Article de méthode

Exploration des événements cellulaires séquentiels de la phagocytose déclenchée par Godanti Bhasma dans les cellules de mammifères

DOI :

10.3791/68321

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11 juillet 2025

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1Shobhit Institute of Engineering & Technology

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude élucide le traitement phagocytaire des particules de Godanti Bhasma (GB) dans les cellules de mammifères, en caractérisant leur absorption cellulaire, la dynamique des vacuoles, l’acidification et la dégradation. Ces résultats font non seulement progresser notre compréhension des mécanismes fondamentaux de la phagocytose, mais établissent également la GB comme un système modèle prometteur pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La phagocytose est un mécanisme cellulaire vital par lequel les cellules engloutissent et dégradent des particules étrangères, des agents pathogènes ou des débris, jouant un rôle clé dans la défense immunitaire et le maintien de l’homéostasie tissulaire. Les perturbations dans ce processus sont associées à diverses maladies. Pour explorer les événements complexes impliqués dans la voie de la phagocytose, des particules intelligentes avancées et des techniques de surveillance efficaces sont essentielles. Godanti Bhasma (GB), une médecine traditionnelle indienne composée de particules de sulfate de calcium bioactives, est rapidement internalisée par phagocytose dans les cellules de mammifères, induisant une vacuolisation cytoplasmique importante. Les étapes clés de la phagocytose induite par le GB ont été évaluées ici à l’aide de la cytométrie en flux (FC), de l’imagerie de cellules vivantes et de techniques de coloration spécifiques. L’analyse cytométrique en flux a démontré la formation de structures phagocytaires en forme de coupe associées à l’internalisation des particules. L’imagerie de cellules vivantes a permis d’observer en temps réel les processus phagocytaires, y compris l’absorption de particules, la formation de vacuoles, la dégradation des matériaux englouti et le renouvellement vacuolaire. Une coloration au rouge neutre et à l’orange acridine a été utilisée pour évaluer l’acidification vacuolaire. Il est intéressant de noter que le traitement avec l’inhibiteur lysosomal BFA1 dans les cellules traitées par GB n’a pas conduit à la vacuolisation, comme en témoigne l’absence d’absorption du rouge neutre, soulignant la nécessité d’un environnement acide pour que la vacuolisation se produise. Ces résultats soulignent le potentiel de la phagocytose induite par le GB en tant que modèle pour élucider les événements cellulaires séquentiels impliqués dans ce processus, ce qui est essentiel pour comprendre les interactions hôte-pathogène, le trafic intracellulaire et le développement de stratégies thérapeutiques innovantes pour les troubles liés à la phagocytose.

Introduction

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La phagocytose est un processus cellulaire essentiel effectué par les phagocytes professionnels résidant dans les tissus, tels que les macrophages et les cellules dendritiques, ainsi que par les phagocytes non professionnels, tels que les cellules épithéliales et les fibroblastes, qui engloutissent et dégradent les particules étrangères. Ces cellules internalisent et éliminent les particules étrangères, les agents pathogènes ou les débris cellulaires, contribuant ainsi de manière significative à la défense immunitaire et à l’homéostasie tissulaire1. Ce processus commence par la reconnaissance d’agents pathogènes, de débris ou de particules par le biais de récepteurs de reconnaissance de formes (PRR), tels que les récepteurs de type Toll (TLR), qui se lient aux motifs moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP)2. Cette reconnaissance déclenche la formation d’une cupule phagocytaire, où les protubérances de la membrane plasmique s’étendent autour de la particulecible 3. Les filaments d’actine jouent un rôle crucial dans cette étape, en conduisant au remodelage membranaire nécessaire à l’engloutissement des particules4. Une fois que la particule est enfermée dans un phagosome, une vésicule liée à la membrane se forme. Le phagosome subit une maturation, caractérisée par la fusion avec des endosomes précoces, puis tardifs, suivie de l’incorporation de lysosomes contenant des enzymes hydrolytiques5. Ces enzymes, telles que les cathepsines, le lysozyme et les nucléases, sont activées par l’acidification à l’intérieur du phagosome, obtenue par l’ATPase vacuolaire (V-ATPase), abaissant le pH à 4,5-5,5. Le processus de dégradation se termine par l’exocytose des restes de la cellule. Les dysfonctionnements de ce processus dynamique et complexe peuvent entraîner des défis immunitaires importants 6,7,8.

Pour évaluer avec précision le processus cellulaire complexe de la phagocytose, il est nécessaire de disposer de méthodes améliorées et simples pour surveiller les principaux événements cellulaires de la phagocytose. Traditionnellement, les méthodes de surveillance pour la quantification de la phagocytose impliquent des techniques telles que la fixation des phagocytes à des intervalles de temps prédéterminés pour la visualisation microscopique, la mesure de l’internalisation des cibles marquées par colorant par imagerie ou cytométrie en flux ou le comptage du nombre de cellules cibles restantes après une durée spécifiée de phagocytose, Cependant, ces méthodes ne capturent pas les fluctuations minute par minute qui se produisent pendant le processus de phagocytose9. De plus, les méthodes reposant sur des indicateurs indirects tels que l’absorption de colorant peuvent ne pas refléter avec précision les événements phagocytaires réels en raison d’un transfert passif potentiel de colorant10.

Les progrès récents de l’imagerie de cellules vivantes, de la cytométrie en flux et des techniques de coloration ont révolutionné notre capacité à surveiller la phagocytose avec une grande précision spatio-temporelle. L’imagerie des cellules vivantes, par exemple, permet l’observation continue des processus dynamiques avec un suivi séquentiel des événements11. La cytométrie en flux est largement utilisée pour analyser les cellules de mammifères et détecter les biomarqueurs dans la recherche clinique12. Cependant, les méthodes traditionnelles de FC ne sont pas équipées pour évaluer les caractéristiques morphologiques et spatiales des cellules individuelles12. La cytométrie en flux d’imagerie (IFC) constitue une alternative robuste qui permet de collecter des informations détaillées à partir de cellules uniques. L’IFC combine les capacités analytiques de la cytométrie en flux avec l’imagerie à haute résolution, permettant une analyse unicellulaire avec des détails morphologiques et spatiaux. Diverses particules, notamment des billes de latex fluorescentes, du zymosan-APC et des nanoparticules synthétiques, sont couramment utilisées pour étudier la phagocytose, fournissant des informations sur l’engagement des récepteurs, la formation des phagosomes et les réponses immunitaires12.

Contrairement aux techniques biochimiques conventionnelles, qui reposent généralement sur l’analyse des points finaux, l’imagerie des cellules vivantes permet une surveillance continue et dynamique des processus cellulaires. Cette méthode offre une haute résolution spatio-temporelle et la possibilité d’observer des événements séquentiels dans la phagocytose. Par conséquent, il s’agit d’un outil puissant pour étudier le processus complexe de la phagocytose, permettant d’obtenir des informations plus précises et détaillées sur les comportements et les mécanismes cellulaires13.

En plus des progrès réalisés dans les systèmes d’imagerie, il est nécessaire de disposer de particules phagocytaires intelligentes capables de mettre en évidence distinctement les événements phagocytaires, en particulier les étapes de dégradation qui se produisent dans le phagosome. Les études de phagocytose utilisent souvent des particules telles que des billes de latex, du zymosan, des bactéries, des cellules apoptotiques et des nanoparticules synthétiques pour explorer des mécanismes tels que l’engagement des récepteurs, la formation des phagosomes et les réponses immunitaires. Bien que ces particules fournissent des informations précieuses, elles ont des limites pour suivre le processus de dégradation complet ou évaluer directement la maturation des phagosomes. Par exemple, les billes de latex ne sont pas biodégradables et ne peuvent pas démontrer leur dégradation, tandis que le zymosan et les bactéries nécessitent souvent un marquage complexe et peuvent ne pas produire de profils de dégradation cohérents14,15.

Notre étude précédente a démontré l’utilité de GB, une formulation ayurvédique traditionnelle composée principalement de sulfate de calcium, en tant que particule idéale pour étudier la maturation et la dégradation des phagosomes16. GB se dissout au fil du temps dans l’environnement acide du phagosome, ce qui permet de visualiser clairement la dégradation des particules. De plus, la capacité de GB à induire une formation de vacuoles robustes facilite l’étude des étapes distinctes de la maturation des phagosomes, de la formation précoce à l’acidification et à la résolution finale. Contrairement à d’autres particules, GB élimine le besoin de marquage externe, fournissant un système autonome pour étudier le cycle de vie complet des phagosomes, ce qui en fait un modèle idéal pour comprendre la dynamique de la phagocytose et des troubles associés16.

Cette étude présente un protocole standardisé et reproductible conçu pour évaluer la phagocytose induite par les particules et la formation de vacuoles à l’aide de Godanti Bhasma (GB) dans des lignées cellulaires phagocytaires professionnelles (RAW 264.7) et non professionnelles (HeLa et 3T3-L1). L’objectif global de cette méthode est de fournir une plate-forme solide pour l’étude des mécanismes d’absorption cellulaire, de la biogenèse vacuolaire et du traitement des particules intracellulaires dans différents types de cellules. Le GB a été mis en suspension dans le DMEM à une concentration de 10 mg/mL et, pour assurer l’uniformité, les particules plus grosses ont été laissées se déposer pendant que la fraction supérieure était recueillie à des fins expérimentales. Pour les tests de cytométrie en flux, les cellules ont été ensemencées à une densité de 2 x 105 cellules par puits dans des plaques de 12 puits, et 300 μL de la suspension de travail GB ont été ajoutés à chaque puits. Pour les analyses basées sur l’imagerie, 5 000 à 10 000 cellules ont été ensemencées par puits dans des plaques de 96 puits ou sur des lames de chambre. Cette méthode fait de GB un modèle fiable pour étudier la formation de vacuoles et l’internalisation des particules dans divers types cellulaires.

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Protocole

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1. Culture cellulaire et ensemencement

  1. Préparez un milieu DMEM complet complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur et des antibiotiques (100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine). Stérilisez tous les réactifs et équipements avant utilisation.
  2. Cultivez les cellules 3T3-L1, HeLa et RAW 264.7 dans des flaconsde 25 cm et des boîtes de culture de 35 mm à l’aide de DMEM. Maintenez les cultures à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 et remplacez le milieu toutes les 48 h.
  3. Pour la sous-culture, lavez les cellules 2 fois avec du PBS, puis détachez les cellules adhérentes à l’aide de 500 μL de trypsine-EDTA et incubez pendant 5 min. Ajoutez 1 mL de DMEM pour neutraliser la solution de trypsine-EDTA, pipetez pour créer une suspension unicellulaire et ajustez le volume à 10 mL avec du DMEM frais. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu frais.
  4. Mélanger 10 μL de suspension cellulaire avec 0,4 % de bleu de trypan (1:1), compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre, calculer la masse volumique en cellules/mL = Nombre moyen x 104 x 2.
  5. Pour les plaques à 96 puits : Distribuer 100 μL de suspension cellulaire (contenant 10 000 cellules) dans chaque puits. Pour les lames de cavité, ensemencez 50 μL de suspension cellulaire (contenant 5000 cellules) dans deux cavités, en laissant la cavité centrale vide. Ajouter 50 μL de DMEM dans chacune des cavités ensemencées.
  6. Incuber les plaques et les lames à 37 °C dans un CO2 à 5 % pendant 24 h pour permettre l’adhérence et la stabilisation des cellules. Inspectez les cellules sous un microscope inversé à un grossissement de 20x pour évaluer la morphologie, la confluence et la contamination avant de poursuivre les expériences.

2. Préparation de la solution mère/cocktail GB pour la culture cellulaire

  1. Procurez-vous GB et pesez 100 mg de poudre avec précision. Mettre la poudre en suspension dans 10 mL de DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine.
  2. Vortex la suspension et laissez-la reposer pendant 1 minute pour permettre aux particules plus grosses de se déposer. Ensuite, transférez les 5 ml supérieurs de la suspension dans un tube à centrifuger stérile.
  3. Désigner cette suspension de 5 mL préparée comme solution mère pour les expériences de culture cellulaire ultérieures. Tourbillonnez soigneusement la suspension pour assurer une dispersion uniforme des particules avant de l’ajouter aux cellules.

3. Analyse par cytométrie en flux

  1. Récolter les cellules RAW 264.7, HeLa ou 3T3-L1 par trypsinisation, neutraliser avec du DMEM complet, centrifuger à 300 x g pendant 5 min, remettre en suspension dans 1 mL de milieu frais, mélanger 10 μL avec 0,4 % de bleu de trypan (1:1), compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre, calculer la masse volumique et ajuster à 2 x 105 cellules/mL.
  2. Ensemencer 2 x 105 cellules par puits dans une plaque de 12 puits et cultiver pendant 24 h. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2.
  3. Traitez les cellules avec une suspension GB (300 μL par puits) pendant différentes durées : 30 min, 1 h et 12 h. Après le traitement, lavez les cellules 5 fois avec du PBS pour éliminer les particules en excès.
  4. Trypsinisez les cellules comme à l’étape 1.3 et lavez-les soigneusement avec du PBS. Chargez la suspension préparée dans l’orifice d’échantillonnage du cytomètre en flux. Lancez le logiciel et sélectionnez les paramètres d’acquisition appropriés. Choisissez le mode Champ clair pour l’imagerie.
  5. Lancez l’acquisition des données en cliquant sur Exécuter dans le logiciel. Acquérez des données pour au moins 10 000 événements pendant que le système capture des images des cellules individuelles passant à travers la cellule d’écoulement.
  6. Utilisez des nuages de points en fonction de l’aire et du rapport d’aspect pour bloquer des cellules intactes. Cela permet d’exclure les doublets et les clusters. Affichez les images correspondantes dans la bibliothèque d’images. Collectez des images cellulaires individuelles à partir de la bibliothèque d’images du logiciel pour étudier les changements morphologiques induits par le traitement.
  7. Pour l’analyse des particules, ensemencer 2 x 105 cellules par puits dans des plaques de 12 puits et cultiver pendant 24 h. Traitez les cellules avec une suspension GB (300 μL par puits) pendant différentes durées : 1 h, 7 h, 14 h et 24 h.
  8. Après le traitement, agitez doucement la plaque de culture pendant 1 min et recueillez le milieu de culture dans des tubes de 1,5 ml. Lavez les cellules 5 fois avec du PBS pour éliminer toutes les particules extracellulaires.
  9. Ajouter 500 μL de tampon RIPA (20 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 150 mM NaCl ; 0,1 % Triton X-100 ; 1 % de désoxycholate de sodium) pour lyser complètement les cellules.
  10. Faites passer séparément le milieu de culture et les échantillons de cellules lysées contenant des particules dans le cytomètre en flux. Chargez les échantillons dans le port d’échantillonnage du système. Lancez le logiciel et sélectionnez les paramètres d’acquisition appropriés. Choisissez le mode Champ clair pour l’analyse des particules.
  11. Lancez l’acquisition des données en cliquant sur Exécuter dans le logiciel. Acquérez des données pour au moins 20 000 événements pendant que le système capture des images de particules individuelles passant à travers la cellule d’écoulement.
  12. Utilisez des nuages de points en fonction de l’aire et du rapport d’aspect pour bloquer toutes les particules. Utilisez les outils de nuage de points pour analyser le nombre de particules.

4. Microscopie à intervalle de temps

  1. Cultivez des cellules 3T3-L1 (3,0 x 104) dans une boîte de 35 mm avec 2 mL de DMEM à 37 °C dans un CO2 à 5 % jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 % de confluence.
  2. Mélangez soigneusement 300 μL de suspension GB dans le milieu de culture frais préchauffé de 2 mL, puis placez la boîte de culture avec les cellules et GB sur la platine du microscope d’imagerie.
  3. Sélectionnez l’objectif x10. Allumez l’éclairage en fond clair à l’aide du bouton Bright. Cliquez sur le bouton Vidéo pour passer en mode time-lapse. Réglez l’intervalle sur 5 min. Démarrez l’enregistrement en cliquant sur le bouton Rec .
  4. Capturez des images toutes les 5 minutes pendant 16 h à 24 h, en assurant une imagerie continue dans des conditions standard dans un incubateur de CO2 .
  5. Utilisez le logiciel ImageJ pour compiler les images capturées dans une vidéo time-lapse. Cette technique permet de différencier les différents stades de la phagocytose, de l’internalisation à la dégradation complète des particules.

5. Coloration rouge neutre

  1. Après 24 h de croissance cellulaire dans des plaques de 96 puits et des lames de cavité, mélangez soigneusement la matière en suspension de particules GB et ajoutez 30 μL de la suspension dans chaque puits ou cavité.
  2. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h pour induire la formation de vacuoles. Utilisez des puits ou des cavités non traités comme témoins négatifs.
  3. Pour la coloration en rouge neutre (NR), préparez une solution de NR à 0,5 mg/mL dans du DMEM sans sérum et filtrez-la à travers un filtre de 0,2 μm.
  4. Pour l’imagerie des vacuoles dans les plaques à 96 puits et la lame de cavité : retirer le support, ajouter 60 μL de colorant NR et incuber à 37 °C pendant 15 min. Lavez 3 fois avec du PBS pour enlever l’excès de colorant, puis procédez à l’imagerie microscopique.
  5. Examinez les vacuoles au microscope à l’aide de l’objectif 20x, afin d’évaluer la taille, la morphologie et le nombre de vacuoles.

6. Traitement par la bafilomycine A1 pour la formation de vacuoles et l’inhibition de l’acidification

  1. Préparer une solution mère de bafilomycine A1 (BFA1) à une concentration de 100 μg/mL (160,5 nM) en dissolvant 100 μg de BFA dans 50 μL de DMSO, puis en diluant 950 μL de DMEM. Diluer 1 μL de cette substance dans 1,6 mL de DMEM pour obtenir une solution de travail de 0,1 nM.
  2. Bien mélanger et ajouter 100 μL de la solution BFA fonctionnelle dans les puits contenant des cellules dans les plaques de 96 puits. Ajouter également 30 μL de suspension de particules GB pour évaluer l’inhibition de la formation de vacuoles et de phagosomes.
  3. Pour inhiber l’acidification des phagosomes, ajoutez 100 μL de la solution de travail BFA dans les puits avec des vacuoles préformées (préalablement traitées avec des particules GB). Incuber tous les puits à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h.
  4. Ajoutez 60 μL de colorant rouge neutre (NR) dans chaque puits, incubez pendant 15 minutes supplémentaires et analysez la formation et l’acidification des vacuoles.

7. Coloration à l’orange acridine (AO)

  1. Traitez les cellules cultivées dans des lames de cavité avec 50 μL de GB et incubez pendant la nuit dans des conditions expérimentales standard.
  2. Après le traitement, incuber les cellules avec une solution d’orange acridine (1 mg/mL) pendant 15 min à 37 °C pour permettre une coloration sélective des vacuoles et des organites vésiculaires acides.
  3. Lavez les cellules 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) pour éliminer le colorant non lié et minimiser la fluorescence de fond.
  4. Analysez rapidement les lames à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un objectif 20x et d’un filtre d’excitation bleu de 450 à 492 nm, afin d’évaluer la morphologie cellulaire et l’absorption de l’orange d’acridine, ce qui vous permettra de mieux comprendre la dynamique vacuolaire.

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Résultats

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L’étude met en évidence les principales réponses cellulaires aux particules de GB dans les cellules de mammifères. Nous avons utilisé un cytomètre de flux d’imagerie pour étudier l’internalisation des particules GB dans les cellules 3T3-L1 (Figure 1). Les cellules ont été exposées à des particules pendant des durées allant de 30 min à 12 h. Après 30 min, nous avons observé les particules à la surface de la cellule (Figure 1B), et la membrane cellulaire a commenc...

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Discussion

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La phagocytose est un mécanisme de défense immunitaire crucial, permettant l’engloutissement et l’élimination ultérieure des particules, des agents pathogènes et des cellules apoptotiques. Pour comprendre les processus de formation et de maturation des phagosomes, des particules biocompatibles intelligentes combinées à des techniques d’imagerie avancées sont essentielles pour étudier des événements dynamiques tels que la progression vacuolaire, l’acidification et la dégradation des matér...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été soutenue par la subvention de recherche de base du Conseil de recherche en sciences et en ingénierie (SERB) (CRG/2022/009045), Département des sciences et de la technologie, gouvernement de l’Inde.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flacons de culture de 25 cm2NEST, Inde707001
Plaques à 96 et 6 puitsTarsons India Pvt. Ltd., Kolkata, Inde ; Thermo Scientific, Inde980040; 140675
Orange acridineSRL, Inde82407
Antibiotiques et solution trypsine-EDTAHigh Media, Inde628242; 655111
Lignées cellulaires - HeLa, 3T3-L1 et RAW-264.7Centre national pour la science cellulaire (NCCS), Pune, Maharastra
Boîtes de culture (35mm)  ;SPL Lifesciences, Inde101350
Dulbecco' s milieu Eagle modifié (DMEM)MP Biomedicles, Inde1033126
Sérum fœtal bovin (FBS)High Media, Inde651257
Cytomètre en fluxMillipore, États-UnisAmnisCytomètres de flux d’imagerie Amnis,
Microscope à fluorescenceDiGi Lab, IndeModèle : DiGi 110 Infinity
Godanti BhasmaPatanjali Ayurved240002
Colorant rouge neutreCDH, Inde593630
Microscope à accéléréNanoEnTek Inc.  ; Séoul, Corée.JuliAnalyseur de cellules fluorescentes intelligent JuLi,
Microscope à accéléréLEEDZ MICRO IMA. ROYAUME-UNIS.No. LIM225552358A58EA PRIME Microscope inversé

Références

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Mots-clés

Voie de la phagocytoseinternalisation de particulesformation de vacuolescytom trie en fluximagerie de cellules vivantesmarquage au rouge neutremarquage l orange d acridinematuration du phagosome

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