Cette étude a montré que le sérum contenant du Jiangtangle de la médecine tibétaine pouvait améliorer le dysfonctionnement mitochondrial en augmentant les niveaux d’ATP mitochondriaux et glycolytiques.
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Article de recherche
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Cette étude a montré que le sérum contenant du Jiangtangle de la médecine tibétaine pouvait améliorer le dysfonctionnement mitochondrial en augmentant les niveaux d’ATP mitochondriaux et glycolytiques.
L’insuffisance β-cellules causée par un dysfonctionnement mitochondrial est la caractéristique principale du diabète sucré de type 2 (DT2). La médecine tibétaine Jiangtangle, composée de Berberis kansuensis, Curcumaelongae Rhizoma, Malvae Fructus, Tribuli Fructus, Thlaspi arvense L. et Phyllanthus emblica L., peut être utilisée pour remédier au DT2. Cependant, ses effets sur la fonction mitochondriale restent incertains. Cette étude vise à clarifier les effets pharmacologiques de la médecine tibétaine Jiangtangle sur les mitochondries. À 7 jours après la pré-administration de la médecine tibétaine Jiangtangle, le sérum de rat a été obtenu par prélèvement de sang dans l’aorte abdominale. Les β-cellules des îlots pancréatiques de rat (RIN-m5F) ont été divisées en groupes de témoins, de modèles et de sérums contenant du Jiangtangle. Les groupes sériques modèles et contenant du Jiangtangle ont été induits pour les lésions avec un milieu DMEM contenant 50 mM de glucose pendant 24 h. Le groupe témoin a été traité avec un milieu DMEM ne contenant pas de glucose pendant 24 heures. Ensuite, un milieu a été ajouté aux groupes témoin et modèle, tandis que les groupes sériques contenant du Jiangtangle ont été incubés pendant 24 heures, le milieu contenant 2,5 %, 5 % et 10 % de sérum contenant du Jiangtangle. Les résultats de l’étude UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS ont indiqué la présence de 90 composés dans le Jiangtangle, dont 6 composés prototypes entrant dans le sang. CCK 8 a été utilisé pour mesurer la viabilité cellulaire, Seahorse XFe a été utilisé pour évaluer le métabolisme énergétique mitochondrial et l’effet du sérum contenant du Jiangtangle sur le modèle hyperglycémique des cellules RIN-m5F a été évalué. Le sérum contenant le jiangtangle a augmenté la viabilité des cellules RIN-m5F, le taux d’ATP mitochondrial, le taux d’ATP glycolytique, la glycolyse basale, la glycolyse compensatoire, l’OCR, la fuite de protons et la respiration maximale.
Le diabète sucré est une maladie métabolique chronique largement répandue dans le monde. Sa pathogenèse complexe constitue une menace sérieuse pour la santé humaine, car il s’agit d’un problème majeur de santé publique à résoudre d’urgence1. Le diabète est principalement divisé en diabète sucré de type 1, diabète sucré de type 2 (DT2), diabète gestationnel et types spécifiques de diabète2. Avec le changement de mode de vie et l’accélération du processus de vieillissement, la prévalence du diabète a montré une forte tendance à la hausse au cours des dernières décennies. La Chine a la plus grande population diabétique au monde, avec plus de 118 millions de personnes souffrant de diabète, ce qui représente environ 22 % du total mondial, dont plus de 90 % sont des DT2 3,4,5. Dans toutes les pathogenèses rapportées, le dysfonctionnement des îlots β-cellules a été annoncé comme un mécanisme pivot au cours du processus de DT2 6,7.
Les mitochondries, étant le centre du métabolisme énergétique cellulaire, sont des sous-organites impliqués dans les fonctions de base de l’îlot β-cellule8. Des études actuelles ont montré que l’apparition et le développement du DT2 sont étroitement liés à l’activité, à la fonction et au stress oxydatif des mitochondries. L’insuffisance β-cellules causée par un dysfonctionnement mitochondrial est la caractéristique principale du DT29. β-cellules situées dans les îlots sont responsables de la synthèse et de la sécrétion de l’insuline, une hormone nécessaire à la régulation de la glycémie. Au cours du développement du DT2, une fonction mitochondriale anormale, des espèces réactives de l’oxygène enrichies et une réaction de stress oxydatif rompent l’équilibre dynamique mitochondrial des cellules β et affectent la sécrétion et le métabolisme de l’insuline10.
La médecine tibétaine du Jiangtangle est composée de Berberis kansuensis, Curcumaelongae Rhizoma, Malvae Fructus, Tribuli Fructus, Thlaspi arvense L. et Phyllanthus emblica L. (Figure 1). Il s’agit d’une poudre jaune à l’odeur parfumée et au goût amer. Il peut être utilisé pour soigner la bouche sèche, la polydipsie, l’émaciation, la polyurie, le pied diabétique, les démangeaisons cutanées et d’autres symptômes causés par le diabète. Les preuves cliniques existantes ont montré que les alcaloïdes de l’écorce de Berberis peuvent soulager efficacement le DT2 en abaissant la glycémie, en améliorant la résistance à l’insuline et en réduisant l’inflammation11. La curcumine a le potentiel d’améliorer le DT2 en réduisant la glycémie, en améliorant la sensibilité à l’insuline, en modulant les profils lipidiques et en exerçant des effets anti-inflammatoires et antioxydants12. De plus, Malave Fructus, Tribulifructus, Thlaspi arvense L. et Phyllanthus emblica L. ont également une activité antidiabétique ou anti-oxydante 13,14,15. À l’heure actuelle, l’efficacité, la base matérielle et le mécanisme de la médecine tibétaine Jiangtangle dans le traitement du DT2 ne sont pas encore divulgués. La composition de la médecine tibétaine chinoise est complexe, et sa prévention et sa thérapie des maladies sont basées sur la théorie de l’utilisation de la drogue dans des vues holistiques et systématiques. Actuellement, la pharmacochimie du sérum chinois de matière médicale peut expliquer en partie les composants d’absorption dans le sang et est devenue un moyen important d’explorer la base matérielle des médicaments tibétains. Cette étude a d’abord élucidé l’effet protecteur de la médecine tibétaine Jiangtangle sur les mitochondries in vitro, en mettant l’accent sur la nouvelle hypothèse selon laquelle le sérum contenant du Jiangtangle peut atténuer le dysfonctionnement mitochondrial dans les cellules β des îlots pancréatiques de rat (RIN-m5F) en cas de stress glycémique élevé.
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Le comité administratif de Sichuan Scientist Biological Testing Biotechnology Co., Ltd. a approuvé le protocole pour les animaux (numéro d’enregistrement : SYST-2024-019). Des rats Sprague Dawley (SD) mâles, âgés de 8 à 10 semaines et pesant de 260 à 300 g, ont été gardés dans des cages de ventilation indépendantes dans un environnement contrôlé de 23 ± 2 °C et d’une humidité relative de 55 % à 60 % pour cette étude. Ces animaux exempts d’agents pathogènes spécifiques provenaient d’un fournisseur commercial (voir le tableau des matériaux). Tous les rats ont subi une période d’alimentation adaptative d’une semaine pour s’acclimater au nouvel environnement avant le début de l’expérience, avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture.
Préparation expérimentale
Les médicaments et réactifs nécessaires ont été préparés selon l’organigramme expérimental (voir le tableau des matériaux). Des rats SD FPS (8 à 10 semaines, 260 à 300 g) ont été utilisés dans cette étude. Tous les animaux ont été achetés auprès d’un fournisseur commercial (voir la Table des matières). Après la quarantaine, les animaux ont été maintenus à une température ambiante constante avec un cycle lumière-obscurité de 12:12 h et nourris avec un régime standard de rongeurs et de l’eau.
Traitement des animaux et prélèvement de sérum
Tous les rats qui ont subi une alimentation adaptative ont reçu la médecine tibétaine Jiangtangle par gavage pendant 7 jours. La dose clinique était de 0,6 g/j, qui a été convertie en une dose de rat de 1,26 g/kg17. 1 heure après la dernière administration, les rats ont été anesthésiés avec de l’isoflurane à 3 % à 4 % pour l’induction et à 2 % pour l’entretien. Les rats anesthésiés ont ensuite été fixés sur une table d’opération, et le site chirurgical a été désinfecté à l’iodophore. Une incision a été pratiquée le long de la ligne médiane de l’abdomen pour exposer l’aorte abdominale. Le sang a été prélevé lentement à l’aide d’une seringue héparinée de l’aorte (8 ml) et transféré dans un tube à centrifuger pour la centrifugation. Le sang prélevé a été centrifugé à 2360 x g pendant 10 min à 4 °C pour séparer le sérum. Les échantillons de sérum ont ensuite été aliquotes dans des tubes cryogéniques à raison de 5 ml par tube et stockés dans un réfrigérateur médical à -80 °C (voir le tableau des matériaux) pour une analyse ultérieure.
Analyse UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS
Préparation des échantillons de matériel médicinal : Le médicament tibétain Jiangtangle (140,0 mg) a été pesé avec précision et dissous dans 25 mL de méthanol (voir tableau des matériaux), suivi d’une sonication de 30 min à 40 kHz, 300 W. La solution résultante a été filtrée à travers une membrane de 0,22 μm pour obtenir l’échantillon d’essai.
Préparation de l’échantillon de sérum : 100 μL de sérum ont été soigneusement mélangés avec 400 μL de méthanol froid et d’acétonitrile (v/v, 1:1 ; voir le tableau des matériaux) par vortexing. Le mélange a été traité par sonication (40 kHz, 300 W) pendant 1 h en bain de glace. Le mélange a ensuite été incubé à -20 °C pendant 1 h, puis centrifugé à 4 °C pendant 20 min à 14 000 x g. Les surnageants ont ensuite été récoltés et séchés sous vide pour l’analyse UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS.
Conditions chromatographiques : Les surnageants ont été mesurés par un système UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS (voir Tableau des matériaux). Pour la séparation LC, une colonne ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) a été utilisée. La phase mobile était composée de A (0,1 % d’acide formique dans l’eau) et B (100 % d’acétonitrile). Le débit était de 0,3 mL/min, avec un programme de gradient spécifique de 5 % à 95 % B (0 à 30 min), 95 % B (30 à 35 min). Le volume d’injection était de 5 μL. Les données MS ont été acquises séparément en mode ESI positif et négatif. La source HESI avait défini des conditions pour la tension de pulvérisation, la température capillaire, les flux de gaz, etc. L’instrument a balayé à m/z 70-1050 Da, avec différentes résolutions pour la MS complète et la MS/MS. Les données MS brutes ont été traitées à l’aide de MS-DIAL pour l’alignement des pics. La composition de la médecine tibétaine Jiangtangle a été identifiée par des données précises de masse et de MS/MS dans des bases de données publiques. Seules les variables avec plus de 50 % de valeurs non nulles dans au moins un groupe ont été retenues.
Culture cellulaire et traitement
Les cellules RIN-m5F (voir le tableau des matières) ont été cultivées avec du milieu Modified Eagle de Dulbecco (DMEM), 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine dans un incubateur contrôlé à 5 % de CO2 (voir le tableau des matériaux) à 37 °C. Des cellules RIN-m5F au stade de croissance logarithmique ont été prélevées, comptées après la digestion et inoculées dans des plaques à 96 puits avec 1 x 105 cellules par puits. En utilisant 10-60 mM de glucose, l’induction cellulaire a été réalisée pour imiter un environnement à haute teneur en glucose du DT2. Les cellules RIN-m5F ont été divisées en groupes témoins, modèles et 2,5 %, 5 % et 10 % de sérum contenant du Jiangtangle. Les cellules du groupe témoin ont été traitées avec du DMEM, et d’autres groupes ont été induits avec du DMEM contenant du glucose pendant 24 heures. Des groupes témoins et modèles ont été ajoutés avec du milieu, tandis que chaque groupe sérique a été ajouté avec du DMEM contenant 2,5 %, 5 % et 10 % de sérum contenant du Jiangtangle, et incubé pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2.
Analyse de la CCK 8
La viabilité cellulaire a été mesurée par CCK 8 (voir le tableau des matériaux). Les cellules RIN-m5F ont été inoculées dans des plaques à 96 puits et traitées avec du glucose (0, 10, 20, 30, 40, 50 et 60 mM). Ensuite, 100 μL de DMEM avec du sérum contenant du Jiangtangle ont été ajoutés dans les puits et incubés à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h. Chaque groupe comprenait 6 puits répétés. Après 24 h d’incubation avec du glucose et 24 h d’incubation avec du sérum contenant du Jiangtangle, 10 μL de solution de CCK 8 ont été ajoutés et incubés à 37 °C pendant 1,5 h supplémentaires. Un lecteur de microplaques sur toute la longueur d’onde (voir Tableau des matériaux) a été utilisé pour détecter les valeurs d’absorbance de chaque trou à 450 nm16.
Analyse de la fonction mitochondriale
Comme nous l’avons déjà signalé18, l’analyseur Seahorse XFe 24 (voir le tableau des matériaux) a été utilisé pour évaluer le taux de production d’ATP en temps réel et le taux de glycolyse. Les cellules RIN-m5F ont été inoculées dans des microplaques Seahorse XFe24 V24. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques de culture cellulaire XF24 à l’aide d’un protocole en deux étapes : 100 μL de suspension cellulaire ont été distribués dans chaque puits et la plaque a été laissée intacte pendant 1 h. Ensuite, la plaque a été transférée dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 4 h pour favoriser la fixation initiale. Ensuite, 150 μL de DMEM ont été ajoutés à chaque puits. Après modélisation pendant 24 h et administration du médicament pendant 24 h, la solution de détection a été préparée en ajoutant 1 % de glucose, 1 % de pyruvate et 1 % de glutamine au milieu Seahorse XF DMEM. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec une solution de détection de 1 ml. Pour l’utilisation du kit de mesure du taux d’ATP en temps réel et du kit de dosage du taux de glycolyse, 56 μL d’oligomycine et 62 μL de roténone/antimycine A ont été remis en suspension et ajoutés aux puits de cartouche de capteur A et B, respectivement. Et la plaque de culture cellulaire a été placée dans un incubateur de culture cellulaire sans CO2 pendant 60 min. Enfin, le taux de production d’ATP et le taux de glycolyse ont été suivis en temps réel par un système d’injection automatique. Toutes les expériences ont été menées à 37 °C et les données ont été analysées à l’aide du logiciel XF Wave19.
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UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS a montré que la médecine tibétaine de Jiangtangle contenait des composés tels que des phénols, des alcaloïdes, des flavonoïdes, des nucléosides, des acides organiques, des acides aminés, des terpénoïdes, des coumarines, des glycosides, des tanins, des lignanes, des stéroïdes et autres. (Figure 2, Tableau 1). Les rats SD ont reçu par voie orale 1,26 g / kg de médicament tibétain Jiangtangle une fois par jour. Une vue d’e...
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Le DT2 est généralement considéré comme une maladie métabolique chronique à début caché et à forte prévalence, et s’accompagne de nombreuses complications liées au diabète telles que la dysfonction oculaire, cardiovasculaire et rénale 20,21,22,23. Ses manifestations cliniques comprennent une glycémie élevée, la polyurie, la polydipsie, la perte de poids et même...
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par le projet de construction Connotation du 14e plan quinquennal de l’Université de médecine tibétaine (2023ZYYGH05) et le Département des sciences et de la technologie de la province du Sichuan (2024NSFSC1845). Entre-temps, les auteurs tiennent à remercier le Dr Lu Yang, ingénieur principal en équipement à l’Institut innovant de médecine chinoise et à Phamacy/Academy for Interdiscipline, pour avoir fourni des services techniques pour les techniques Seahorse XF.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| ;-80 ° ; C réfrigérateur médical | Mether | MDF-86H118 | |
| 0.22 & micro ; m membrane aqueuse | Jinteng | JTMF0445 | |
| 0,22 & micro ; Membrane filtrante microporeuse à aiguille Membrane | Jinteng | JTSFM013001 | |
| Acétonitrile | Aladdin | A104440 | |
| Agilent Logiciel OpenLab | Agilent | Version 2.X | |
| Enceinte de biosécurité | Airtech | BSC-1004 II A2 | |
| Kit de comptage de cellules-8 | Bioground | BG0025 | |
| CelMate CO2 Incubateur | Esco Micro Pte Ltd. | CLM-240B-8 | |
| Colonne chromatographique | Agilent | SB-C18 | |
| Agitateur de décoloration | Kylin-Bell | TS-2 | |
| Aigle modifié de Dulbecco Gibco | 8121587 | ||
| NCM Biotech | 20230801 | ||
| Acide formique | Aladdin | F298778 | |
| Glucose | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | P012-180-180222 | |
| Logiciel GraphPad Prism | Logiciel GraphPad, LLC | Version 9.5.1 | |
| Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse | Thermo Fisher Scientific | Legend Micro 17R | |
| Centrifugeuse à basse vitesse | Hallon | NH5 | |
| Méthanol | Aladdin | M116118 | |
| Pénicilline-streptomycine | NCM Biotech | C125C5 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (1× ;) | Gibco | 8120485 | |
| Rat îlot pancréatique &bêta ;-cellules | ATCC | CRL-11605 | |
| ReadMax 1500 absorption de lumière enzyme pleine longueur d’onde ; | Flash | ReadMax 1500 | |
| Seahorse XF kit de dosage du taux de glycolyse | Agilent | 103344-100 | |
| Seahorse XF kit de mesure du taux ATP en temps réel | Agilent | 103592-100 | |
| Analyseur Seahorse XFe 24 | Agilent | XFe24 | |
| Trypsine (0.25 %, 1× ;) | HyClone | J210045 | |
| UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS analyseur | Thermo Scientific | QE Q Mélangeur Exactive | |
| Vortex | Kylin-Bell | XW-80A |
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