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Article de méthode

Le séquençage de l’ARN révèle la voie de différenciation des cellules Th17 en tant que mécanisme de lésions cérébrales induites par les radiations

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DOI :

10.3791/68322

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20 juin 2025

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1Beijing Institute of Radiation Medicine

Dans cet article

Résumé

Cette étude vise à étudier l’activation de la voie de différenciation des cellules Th17 chez des souris atteintes de lésions cérébrales induites par les radiations.

Résumé

La radiothérapie est une modalité thérapeutique répandue pour les tumeurs malignes de la tête et du cou ; cependant, elle entraîne invariablement des lésions radio-induites aux tissus cérébraux normaux, aboutissant à des lésions cérébrales radio-induites (RBI). Malgré des recherches approfondies sur la neuroinflammation radio-induite, l’association entre RBI et la voie de différenciation des cellules Th17 reste insuffisamment comprise. Les souris C57BL/6 ont subi une seule administration d’irradiation crânienne de 30 Gy pour développer le modèle RBI. La fonction cognitive a été évaluée à l’aide du labyrinthe d’eau de Morris (MWM), d’un test en champ ouvert, d’un test de reconnaissance d’objets nouveaux et d’un test de rotation. Les altérations histopathologiques du tissu cérébral ont été analysées à l’aide de la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E). La coloration par immunofluorescence a été utilisée pour évaluer l’activation de la microglie (IBA-1) et des astrocytes (GFAP). Le séquençage de l’ARN a été effectué pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle, tandis que Simple Western et la qPCR ont été utilisés pour examiner les molécules de signalisation clés impliquées dans la différenciation des cellules Th17. Les souris RBI ont présenté des déficits cognitifs marqués, en particulier dans l’apprentissage spatial et la rétention de la mémoire. L’examen histologique a indiqué l’activation de la microglie et des astrocytes dans le cortex et l’hippocampe de souris irradiées. L’analyse du séquençage de l’ARN a identifié un enrichissement significatif de la voie de différenciation des cellules Th17 dans le cortex du groupe RBI. D’autres validations par des analyses Simple Western et qPCR ont confirmé la régulation positive de TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 et P-STAT3 dans le cortex des souris RBI. Ces résultats suggèrent que la voie de différenciation des cellules Th17 a joué un rôle central dans la pathogenèse des lésions cérébrales induites par les radiations. La neuroinflammation médiée par les cellules Th17 peut être un mécanisme critique sous-jacent au dysfonctionnement cognitif induit par les radiations.

Introduction

La radiothérapie est un traitement crucial pour les tumeurs primaires et métastatiques de la tête et du cou, mais les lésions cérébrales radio-induites (RBI) peuvent survenir comme une complication grave, caractérisée par des lésions du système nerveux central. L’incidence de l’IBR varie selon le type de tumeur et la modalité de traitement, avec des taux rapportés allant de 28 % à 50 % après une radiothérapie stéréotaxique pour les méningiomes1, 1,9 % à 5 % pour le carcinome nasopharyngé 2,3, 1 % à 24 % pour les gliomes de bas grade 4,5 et 8 % à 20 % pour les métastases cérébrales 6,7. L’IBR est classée en types aigus, retardés précoces et retardés, les dysfonctionnements cognitifs, en particulier les troubles de la mémoire, et les déficits d’apprentissage étant prédominants dans la forme tardive retardée. Le dysfonctionnement cognitif radio-induit (RICD), qui touche 50 à 90 % des survivants à long terme des cancers de la tête et du cou, a un impact significatif sur la qualité de vie8, mais sa pathogenèse reste mal comprise et il n’existe pas de stratégies préventives et thérapeutiques efficaces.

La neuroinflammation est une caractéristique pathologique clé de l’IBR, exacerbant la perturbation de la barrière hémato-encéphalique et entravant la neurogenèse dans l’hippocampe. Les cellules Th17, un sous-ensemble des lymphocytes T CD4+ connus pour produire la cytokine pro-inflammatoire IL-179, ont été associées à diverses maladies neurodégénératives, notamment la sclérose en plaques et la maladie de Parkinson10,11. Ces cellules, dans certaines conditions inflammatoires, peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique et contribuer à la neuroinflammation12. Depuis leur découverte en 2005, les cellules Th17 ont attiré l’attention pour leur rôle à la fois dans les réponses immunitaires contre les agents pathogènes et leur implication dans les maladies inflammatoires, ce qui en fait une cible potentielle pour l’étude des mécanismes de l’IBR et des dysfonctionnements cognitifsassociés13.

Dans cette étude, seules des souris mâles ont été utilisées. L’exclusion des femelles visait à éviter les effets confusionnels potentiels résultant des fluctuations neuro-inflammatoires associées au cycle œstral, car les niveaux de progestérone peuvent varier jusqu’à dix fois entre les différentes phases du cycle14. De plus, notre modèle expérimental a été conçu pour refléter le contexte clinique de la radiothérapie du cancer de la tête et du cou, dans laquelle environ 72 % des patients sont des hommes15. Dans le même ordre d’idées, la majorité des études publiées portant sur les mécanismes des lésions cérébrales radio-induites (RBI) ont utilisé des rongeurs mâles pour établir des caractéristiques pathologiques de base16.

Bien que divers modèles aient été utilisés pour étudier la RBI, les méthodologies traditionnelles telles que la coloration histopathologique et le simple transfert Western se heurtent à des limites en termes de sensibilité, de débit et de précision17. Des avancées récentes telles que le séquençage de l’ARN (RNA-Seq) et la protéomique à haut débit ont fourni des informations plus robustes sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à RBI18. Ces technologies permettent une compréhension complète des changements d’expression génique et des altérations des protéines, fournissant des données plus précises que les méthodes précédentes19. Simple Western, en particulier, est une technique nouvelle et automatisée qui combine les avantages de l’électrophorèse capillaire avec la détection des protéines par chimiluminescence, facilitant l’analyse à haut débit avec un volume d’échantillon minimal et une reproductibilité accrue20. Par rapport au transfert Western traditionnel, Simple Western élimine le besoin de transfert membranaire et fournit des données quantitatives sur l’expression des protéines, offrant plusieurs avantages en termes de sensibilité et de reproductibilité, en particulier dans la détection des protéines de faible abondance21,22.

Des directives pratiques pour l’extraction et la préparation de l’ARN sont cruciales pour le succès d’un séquençage et d’une quantification de haute qualité. Pour une extraction optimale de l’ARN, nous vous recommandons d’utiliser des kits d’isolement d’ARN de haute qualité et de vous assurer que la concentration se situe dans la plage de 100 à 1000 ng/μL, avec un indice d’intégrité de l’ARN (RIN) supérieur à 7,0 pour éviter la dégradation. Lors de l’analyse des protéines à l’aide de Simple Western, il est important de s’assurer que les échantillons de protéines sont correctement dénaturés et chargés à une concentration d’environ 1 à 5 μg par capillaire. Pour la validation de la qPCR, utilisez de l’ADNc de haute qualité synthétisé à partir d’au moins 1 μg d’ARN, garantissant des conditions de transcription inverse cohérentes. Les pièges courants dans la préparation de l’ARN, tels que la contamination par l’ADN génomique ou la dégradation de l’ARN, doivent être évités en utilisant un équipement sans ARNASE et en effectuant rapidement une séparation de phase pour prévenir la dégradation de l’ARN.

En intégrant ces méthodes, cette étude vise à déterminer si la voie de différenciation des cellules Th17 est activée dans des modèles murins de RBI et comment elle contribue à la pathogenèse du dysfonctionnement cognitif induit par les radiations.

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Protocole

Les procédures expérimentales menées ici sont strictement conformes aux directives ARRIVE (Animal Research : Reporting of In Vivo Experiments). L’approbation a été obtenue du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut de médecine radiologique de Pékin (approbation n°. AF/SC-08/02 ; Date : 25 février 2024).

1. Irradiation crânienne de souris

  1. Utilisez un total de 10 souris mâles C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines dans l’étude, en répartissant cinq animaux dans le groupe RBI et cinq dans le groupe témoin, où le groupe témoin est constitué de souris témoins vierges qui n’ont pas reçu de RBI. Maintenez les souris dans des conditions environnementales contrôlées, y compris une température et une humidité régulées et un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Acclimatez les souris pendant 1 semaine avant de commencer l’expérience.
  2. Anesthésier les animaux à l’aide d’une injection intrapéritonéale de 1 % de pentobarbital sodique à 50 mg/kg de poids corporel. Confirmez la bonne anesthésie en vérifiant l’absence de réponse réflexe à un pincement ferme de la patte. Appliquez une pommade ophtalmique vétérinaire sur les deux yeux immédiatement après le début de l’anesthésie pour prévenir le dessèchement de la cornée.
  3. Placez les animaux en position couchée à l’aide d’un dispositif de contention en bois dédié et couvrez les zones non ciblées du corps avec une plaque de blindage en plomb (Pb) de 3 mm d’épaisseur (pureté de 99,9 %) pour assurer une irradiation localisée.
  4. Collimater le champ d’irradiation de 2 x 2 cm2 avec filtration inhérente (1,5 mm Al + 0,25 mm Cu). Alignez le champ sur la ligne médiane du crâne à l’aide d’un réticule laser intégré (λ = 635 nm ± précision de 0,5 mm) et vérifiez le positionnement en temps réel avec un système de caméra CMOS intégré et un rétroéclairage IR. Irradier la région crânienne avec une dose unique de rayons X de 30 Gy à 1,325 Gy/min à l’aide d’un système X-RAD 320 sous les paramètres suivants : 320 kVp/12,5 mA, SSD = 50 cm.
  5. Effectuez un étalonnage hebdomadaire de la dose à l’aide d’une chambre d’ionisation traçable positionnée sur l’isocentre. Maintenir les paramètres du faisceau à 320 kVp/12,5 mA avec une filtration HVL de 3,2 mm Cu pour atteindre un débit de dose de 1,325 Gy/min (± variation de 3 %). Vérifiez quotidiennement l’uniformité du faisceau (> 95 % sur le terrain) à l’aide du film Gafchromic EBT3.
  6. Administrer du méloxicam (1-2 mg/kg, par voie sous-cutanée) une fois par jour pendant 3 jours pour gérer la douleur post-chirurgicale. Placez les animaux dans une chambre de récupération préchauffée et surveillez-les en permanence jusqu’à ce qu’ils retrouvent leur pleine conscience et puissent maintenir leur décubitus sternal. Ne laissez pas les animaux sans surveillance pendant la période de récupération.
  7. Enregistrez le poids corporel de toutes les souris chaque semaine tout au long de l’étude. Observez les souris pendant un total de 4 semaines, dont 1 semaine d’acclimatation et 3 semaines après l’irradiation.

2. Analyse du comportement animal

  1. Effectuez des expériences comportementales 3 semaines après RBI.
  2. Labyrinthe d’eau Morris
    1. Remplissez une piscine circulaire (diamètre : 120 cm, hauteur : 50 cm) avec de l’eau opaque (20-22 °C) avec du lait en poudre pour masquer la plate-forme immergée. Placez une plate-forme cachée (diamètre : 10 cm) à 1 cm sous la surface de l’eau dans un quadrant fixe.
    2. Acclimatez les souris à la salle d’essai pendant au moins 30 minutes avant les essais. Commencez la phase d’entraînement en plaçant chaque souris dans l’eau à partir de l’un des quatre points de départ choisis au hasard (N, S, E, W).
    3. Laissez la souris nager jusqu’à 60 s pour localiser la plate-forme cachée. Si la souris ne parvient pas à trouver la plate-forme dans les 60 s, guidez-la jusqu’à la plate-forme et laissez-la y rester pendant 15 s.
    4. Effectuez quatre essais par jour et par souris avec un intervalle de 15 minutes entre les essais. Séchez soigneusement chaque souris avec une serviette chaude entre les essais pour éviter l’hypothermie. Poursuivre la formation pendant 5 jours consécutifs pour évaluer l’acquisition des apprentissages.
    5. Le jour de l’essai de la sonde, retirez la plate-forme et laissez la souris nager librement pendant 60 s. Enregistrez des paramètres tels que le temps passé dans le quadrant cible, les croisements de plates-formes et les trajectoires de nage.
    6. Suivez et analysez tous les essais à l’aide d’un système de suivi vidéo automatisé avec des expérimentateurs aveugles à l’attribution des groupes.
  3. Test en champ ouvert
    1. Acclimatez les souris à la salle d’essai pendant au moins 30 minutes avant l’expérience. Utilisez un appareil à champ ouvert (50 cm x 50 cm x 40 cm) en plastique opaque. Illuminez l’arène uniformément (généralement de 25 à 30 lux) pour éviter les ombres fortes et minimiser le stress.
    2. Nettoyez l’arène avec de l’éthanol à 70 % avant de tester chaque animal pour éliminer les signaux d’odeur. Placez doucement la souris au centre du champ ouvert pour commencer le test. Laissez la souris explorer librement l’arène pendant 10 min.
    3. Enregistrez l’activité locomotrice et la position à l’aide d’un système de suivi automatisé. Définissez la zone centrale comme étant les 20 à 25 % intérieurs de la surface totale. Mesurez le temps passé dans la zone centrale et la distance totale parcourue.
    4. Après la session, remettez la souris dans sa cage d’accueil et nettoyez soigneusement l’appareil.
  4. Nouveau test de reconnaissance d’objets
    1. Acclimatez les souris à la salle d’essai pendant au moins 30 minutes avant l’expérience. Utilisez un manège en plein air (50 cm x 50 cm x 40 cm) avec un éclairage uniforme (20-30 lux). Nettoyez soigneusement l’arène avec de l’éthanol à 70 % entre les animaux pour éliminer les signaux olfactifs.
    2. Placez chaque souris dans l’arène vide et laissez-la explorer librement pendant 10 min. Ne placez aucun objet pendant cette phase.
    3. Après 24 h, placez deux objets identiques (A et A') dans les coins opposés de l’arène (à au moins 8 cm des murs). Placez doucement la souris au centre de l’arène et laissez-la explorer pendant 10 min.
    4. Enregistrez l’interaction avec les objets à l’aide d’un système vidéo automatisé. Définissez l’exploration d’un objet comme le fait que le museau de la souris se trouve à moins de 2 cm de l’objet lorsqu’il est orienté vers lui.
    5. Remettez la souris dans sa cage d’origine après l’essai et nettoyez l’arène et les objets.
    6. Après un intervalle de rétention de 1 h, placez un objet familier (A) et un objet nouveau (B) dans les mêmes positions. Remettez la souris dans l’arène et laissez-la explorer pendant 5 min.
    7. Enregistrez le temps passé à explorer chaque objet en utilisant les mêmes critères que précédemment. Calculez l’indice de reconnaissance comme suit :
      Indice de reconnaissance ( %) = [Temps passé sur l’objet roman / (Temps passé sur l’objet roman + objet familier)] x 100
  5. Test du Rotarod
    1. Acclimatez les souris à la salle d’essai pendant au moins 30 minutes avant le test. Utilisez un appareil rotatif motorisé avec un diamètre de tige de ~3 cm et une hauteur de ~30 cm au-dessus de la base.
    2. Réglez le mode de rotation sur la vitesse d’accélération (de 4 tr/min à 40 tr/min sur 5 min). Nettoyez la surface de la tige avec de l’éthanol à 70 % avant de placer chaque souris.
    3. Placez doucement la souris au centre de la tige rotative, face à l’avant. Démarrez la rotation et commencez le chronométrage immédiatement.
    4. Enregistrez la latence pour qu’elle diminue automatiquement par le système. Attrapez la souris en toute sécurité en cas de chute pour éviter de vous blesser. Prévoyez une période de repos d’au moins 15 minutes entre les essais pour éviter la fatigue.
    5. Effectuez 3 essais consécutifs par souris et par jour et faites la moyenne de la latence comme résultat final. Assurez-vous que tous les tests sont effectués par des expérimentateurs à l’insu dans des conditions constantes. Remettez la souris dans sa cage d’origine après l’avoir testée et désinfectez soigneusement l’appareil.

3. Euthanasie animale et préparation des échantillons

  1. Prélever des échantillons de tissus 5 semaines après l’IBR.
  2. Préparez du pentobarbital sodique (100 mg/kg) et une seringue stérile. Injecter du pentobarbital sodique par voie intrapéritonéale. Attendez que la souris cesse de respirer et que le rythme cardiaque cesse, confirmant la mort.
  3. Décapitez rapidement au niveau de la jonction occipitale et incisez sagittairement les sutures crâniennes à l’aide de ciseaux fins, puis élevez soigneusement les lambeaux crâniens bilatéraux avec des pinces incurvées tout en préservant l’intégrité méningée avant de sectionner les connexions neuronales.
  4. Transférez le cerveau intact dans une matrice pré-refroidie dans les 60 s pour la bissection médio-sagittale à l’aide de lames de rasoir stériles. Enregistrez immédiatement les dimensions antéropostérieures (8,2 ± 0,3 mm), la largeur médiolatérale (4,5 ± 0,2 mm) et la masse tissulaire (112 ± 8 mg) à l’aide d’instruments de précision.
  5. Disséquez les tissus corticaux et hippocampiques sur de la glace. Congélation instantanée de l’hémisphère gauche dans de l’azote liquide pour le séquençage de l’ARN, la qPCR et le Simple Western.
  6. Fixez l’hémisphère droit dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pour l’histologie. Déshydratez les cerveaux fixes dans de l’éthanol gradué de 70 % à 100 %, chaque étape durant 30 min.
  7. Nettoyez la cervelle dans le xylène pendant 2 h. Infiltrer les tissus avec de la paraffine fondue à 60°C pendant 4 h. Incorporez les cerveaux nettoyés dans des blocs de paraffine et laissez-les se solidifier à température ambiante. Découpez des coupes coronales d’une épaisseur de 5 μm à l’aide d’un microtome.

4. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine

  1. Déparaffiniser des sections de tissus en immergeant les lames dans du xylène pendant 5 min, 3x. Réhydratez les sections à l’aide d’une série d’éthanol gradué : 100 %, 95 %, 70 % et de l’eau distillée, pendant 5 minutes chacune.
  2. Teindre les sections avec de l’hématoxyline pendant 5 min, en fonction de l’intensité de coloration souhaitée. Rincez les sections à l’eau courante du robinet pendant 5 minutes pour éliminer l’excès d’hématoxyline.
  3. Différenciez les sections dans de l’acide chlorhydrique à 1 % dans de l’éthanol pendant quelques secondes pour obtenir le contraste souhaité. Rincer à nouveau à l’eau courante du robinet pendant 5 min. Colorer les sections avec de l’éosine pendant 1 min.
  4. Rincez brièvement les sections à l’eau distillée. Déshydratez les sections à l’aide d’une série d’éthanol gradué : 70 %, 95 % et 100 %, pendant 5 min chacune.
  5. Nettoyer les sections de xylène pendant 5 min, 3x. Montez les sections à l’aide d’une lamelle à l’aide d’un support de montage. Acquérez des images à l’aide d’un microscope Nikon Eclipse Ni-U avec un objectif 20x.

5. Immunofluorescence

  1. Fixez le tissu en immergeant les lames dans 4 % de PFA pendant 15 min à température ambiante. Lavez les lames dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 min, 3x, pour éliminer l’excès de PFA.
  2. Perméabiliser le tissu en incubant des lames avec 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. Bloquez la liaison non spécifique en incubant les lames avec 5 % de sérum normal pendant 1 h à température ambiante.
  3. Incuber avec les anticorps primaires IBA-1 et GFAP, dilués dans un tampon bloquant à une dilution de 1:2000, toute la nuit à 4 °C, selon les spécifications de l’anticorps. Lavez les lames dans du PBS pendant 5 min, 3x, pour éliminer l’anticorps primaire non lié.
  4. Incuber avec l’anticorps secondaire IgG anti-lapin de chèvre conjugué à Alexa Fluor 488, dilué à 1:1000 pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Lavez les lames dans du PBS pendant 5 min, 3x, pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires.
  5. Montez les diapositives à l’aide d’un support de montage anti-décoloration contenant du DAPI. Scellez la lamelle avec du vernis à ongles transparent.
  6. Capturez des images de fluorescence à l’aide d’un système de microscope confocal avec un objectif 20x.
  7. Quantifiez l’intensité de la fluorescence à l’aide d’ImageJ. Effectuez une analyse quantitative à l’aide de l’outil Analyser les particules d’ImageJ avec des seuils de taille de 50-200 μm2 (microglie) et 100-500 μm2 (astrocytes). Soustrayez l’arrière-plan à l’aide de l’algorithme Rolling Ball (rayon = 50 pixels).

6. Analyse qPCR

  1. Extrayez l’ARN total du tissu à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN. Suivez le protocole du fabricant pour l’homogénéisation, la lyse et la purification de l’ARN.
  2. Quantifier l’ARN extrait à l’aide d’un spectrophotomètre pour mesurer la concentration et évaluer la pureté (rapport A260/A280). S’assurer que la concentration d’ARN est appropriée pour la synthèse de l’ADNc (100-500 ng/μL).
  3. Évaluez la qualité de l’ARN à l’aide d’un bioanalyseur. Assurez-vous que l’ARN ne présente aucune dégradation (bandes pointues pour l’ARNr 18S et 28S) et qu’il a un indice d’intégrité de l’ARN (RIN) supérieur à 7.
  4. Préparez un mélange réactionnel de 20 μL avec 1 μg d’ARN, un tampon de transcription inverse, des oligo-dT, des dNTP, un inhibiteur de RNase et une transcriptase inverse.
  5. Incuber à 42 °C pendant 60 min pour synthétiser l’ADNc. Chauffer à 85 °C pendant 5 min pour inactiver la transcriptase inverse.
  6. Combinez de l’ADNc, un mélange maître, une amorce directe, une amorce inverse (tableau 1) et de l’eau sans nucléases dans une plaque PCR à 96 puits. Utilisez 2 μL d’ADNc par réaction de 20 μL et assurez-vous d’une concentration finale d’amorce de 200 nM. Scellez la plaque avec un film adhésif optique pour éviter l’évaporation.
GèneSéquence d’amorces (5'-3', avant/arrière)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TAGGGGACGTGGGTCATCAC
L’IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
L’IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
L’IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

Tableau 1 : amorces de séquence qPCR.

  1. Placez la plaque de réaction dans un instrument de PCR en temps réel et programmez le thermocycleur. Utilisez les conditions de cycle suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, suivie de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et de 60 °C pendant 30 s.
  2. Normaliser l’expression des gènes cibles en GAPDH. Calculez les niveaux d’expression relatifs à l’aide de la méthode ΔΔCt et présentez les données sous forme de changements de pli par rapport au groupe témoin.

7. Analyse du séquençage de l’ARN

  1. Anesthésier et euthanasier la souris en suivant les protocoles de soins aux animaux de l’établissement. Perfuser immédiatement avec du PBS froid pour éliminer le sang en circulation.
  2. Disséquez le cerveau sur de la glace. Isolez le cortex cérébral à l’aide d’outils de dissection stériles. Minimisez le temps de dissection pour préserver l’intégrité de l’ARN.
  3. Congelez le tissu cortical dans de l’azote liquide. Conserver à -80 °C si l’extraction de l’ARN n’est pas effectuée immédiatement.
  4. Homogénéiser le cortex congelé (30-50 mg) dans 1 mL de réactif d’extraction d’ARN à l’aide d’un homogénéisateur motorisé jusqu’à ce qu’il ne reste plus de fragments visibles.
  5. Effectuer la séparation de phase du chloroforme. Ajouter 200 μL de chloroforme, agiter vigoureusement pendant 15 s, incuber pendant 2-3 min à température ambiante, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  6. Transférez la couche supérieure dans un nouveau tube, ajoutez un volume égal d’éthanol à 70 % et procédez à la purification de l’ARN à l’aide d’un kit basé sur une colonne de silice.
  7. Utilisez la digestion de la DNase sur colonne pour éliminer l’ADN génomique lors de la purification de l’ARN. Prélever l’ARN total dans 30 à 50 μL et conserver sur de la glace pour une utilisation immédiate.
  8. Utilisez un spectrophotomètre pour quantifier la concentration et la pureté de l’ARN. Confirmez le rapport A260/A280 de ~2,0. Analysez 1 μL d’ARN sur un bioanalyseur. Assurez-vous que le RIN est supérieur à 8,0 pour le séquençage.
  9. Utilisez un protocole de sélection poly(A) et un kit de préparation de bibliothèque échouée. Suivez le protocole du fabricant pour générer des bibliothèques de 300 à 400 pb. Purifiez les bibliothèques avec un kit commercial.
  10. Utilisez un bioanalyseur pour confirmer la taille des fragments et quantifier avec des bibliothèques de pool de manière équimolaire. Effectuez un séquençage des extrémités appariées (2x, 150 pb) à l’aide d’une plate-forme Illumina.
  11. Coupez les adaptateurs à l’aide de Trim Galore, évaluez la qualité avec FastQC, alignez les lectures sur le génome de la souris (GRCm39) à l’aide de STAR et quantifiez l’expression des gènes avec featureCounts. Identifiez les gènes exprimés de manière différentielle à l’aide de DESeq2.
  12. Utilisez la sortie de DESeq2 et filtrez les gènes DEG exprimés de manière significativement différentielle (valeur p ajustée < 0,05 et |log2FC| > 1). Effectuez une analyse d’enrichissement des voies GO et KEGG à l’aide de Phyper sur la base du test hypergéométrique. Identifier les trajectoires dont la valeur P corrigée est ≤ 0,05 comme étant statistiquement significatives.

8. Analyse occidentale simple

  1. Homogénéiser le cortex cérébral de la souris dans un tampon RIPA avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris. Déterminer la concentration en protéines à l’aide d’un dosage BCA.
  2. Dénaturer les échantillons de protéines en les mélangeant avec un tampon d’échantillon et en les incubant à 95°C pendant 5 min pour assurer une dénaturation complète.
  3. Chargez des échantillons de protéines dénaturées de 3 μL dans les capillaires Simple Western. Assurez-vous que les échantillons sont correctement chargés pour éviter tout débordement. Placez les capillaires dans l’instrument Simple Western.
  4. Incuber les protéines séparées avec des anticorps primaires dilués à l’aide d’anticorps dilués à l’échelle 1:50, y compris p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 et IL-17, pendant 30 min.
  5. Laver le système capillaire avec un tampon de lavage pendant trois lavages de 5 minutes chacun pour éliminer les anticorps primaires non liés. Ajouter l’anticorps secondaire conjugué à la HRP dilué dans un tampon bloquant et incuber pendant 30 min.
  6. Effectuez 3 lavages de 5 minutes chacun avec un tampon de lavage pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires. Exécutez le programme de détection sur le système Simple Western pour détecter automatiquement les protéines à l’aide de la chimiluminescence.
  7. Analysez les données à l’aide du logiciel Compass for Simple Western. Quantifiez l’expression de la protéine en comparant les zones de pics relatives dans l’électrophérogramme. Normaliser les données en fonction de la protéine GAPDH.

9. Analyse statistique

  1. Ouvrez GraphPad Prism 9.0.0. logiciel. Cliquez sur Fichier > Importer des données pour le chargement des données. Présentez les données sous forme de moyens ± écart-type. Utilisez le test t non apparié pour les comparaisons entre deux groupes.
  2. Évaluez la normalité à l’aide du test de Shapiro-Wilk. Si la normalité n’est pas respectée (p < 0,05), appliquer le test U de Mann-Whitney pour les comparaisons entre groupes. Si la normalité est satisfaite (p ≥ 0,05), effectuez un test t d’échantillons indépendants pour évaluer les différences entre les groupes.
  3. Rapportez les résultats avec des valeurs p. Considérons p < 0,05 comme statistiquement significatif. Utilisez la notation suivante : n.s. pour non significatif, * pour p < 0,05, ** pour p < 0,005, *** pour p < 0,0005 et **** pour p < 0,0001.

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Résultats

Troubles cognitifs chez les souris RBI
Après l’exposition à une irradiation de 30 Gy sur l’ensemble du cerveau, le poids corporel des souris a été surveillé sur une base hebdomadaire. La fonction cognitive a été évaluée au cours de la 4e semaine (Figure 1A). Les premières mesures ont indiqué que les poids corporels des groupes témoins et RBI étaient similaires. Cependant, entre 1 et 3 semaines après l’irradiation, le groupe RBI ...

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Discussion

Étapes critiques du protocole
Ce protocole implique l’induction de l’IBR chez la souris, suivie d’évaluations complètes de la neuroinflammation et de la voie de différenciation des cellules Th17 (Figure 6). Une étape critique est l’irradiation crânienne de souris C57BL/6 avec une dose de 30 Gy, un modèle bien établi pour RBI1. L’étalonnage précis de la dose à l’aide de chambres d’ionisation garantit la reproductibi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

L’Institut de médecine radiologique de Pékin a soutenu ces travaux

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Module de séparation 12-230 kDa, 8 x 25 cartouches capillairesProteinSimpleSM-W004pour
anticorps anti-GAPDHSimpleWestern ProteintechHRP-60004dilution/anticorps 1:500 pour
anticorps anti-GFAPSimpleWestern Abcamab7260dilution/anticorps 1:2000 pour
anticorps anti-IBA-1Abcamab178846Dilution/anticorps 1:2000 pour immunofluorescence
anti-IL-17 Anticorps A/FThermoMA5-23748Dilution/anticorps 1:10 pour SimpleWestern
anti-IL-1&beta ;anticorps CST12242Dilution/anticorps 1:50 pour
anticorps anti-IL-6SimpleWestern ThermoMA5-23800dilution/anticorps 1:5 pour
modulede détection anti-souris SimpleWesternProteinAnticorpssimple DM-002
anti-P-STAT3 (Try705)de SimpleWestern ThermoMA5-15193dilution/anticorps 1:2 pour
le module de détection anti-lapinProteinAnticorps secondaire SimpleDM-001pour l’anti-ROR
&gamma de SimpleWestern ; Anticorps Thermo14-6988-82Dilution/anticorps 1:5 pour
l’anticorps anti-STAT3Thermo710077dilution/anticorps 1:20 pour
l’anticorps anti-TGF &beta ;-1,2,3ThermoMA5-23795Dilution/anticorps 1:10 pour
dosage BACSimpleWestern DosagesprotéiquesA55860
EZ Standard Pack 1 12-230 kDaProteinSimplePS-ST01EZ-8pour SimpleWestern
Goat Anti-Rabbit IgG H& LAbcamab150077Dilution/anticorps 1:1000 pour l’immunofluorescence
RNeasy KitQiagen74134Extraction d’ARN
SuperScript IV Système de synthèse du premier brinThermo Fisher Scientific18091050Transcription inverse
SYBR Green Master MixTakara Bio  ;RR820AQ-PCR
Réactif TRIzolInvitrogen15596026Extraction d’ARN
d’immunofluorescence secondaire pour l’anticorps le Thermo

Références

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