Ce protocole décrit des techniques optimisées pour l’analyse de la dégénérescence et de la préservation des photorécepteurs dans un modèle murin de rétinite pigmentaire, y compris l’administration intravitréenne de médicaments, la section cryostatique et l’immunofluorescence. La méthode garantit l’intégrité de la rétine et fournit des données quantitatives sur l’efficacité des interventions thérapeutiques.
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Article de méthode
Analyse de la dégénérescence et de la préservation des photorécepteurs dans un modèle murin de rétinite pigmentaire
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les rétinopathies touchent des centaines de millions de personnes dans le monde et sont des causes importantes de déficience visuelle et de cécité. Parmi ces maladies, la rétinite pigmentaire (RP) est une maladie oculaire héréditaire caractérisée par une dégénérescence rétinienne progressive, affectant environ 1,5 à 2 millions de personnes dans le monde. Les études de preuve de concept dans des modèles animaux de dystrophies rétiniennes héréditaires constituent une base de données importante pour les études sur les mécanismes physiopathologiques de la maladie, l’efficacité et l’innocuité du traitement. L’injection intravitréenne chez la souris et le sectionnement cryostatique sont des techniques largement utilisées pour étudier les effets des médicaments dans les modèles RP, car elles permettent une administration précise de substances dans l’humeur vitrée et la préparation d’échantillons histologiques de haute qualité pour une analyse détaillée des altérations rétiniennes. De plus, le comptage cellulaire par immunofluorescence à l’aide d’anticorps contre la récupérine, une protéine dépendante du calcium exprimée dans les photorécepteurs rétiniens, a récemment été utilisé pour étudier les changements cellulaires associés à la dégénérescence rétinienne dans des modèles RP, car cette approche facilite l’évaluation de la perte de photorécepteurs et la préservation cellulaire potentielle après des interventions thérapeutiques. L’injection intravitréenne a été optimisée pour garantir l’intégrité oculaire et des résultats fiables, en utilisant une aiguille fine pour administrer la solution dans la chambre vitrée. Après une période prédéfinie d’évaluation des effets du médicament, un traitement histologique est effectué, avec des échantillons sectionnés à 10 m d’épaisseur à l’aide d’un cryostat, suivi d’un marquage par immunofluorescence avec des anticorps de récupération. Enfin, un comptage cellulaire est effectué pour évaluer si le traitement par des médicaments a exercé un effet protecteur, comme en témoigne la préservation des photorécepteurs. Bien que ces techniques aient été largement appliquées pour générer des données cohérentes dans la recherche sur la rétinopathie, des défis persistent pour obtenir une manipulation précise des tissus et la qualité du traitement. Ce protocole offre une approche standardisée pour optimiser chaque étape, de l’injection intravitréenne à la préparation des coupes histologiques, garantissant des résultats reproductibles et de haute qualité.
Introduction
La vision est l’un des sens les plus complexes du système sensoriel, essentiel pour capturer les stimuli visuels environnementaux et les traduire en signaux électrochimiques, qui sont traités dans le cerveau pour former des images. Divers facteurs biologiques, tels que le vieillissement, les défauts génétiques et les maladies, peuvent compromettre la vision, ce qui a un impact significatif sur la qualité de vie et les activités quotidiennes.
L’œil humain se compose de trois chambres principales. La couche externe, formée par la cornée et la sclère, fournit un soutien structurel au globe oculaire. La couche intermédiaire comprend l’iris, le corps ciliaire et la choroïde, cette dernière étant responsable de l’approvisionnement en sang des photorécepteurs. Enfin, la couche interne comprend la rétine, une structure responsable du traitement des stimuli lumineux et de la conversion de la lumière en signaux électriques envoyés au cerveau pour la formation de l’image 1,2.
La rétine neurale est composée de plusieurs couches cellulaires, y compris des cellules spécialisées telles que les photorécepteurs, les cellules bipolaires, les cellules horizontales, les cellules amacrines et les cellules ganglionnaires. De plus, la rétine contient des cellules gliales telles que la microglie, les astrocytes et les cellules de Müller, ainsi que des cellules épithéliales pigmentées. Ce dernier, situé dans la partie non neurale de la rétine, joue un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité structurelle, la protection et le soutien des photorécepteurs 3,4. La partie neurale abrite des cellules sensorielles et neuronales directement impliquées dans la capture et le traitement de la lumière 5,6,7.
Étant essentielle à la vision, la rétine est souvent touchée par des pathologies pouvant conduire à la cécité. Parmi ces affections, la rétinite pigmentaire (RP) se distingue comme l’une des principales rétinopathies héréditaires, avec plus de 80 gènes associés à son étiologie 8,9. La RP est une maladie hétérogène, principalement héréditaire sur le mode autosomique dominant ou récessif, mais elle peut également survenir sous forme liée à l’X ou due à des mutations spontanées10.
Avec une prévalence mondiale estimée entre 1 personne sur 3 000 et 1 sur 7 000, selon la population et la région géographique11,12, la RP se manifeste généralement à l’adolescence ou au début de l’âge adulte, avec des symptômes initiaux tels qu’une diminution de la vision nocturne et une perte du champ visuel périphérique. Au fur et à mesure que la maladie progresse, la vision centrale est compromise, ce qui peut conduire à une cécité totale 9,13.
Bien qu’il n’existe pas encore de remède contre la RP, diverses thérapies en cours de développement ont montré un potentiel pour ralentir ou inverser la progression de la maladie. Parmi ces approches figurent les thérapies génétiques, cellulaires et pharmacologiques, ainsi que les dispositifs électroniques. Pour faire progresser la compréhension de la RP et évaluer de nouvelles interventions, des modèles murins de dégénérescence rétinienne ont été largement utilisés. Ces modèles, souvent appelés rd (dégénérescence rétinienne), sont des outils précieux pour l’étude des bases moléculaires et des thérapies pour la RP. Parmi les différents modèles utilisés dans l’étude de la rétinite pigmentaire, la souche murine Pde6βrd10/rd10 (rd10) présente une mutation faux-sens dans le gène codant pour la sous-unité β spécifique des bâtonnets de la phosphodiestérase14, présentant une lente dégénérescence des photorécepteurs similaire à ce qui se produit chez l’homme15.
L’administration intravitréenne de médicaments a été largement utilisée dans diverses études 16,17,18. Ce protocole convient aux chercheurs qui étudient les effets des médicaments sur la rétine, en particulier en ce qui concerne la survie des cellules photoréceptrices. De cette façon, l’objectif principal de ce protocole est d’optimiser l’administration de médicaments par injection intravitréenne dans un modèle murin de rétinite pigmentaire (RP) et d’évaluer la survie des photorécepteurs en utilisant l’immunofluorescence pour la récupérine, un marqueur cellulaire photorécepteur. L’injection intravitréenne permet une administration localisée de médicaments, minimisant les effets secondaires systémiques, augmentant la biodisponibilité rétinienne et réduisant les effets indésirables dans d’autres organes. D’autre part, l’immunofluorescence pour la récupérine permet une analyse spécifique de la survie des photorécepteurs, fournissant un outil efficace pour évaluer l’efficacité de cette stratégie thérapeutique. Cependant, leur applicabilité dépend de facteurs tels que la sélection du modèle animal, la précision de l’injection et la durée du traitement, qui doivent être pris en compte lors de l’adaptation de cette méthode à d’autres contextes expérimentaux.
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Protocole
Le projet et tous les protocoles mis en œuvre dans le cadre de celui-ci suivent les directives de soins aux animaux du Conseil national pour le contrôle de l’expérimentation animale et ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’utilisation des animaux (CEUA - UFF) sous le numéro 1464280219.
1. Animaux
- Utilisez la souche murine rd10, qui subit une dégénérescence des photorécepteurs, et la souche C57 Black/6 (arrière-plan de rd10). Maintenez ces souches sous un cycle lumière-obscurité de 12 h/12 h, avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
2. Anesthésie
- Effectuer une injection intrapéritonéale avec un anesthésique préparé à une dose de 80 mg/kg de kétamine et 8 mg/kg de xylazine, dilués dans de l’eau distillée. La kétamine agit comme un inhibiteur du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA), fournissant des effets analgésiques, tandis que la xylazine fonctionne comme un sédatif anesthésique.
- Pour l’injection intrapéritonéale, calculer le volume à injecter comme suit : 10 μL x Poids (g).
- Retenez la souris pour assurer un accès dégagé à l’abdomen. Nettoyez le quadrant inférieur droit de la cavité abdominale avec de l’alcool à 70 %, où l’aiguille doit être insérée avec le biseau vers le haut.
- Pour confirmer l’absence de réflexe de douleur, pincez doucement la queue ou la patte de l’animal. S’il n’y a pas de réaction, cela indique que l’animal est correctement anesthésié.
3. Injection intravitréenne
- Une fois les animaux anesthésiés, exposez les yeux et, à l’aide d’un microscope stéréoscopique binoculaire avec un grossissement de 10x, identifiez la zone des limbes, une bande grise entre la cornée et la sclérotique, où l’injection sera effectuée.
- Pour effectuer l’injection, l’aide d’une autre personne est nécessaire. Sous un microscope stéréoscopique binoculaire, une personne doit tenir l’animal et insérer l’aiguille, tandis que l’assistant appuie sur le piston de la seringue pour introduire la substance dans l’œil.
- Tout d’abord, utilisez une seringue ultra-fine avec une aiguille fixe (31 G x 6 mm) pour faire une ponction dans la région du limbe, en faisant attention de ne pas insérer l’aiguille trop profondément ; L’insertion de la moitié du biseau suffit.
- Ensuite, insérez la micro-seringue pré-stérilisée à main (calibre 26 S sans biseau), contenant 1 μL du liquide/médicament d’intérêt, dans la ponction effectuée par la seringue à insuline.
- Demandez à l’assistant d’appuyer lentement sur le piston de la seringue, en veillant à ce que tout le volume soit administré sur environ 30 s.
- Répétez le processus pour l’autre œil du même animal et notez le temps.
- S’il y a plus d’un groupe expérimental, marquez l’oreille de l’animal pour assurer l’identification correcte de chaque groupe.
- Utiliser 1 goutte de solution de PBS 0,01 M dans chaque œil de l’animal pour éviter le dessèchement.
- Après ces procédures, placez les animaux sur un coussin chauffant, avec la température réglée à 37 °C, jusqu’à ce qu’ils se réveillent. Cela peut prendre 1 à 2 h. Surveillez continuellement les animaux pendant l’anesthésie et, une fois réveillés, ramenez-les dans leurs cages jusqu’au moment de l’analyse.
- Réaliser une première séance de formation à l’aide d’un colorant visible, tel que le bleu trypan, pour aider les opérateurs à affiner leur technique d’injection intravitréenne chez la souris.
REMARQUE : Le colorant facilite la visualisation du trajet de l’aiguille, permettant des ajustements précis de la profondeur et de l’angle de l’injection, réduisant le risque d’endommager la structure oculaire et augmentant la sécurité de la procédure.
4. Euthanasie et préparation oculaire
- Après une durée spécifique de traitement suite à l’injection, euthanasier les animaux par inhalation d’une surdose d’isoflurane à 5 %. Poursuivre l’exposition jusqu’à au moins 1 minute après l’arrêt de la respiration. Pour éviter la mort, tenez l’animal par la nuque et appliquez une traction ferme sur la queue jusqu’à ce qu’une luxation cervicale soit atteinte.
- Avant d’enlever les yeux, marquez le pôle temporal. Appliquez soigneusement le marqueur ou l’aiguille chaude sur la région temporale de la sclère, en veillant à ce que le marquage soit visible et précis. Cette étape servira de point de référence pour l’orientation pendant le processus de sectionnement.
- Ensuite, exposez les yeux et, à l’aide d’un scalpel stérile et de ciseaux d’iridectomie, coupez les tissus environnants pour séparer les tissus conjonctifs et musculaires et exposer le globe oculaire. Chez la souris, disséquez soigneusement les muscles oculaires, car cela peut être difficile. Pour faciliter la procédure, faites une incision latérale avec un scalpel stérile aux deux coins de la peau de l’œil.
- À l’aide d’une pince incurvée à pointe moyenne, retirez délicatement les yeux de l’orbite en les tenant par le nerf optique et fixez immédiatement le tissu pendant 5 minutes dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à température ambiante (RT).
- Après la fixation dans une solution de PFA, transférez les yeux sur une plaque de verre, à l’aide d’une pince incurvée à pointe moyenne. Cette plaque fonctionne comme une plate-forme de dissection et garantit qu’elle contient un tampon phosphate à une concentration de 0,1 M pH 7,4.
- Ensuite, placez la plaque sous un microscope stéréoscopique binoculaire avec un grossissement de 10x et faites une petite incision juste au-dessus du limbe (bord cornéen) à l’aide d’un scalpel. Par la suite, effectuez une coupe circonférentielle le long du limbe avec des ciseaux de microiridectomie pour séparer la cornée.
- Retirez la cornée, ainsi que l’iris et le cristallin, à l’aide de la pince Dumont #5. Enfin, fixez à nouveau les yeux dans la solution de PFA à 4 % pendant 55 min. Après cela, lavez les yeux trois fois avec un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4.
5. Cryoconservation et congélation
REMARQUE : La section du cryostat du tissu rétinien a été effectuée comme décrit précédemment avec quelques ajustements19.
- Cryoconserver les yeux avec un gradient de saccharose de 10 %, 20 % et 30 %, dilué dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4. Immergez les yeux séquentiellement dans les solutions de saccharose, en commençant par la concentration la plus faible (10 %) et en augmentant progressivement jusqu’à la plus élevée (30 %). Chaque étape dure le temps nécessaire jusqu’à ce que les yeux se déposent au fond du récipient, indiquant que la concentration suivante peut être utilisée. Dans la concentration finale, stockez les yeux à 4 °C pendant environ 12 h.
- Le lendemain, retirez l’excès de 30 % de saccharose et placez les yeux dans un récipient rond en aluminium de 2 cm de diamètre, disposé selon les groupes expérimentaux.
REMARQUE : Fabriquez un récipient en papier d’aluminium de la taille appropriée en fonction du nombre de groupes expérimentaux. - Sous un microscope stéréoscopique binoculaire avec un grossissement de 10x, retirez l’excès de saccharose de l’intérieur et autour du globe oculaire à l’aide d’une pipette ou d’un papier filtre, en prenant soin de ne pas endommager la structure tissulaire.
- Enfoncez les yeux dans un fluide de congélation à température de coupe optimale (OCT), en prenant soin d’éviter la formation de bulles à l’intérieur ou autour des yeux, et laissez-les pendant 1 h à RT.
- Après 1 h en OCT, positionnez les yeux avec le point de référence précédemment marqué vers le haut. Placez le récipient en aluminium sur une plaque d’aluminium appropriée à l’intérieur d’une petite boîte en polystyrène pour la congélation.
- Versez délicatement de l’azote liquide sur la plaque d’aluminium, autour du récipient en aluminium. Assurez-vous que l’azote se répartit uniformément sur la surface. Cela favorise une congélation uniforme des tissus. Assurez-vous que l’azote liquide n’entre pas en contact direct avec les yeux à l’intérieur du récipient en aluminium. Ensuite, procédez à la section des yeux à l’aide d’un cryostat.
6. Préparation des lames
- Étalez de la poly-L-lysine (200 μg/mL) sur les lames de verre à bords dépolis.
- Attendez 12 h pour que les lames sèchent et soient prêtes à l’emploi.
7. Coupe du cryostat
- Sur un cryostat, positionnez le bloc congelé sur la plate-forme.
- Tournez le volant pour faire des sections d’une épaisseur de 10 μm.
- Ajustez la position du bloc pour vous assurer que tous les yeux sont également présents dans la coupe.
- Continuez à couper jusqu’à ce que le nerf optique soit identifié, à l’aide d’un microscope à fond clair.
- Recueillir les sections sur les lames prétraitées en poly-L-lysine.
- Conservez les lames à -20 °C jusqu’à l’analyse.
8. Immunofluorescence
REMARQUE : L’immunofluorescence a été réalisée comme décrit précédemment avec quelques ajustements19,20.
- Incuber les lames obtenues à partir de la section dans le cryostat avec 100 μL de Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS à 0,01 M pendant 15 min à RT pour perméabiliser la membrane plasmique cellulaire.
- Lavez les lames deux fois avec 0,01 M PBS pendant 5 min chacune à RT pour enlever l’excès de Triton X-100.
- Incuber avec 100 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans 0,01 M de PBS pendant 30 min à RT pour bloquer les sites de liaison des anticorps non spécifiques.
- Après le blocage, incuber les sections avec 100 μL d’anti-récupérine à une concentration de 1:1500 diluée dans du BSA 1 % pour marquer les cellules photoréceptrices, pendant une nuit à 4 °C (réfrigérateur).
- Le lendemain, incuber les sections avec 100 μL d’anticorps secondaire polyclonal anti-lapin 488 ou d’anticorps secondaire polyclonal anti-lapin 568 1:500 dilué dans BSA 1 % pendant 2 h à RT.
- Lavez les lames deux fois avec 0,01 M PBS pendant 5 min chacune à RT.
- Incuber les sections avec 100 μL de DAPI 1 mg/mL (4',6-diamidino-2-phénylindole) pendant 2 à 3 minutes à RT.
- Lavez la lame une fois avec 0,01 M PBS pendant 5 min à RT.
- Enfin, traitez les sections avec un milieu de montage contenant 2,5 g de gallate de n-propyle dans 40 ml de glycérol dans un tampon phosphate à 0,1 M pH 7,4. Ils agiront comme un réactif anti-décoloration et un milieu de montage, préservant les échantillons. Placez une lamelle (24 mm 50 mm) sur les lames, puis scellez les sections avec du vernis à ongles. Après cela, procédez à l’observation des échantillons au microscope.
9. Photomicrographie au microscope à fluorescence
- Pour acquérir des images des cellules marquées à l’aide de la technique d’immunohistochimie, utilisez un microscope optique à fluorescence équipé de filtres bleus, verts et rouges. De plus, fixez un appareil photo pour la photomicrographie des diapositives. Pour obtenir les photomicrographies, utilisez un ordinateur avec le logiciel LAS V3.7 (Leica) (logiciel d’imagerie), qui doit être ouvert pour la visualisation simultanée avec le microscope.
- Placez la lame sur la platine du microscope. Dans un premier temps, utilisez l’objectif à faible grossissement et le filtre bleu.
- Ajustez la mise au point à l’aide des boutons de mise au point grossiers et fins jusqu’à ce que la rétine avec les cellules marquées en bleu (noyaux cellulaires) soit clairement visualisée.
- Sélectionnez la zone de la rétine souhaitée pour l’imagerie. Augmentez progressivement le grossissement jusqu’à l’objectif 40x, en ajustant la mise au point si nécessaire.
- Après avoir réglé la mise au point, tirez sur la goupille de dérivation pour transférer l’image du microscope vers le logiciel d’imagerie. Sélectionnez les filtres souhaités (A4 (bleu), L5 (vert) et TX2 (rouge)). Ajustez les paramètres suivants : exposition, gain et gamma, pour vous assurer que l’image est claire et aussi proche que possible de ce qui est observé au microscope.
- À un grossissement de 400×, capturez quatre champs d’une aire de 113 × 113 μm, en suivant une orientation de la périphérie vers le centre de la rétine. Assurez-vous que deux de ces champs représentent la région périphérique et que deux représentent la région centrale de la rétine.
- Pour obtenir des photomicrographies à champ périphérique, capturez des images à environ 50 μm des bords de l’œil. Pour les photomicrographies à champ central, sélectionnez les zones adjacentes situées à 50 μm du nerf optique et acquérez les images. Utilisez à la fois l’œil droit et l’œil gauche pour les quantifications, ce qui donne un total de huit champs analysés par traitement.
- Après avoir terminé toutes les photomicrographies, procédez à la quantification manuelle des cellules immunomarquées.
10. Quantification cellulaire
- Ouvrez le programme ImageJ v.1.54g. Dans le programme, cliquez sur Fichier, puis sur Ouvrir, et sélectionnez l’image enregistrée sur l’ordinateur.
- Avec l’image déjà ouverte, cliquez sur Multi-point. Utilisez cet outil pour quantifier les cellules en faisant un clic gauche sur chaque cellule à compter.
- Quantifier les cellules colocalisées, c’est-à-dire positives pour la récupine et le DAPI, dans la couche nucléaire externe (ONL).
- Une fois le décompte terminé, double-cliquez avec le bouton gauche de la souris pour voir le nombre total de cellules marquées.
- Après avoir déterminé le nombre de cellules récupérineuses positives, entrez le nombre de cellules dans la table de quantification Excel et passez à la photomicrographie suivante.
- Répétez toutes les étapes pour les 8 champs correspondant à chaque animal.
- Calculez la moyenne de ces huit champs, correspondant à un seul point expérimental pour l’ensemble de la rétine (n=1). Pour le graphique de la rétine périphérique, utilisez la moyenne des champs périphériques, soit quatre champs : deux de l’œil gauche et deux de l’œil droit. Cette moyenne correspond à un point d’expérience pour la rétine périphérique (n=1). Créez le centre du graphique de la rétine de la même manière que le graphique périphérique, en ne changeant que la région.
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Résultats
La technique d’immunofluorescence pour le marquage des photorécepteurs, cellules positives à la récupération, nous a permis d’observer le schéma de dégénérescence des photorécepteurs chez les animaux rd10 et C57Bl6, ces derniers étant considérés comme sains (Figure 1). Comme on peut le voir, le marquage des cellules positives à la récupération est exclusif à la couche nucléaire externe (ONL) où se trouvent les photorécepteurs, y compris le marquage des segmen...
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Discussion
La rétine est un tissu délicat et difficile d’accès ; Par conséquent, la technique à utiliser pour effectuer un traitement pharmacologique ciblant ce tissu doit être prise en compte. L’injection intravitréenne est une technique bien établie et largement utilisée pour administrer des médicaments directement à la rétine, en particulier dans le traitement des maladies oculaires telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge21, la rétinopathie diabétique
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Ce travail a été mené dans le cadre d’une bourse de recherche soutenue par le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq), la Fondation Carlos Chagas Chagas Filho pour le soutien à la recherche de l’État de Rio de Janeiro (FAPERJ), et a également été financé en partie par Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,3 % Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Solution pour tampon de blocage |
| 1 % BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | Solution pour tampon |
| de blocage 1 % Humain BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | Fc Bloc nécessaire pour le tampon de blocage |
| 150 W Lampe LED | Amazon | B07VH3CVSF | Source lumineuse LED pour photoirradiation tissulaire |
| 1x PBS ; | Gibco | 10010-023 | Solution pour le blocage des étapes de tampon et de lavage |
| Conteneur de stockage de 20 gallons Conteneur | B001B1C4G0 | le processus de photoirradiation | |
| Lampe LED RGBW flood de 40 W ; | Source | B08QFPJSMD | RGB pour la photoirradiation tissulaire |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| Anticorps anti-actine musculaire alpha-lisse DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| Kit de blocage de l’avidine/biotine | Abcam | ab64212 | Solution de blocage de l’avidine et de la biotine |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | solution de fixation |
| BOND Solution de déparaffination | NC0221076 Leica Biosystems | récupération | d’épitopes |
| BOND 1 | Leica Biosystems | NC0235529 | Solution de récupération d’épitopes à pH 6 basée sur le citrate ( ER1) |
| BOND Solution de récupération d’épitopes 2 | Leica Biosystems | NC0235530 | Solution de récupération d’épitopes à pH 9 basée sur l’EDTA (ER2) |
| Système de détection de recherche BOND | Leica Biosystems | NC0396648 | réactif de coloration de recherche automatisé |
| BOND RX Research Stainer | Leica Biosystems | NA | Plateforme de coloration de recherche automatisée |
| BOND Wash Solution | Leica Biosystems | NC0221077 | Tampon de lavage |
| CD15 | BD Biosciences | 347420/AB_400298 | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82/AB_11150959 | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R& D Systems | FAB8165G/AB_2728839 | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| CD45 Phycoérythrine (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE/NA | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135/AB_2892745 | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| Âne anti-chèvre IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| Âne anti-souris IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/ AB_2762830 | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| Âne anti-souris IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| Âne anti-lapin IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| Système de coloration EasyDip | Newcomer Supply | 5300KIT | Système de coloration par lame |
| Fluoromount-G | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | Média de montage |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Coloration nucléaire pour imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| Imaris File Converter x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Convertisseur de fichiers gratuit | |
| ImarisViewer software x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Logiciel gratuit de traitement d’images | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Stylo barrière hydrophobe |
| Lithium Borohydride (1 gramme) | STREM Chemicals | 93-0397 | Produit chimique pour l’inactivation du colorant, achetez de petites aliquotes de ce produit chimique (1 gramme) |
| Lumican Biotine | R& D Systems | BAF2846 | anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48393-241 | Couvercles de lames en verre |
| Pan-cytokératine Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750/AB_2868569 | Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| PELCO BioWave Pro Microwave System | Ted Pella Inc | 36500-230 | Micro-ondes scientifique non chauffant |
| PELCO SteadyTemp Pro | Ted Pella Inc | 50062 | Contrôle de température entièrement automatisé pour micro-ondes scientifiques |
| SimpleITK | Logiciel | Logiciel d’enregistrement et de traitement des canaux | |
| Streptavidin Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | Réactif de marquage pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1. |
| Microscope à grand champ | Leica Microsystems | NA | Imageur Leica Microsystems THUNDER avec source lumineuse LED8 et logiciel LAS X (3.7.1.21655). Pour l’imagerie de fluorescence, un filtre quadribande personnalisé avec roue à filtres externe (PN : 11536075) avec deux filtres monobande supplémentaires (PN : 8118215) a été utilisé pour imager sept canaux de colorant par passe. Les raies d’excitation du filtre, dichroïque et d’émission sont (1) Cube quadribande : dichroïque à 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, pas de filtres d’excitation ou d’émission ; (2) roue à filtres externes position 1 : 434/32, position 2 : 520/40, position 3 : 585/20, position 4 : 720/60, position 5 : passage ; (3) monobande 1&mdash ; excitation 585/22, 594 dichroïque, émission 625/30 ; (4) monobande de 2 po ; 635/20 excitation, 647 dichroïque, 667/30 émission. |
| Zeiss Optical Lens Cleaner | Amazon | B00GPVQVCO | Microscope Lens Cleaner |
| Antibodies | |||
| Ag85B | Abcam | ab43019 | Polyclonal Rabbit IgG, cycle 1 |
| Alpha-smooth muscle actin DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R | 1A4/asm-1, cycle 1 |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R&;D Systèmes | FAB8165G | IgG de chèvre polyclonale, cycle 1 |
| CD8 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 372906 | C8/144B, cycle 1 |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | KP1, cycle 1 |
| IgG anti-chèvre Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814 | Âne polyclonal, cycle 1 |
| IgG anti-souris Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787 | Âne polyclonal, cycle 1 |
| Âne anti-lapin IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794 | Âne polyclonal, cycle 1 |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Marquage nucléaire, cycle 1 |
| CD15 | BD Biosciences | 347420 | MMA, cycle 2 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | L26, cycle 2 |
| CD45 Phycoérythrine (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 2B11 + PD7/26, cycle 2 |
| Donkey anti-souris IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020 | Âne polyclonal, cycle 2 |
| Lumican Biotine | R& D Systems | BAF2846 | Polyclonal Goat IgG, cycle 2 |
| Pan-cytokératine Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | AE-1/AE-3, cycle 2 |
| Streptavidine Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | N/A, cycle 2 |
| Hoechst | Biotium | 40046 | cycle 2 |
| Solutions | |||
| Blocking Buffer (Cycle 1) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0,3 % en volume |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 1 % en volume |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | 1 % en volume |
| 1x PBS ; | Gibco | 10010-023 | 97,7 % en volume |
| Solution de coloration des anticorps primaires #1 (Cycle 1) | |||
| Tampon bloquant (Cycle 1) | Voir ci-dessus | Compléter au volume après l’ajout d’anticorps | |
| Hoechst | Biotium | 40046 | 1:5000 |
| CD8 AF647 | BioLegend | 372906 | 1:10 |
| Primary Antibody Staining Solution #2 (Cycle 1) | |||
| Blocking Buffer (Cycle 1) | Voir ci-dessus | Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps | |
| CD4 ; AF488 | R& D Systems | FAB8165G | 1:10 |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | 1:100 |
| Secondary Antibody Staining Solution #1 (Cycle 1) | |||
| Blocking Buffer (Cycle 1) | Voir ci-dessus | Compléter au volume après l’ajout d’anticorps | |
| Donkey Anti-Goat AF Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | 1:100 |
| Âne anti-Lapin AF Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | 1:100 |
| Âne anti-Souris AF Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/AB_2762830 | 1:50 |
| Primaire Solution de coloration des anticorps #3 (Cycle 1) | |||
| Tampon bloquant (Cycle 1) | Voir ci-dessus | Compléter au volume après l’ajout anticorps | |
| CD68 iF594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | 1:10 |
| a-SMA DL755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | 1:30 |
| sans BSA (cycle 2) ; | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0,3 % en volume |
| Humain BD Fc Bloc | BD Biosciences | 564220 | 1 % en volume |
| 1x PBS ; | Gibco | 10010-023 | 98,7 % en volume |
| Solution de coloration des anticorps primaires #4 (Cycle 2) | |||
| Tampon bloquant sans BSA (Cycle 2) | Voir ci-dessus | Compléter jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps | |
| CD15 | BD Biosciences | 347420 | 1:30 |
| Lumican Biotine | R& D Systems | BAF2846 | 1:100 |
| CD45 PE | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 1:20 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | 1:10 |
| Pan-cytokératine AF750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | 1:10 |
| Secondary Antibody Staining Solution #2 (Cycle 2) | |||
| Tampon de blocage sans BSA (cycle 2) | Voir ci-dessus | Compléter jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps | |
| Donkey anti-souris IgM AF488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | 1:100 |
| Strepavidin AF594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | 1:200 |
Références
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