrées.
    REMARQUE : Étant donné que le modèle de mini-AVC décrit ici entraîne un petit infarctus, il y a généralement moins de cellules collectées que le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO). En général, la collecte de 5 × 105 cellules produit environ 5 × 103 microglies et 1 × 105 astrocytes, respectivement.
  6. Sélectionnez et triez les populations cellulaires souhaitées dans des tubes à essai en polystyrène à fond rond de 5 ml ou des tubes à centrifuger coniques de 15 ml.
    REMARQUE : Ajouter 500 μL de PBS et rincer méticuleusement le tube pour assurer la viabilité des cellules et aider à la formation de la pastille cellulaire.

6. Analyse de l’expression génique dans des populations cellulaires sélectionnées

REMARQUE : L’extraction totale de l’ARN peut également être effectuée à l’aide de kits commerciaux conformément aux directives du fabricant.

  1. Centrifuger les cellules de l’étape 5.6 à 500 × g à 4 °C pendant 3 min, puis jeter le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de réactif TRIzol.
    REMARQUE : Le nombre de cellules triées est considérablement inférieur à celui des cellules ou des tissus cultivés. Par conséquent, une vitesse de centrifugation plus élevée peut aider à former une pastille de cellules plus compacte. Les cellules obtenues à partir de cette étape peuvent être utilisées pour des applications ultérieures, telles que la culture cellulaire ou les pipelines de séquençage d’ARN unicellulaire.
  2. Laisser l’échantillon reposer à RT pendant 5 min pour faciliter la dissociation des complexes nucléoprotéiques.
  3. Ajouter 0,2 mL de chloroforme à l’échantillon et fixer le tube. Agitez vigoureusement les tubes pendant 15 s, puis incubez pendant 2 min à RT.
  4. Centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 15 min à 4 °C. L’ARN restera uniquement dans la phase aqueuse supérieure.
  5. Transférez avec précaution la phase aqueuse supérieure dans un tube propre, en prenant soin de ne pas perturber l’interface.
    REMARQUE : Le volume de la phase aqueuse doit être d’environ 500 μL.
  6. Faites précipiter l’ARN de la phase aqueuse en introduisant 0,5 mL d’isopropanol et en mélangeant doucement en inversant le tube plusieurs fois. Incuber les échantillons à RT pendant 10 min.
  7. Centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 10 min à 4 °C pour recueillir l’ARN.
  8. Décantez le surnageant et éliminez soigneusement tout liquide résiduel par aspiration.
  9. Lavez la pastille d’ARN une fois avec de l’éthanol à 75 %, en ajoutant un minimum de 1 ml d’éthanol à 75 %. Bien mélanger l’échantillon, puis centrifuger à 7500 × g pendant 5 min à 4 °C.
  10. Éliminez toute trace d’éthanol. Faites sécher la pastille d’ARN à l’air libre pendant 5 min.
  11. Dissoudre l’ARN dans 10 μL d’eau exempte de RNase en pipetant de haut en bas.
  12. Procédez à la PCR en temps réel selon les instructions du fabricant.

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Résultats

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Dans cette étude, nous présentons un protocole affiné pour évaluer la fonctionnalité des cellules immunitaires après un AVC ischémique, en utilisant l’analyse cytométrique en flux dans un modèle de mini-AVC. Le mini-AVC a été induit par la ligature permanente de la branche distale de l’artère cérébrale moyenne droite (ACM), suivie d’une occlusion de 7 minutes des artères carotides communes bilatérales (ACC). Cette méthodologie permet d’obtenir un AVC bénin caractérisé par des volumes de lésions faibles et constants et un...

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Discussion

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Dans cette étude, nous présentons un protocole détaillé pour évaluer la fonction des cellules immunitaires après un AVC ischémique, en utilisant l’analyse cytométrique en flux dans un modèle de mini-AVC. Les étapes critiques de ce protocole comprennent la mise en place d’un AVC ischémique focal via la ligature permanente de la branche distale de l’artère cérébrale moyenne droite (ACM) associée à une occlusion de sept minutes des artères carotides communes (ACC) bilatérales. Cette approch...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82201622) et la Fondation des sciences naturelles de Mongolie intérieure (n° 2020MS03017).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de microcentrifugation de 1,5 mLNID  ;615601Matériel de laboratoire
1& fois ; PBSCorningRéférence 21-040-CMRéactif
Microplaque transparente à fond rond à 96 puits traitée TCCorning3799Matériel de laboratoire
APC anti-souris CD19Biolégende152410Anticorps
APC/Cyanine7 anti-souris CD45Biolégende103116Anticorps
Avertin (1,25 %)Nanjing Aibei Biotechnology  ;Référence M2920Réactif
BD FACSAria IIBD642510Équipement
Violet Brillant 421 anti-souris CD4Biolégende100437Anticorps
Brilliant Violet 605 anti-souris / humain CD11bBiolégende101237Anticorps
BSASigma-AldrichA1933-1GChimique
Collagénase IVSigma-AldrichC4-28-100MGEnzyme
DNase IBiolabs de la Nouvelle-AngleterreM0303LEnzyme
EDTASigma-AldrichEDS-100GChimique
Falcon 5 mL Tubes à essai en polystyrène à fond rondCorning352052Matériel de laboratoire
Faucon  ; Tubes à centrifuger coniques de 15 mLCorning352095Matériel de laboratoire
FlowJo V10BDLogiciel
Anticorps GLAST (ACSA-1), PEMiltenyi Biotec130-118-344Anticorps
L’isofluraneRWD Sciences de la vieRéférence R510-22-10Réactif
PE/Cyanine7 anti-souris CD3Biolégende100220Anticorps
PE/Dazzle 594 anti-souris NK-1.1Biolégende156518Anticorps
Réactif TRIzolThermo Fisher Scientific Inc.15596026Réactif
Eau distillée sans DNase/RNase ultra-pureThermo Fisher Scientific Inc.10977015Réactif
Adhésifs tissulaires Vetbond3M1469SBMatériel de laboratoire
Kit de viabilité fixable Zombie AquaBiolégende423102Colorant fluorescent réactif aux amines

Références

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