Article de méthode

In vivo Imagerie de l’activité neuronale chez des mouches adultes drosophiles non anesthésiées

1.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/68332

⸱

20 juin 2025

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

Dans cet article

Résumé

L’utilisation d’anesthésiques pour la préparation de l’imagerie in vivo constitue un obstacle important à l’étude de l’activité cellulaire au cours des processus cognitifs tels que l’apprentissage et la mémoire. L’anesthésie altère la mémoire à court terme et la cognition dans plusieurs modèles, y compris la drosophile. Cette étude présente une méthode unique pour préparer la drosophile adulte à l’imagerie in vivo sans anesthésie.

Résumé

L’imagerie in vivo est cruciale pour l’étude de la neurobiologie chez la drosophile , car elle permet de visualiser en temps réel l’activité, le développement et la plasticité neuronales chez la mouche intacte et au comportement de celle-ci. Cette technique fournit des informations inestimables sur les processus dynamiques, tels que la fonction synaptique et la connectivité des circuits, qui ne peuvent pas être capturés avec précision dans des préparations fixes ou ex vivo . La plupart des techniques de préparation des mouches pour l’imagerie in vivo consistent à anesthésier les mouches peu de temps avant l’imagerie fonctionnelle. Néanmoins, de nombreuses preuves démontrent que l’anesthésie a un impact sur plusieurs processus cognitifs et physiologiques. Pour cette raison, l’imagerie in vivo de Drosophila melanogaster adulte sans l’utilisation d’anesthésiques pendant la préparation des animaux est une approche difficile mais hautement souhaitable. Le protocole présenté ici consiste à immobiliser la tête des mouches éveillées en aspirant la trompe dans un petit tube métallique relié à un système de vide. Alors que la tête est fixe, la mouche est préparée pour l’imagerie fonctionnelle sans avoir besoin d’anesthésie. Ce protocole est rapide et reproductible, garantissant qu’il n’y a aucun mal à la mouche. Le principal avantage de cette méthode réside dans le fait qu’elle évite l’utilisation d’anesthésiques, tenant ainsi compte des effets complexes potentiels de l’anesthésie sur l’activité neuronale. Cette méthode est à la fois abordable et très adaptable, utilisant des outils peu coûteux et personnalisables. Il permet d’imager avec succès des mouches vivantes, en capturant les changements rapides de l’activité neuronale associés aux processus cognitifs dynamiques.

Introduction

Les progrès récents dans les rapports d’activité génétiquement codés ont révolutionné les neurosciences en fournissant des informations très spécifiques en temps réel sur l’activité neuronale. Ces rapporteurs, tels que les capteurs de calcium ou de tension 1,2,3,4,5,6,7,8,9, permettent aux chercheurs de suivre les signaux électriques et chimiques à l’intérieur des neurones avec une précision temporelle et une résolution spatiale sans précédent. En permettant de surveiller des neurones uniques spécifiques dans des réseaux neuronaux dans différentes régions du cerveau, ces outils ont approfondi notre compréhension de la façon dont les modèles de décharge neuronale sont liés aux processus cognitifs tels que l’apprentissage, la mémoire ou la prise de décision 10,11,12,13,14.

Pour tirer parti de ces indicateurs génétiquement codés, les chercheurs ont développé des méthodes avancées pour préparer leur organisme modèle à l’imagerie in vivo. Le premier rapport de plasticité neuronale par imagerie fonctionnelle in vivo, souvent appelé « trace mnésique », a été découvert dans le lobe antennaire des abeilles mellifères à la suite d’un conditionnement olfactif appétitif15. Cette découverte a inspiré des recherches sur l’organisme modèle génétiquement polyvalent, Drosophila melanogaster, qui a conduit au développement de techniques innovantes d’imagerie in vivo 10,16,17,18.

La drosophile constitue un excellent modèle pour comprendre l’apprentissage et la mémoire en raison de sa capacité robuste à former des souvenirs olfactifs via le conditionnement classique, où une odeur (le stimulus conditionné-CS) devient associée à un stimulus aversif ou gratifiant (le stimulus inconditionné-US)19,20,21,22. Chez la drosophile, les odeurs sont peu représentées dans le corps du champignon (MB)23, une région cérébrale critique pour la mémoire associative qui se compose d’environ 2 000 neurones de Kenyon (KC) par hémisphère24. L’information olfactive est transmise du calice aux lobes MB via les axones KC, qui se regroupent pour former les lobes. Au cours du conditionnement olfactif, l’US, comme un choc électrique ou une récompense de sucre, est transmise aux lobes MB par des neurones dopaminergiques (DAN) distincts : les neurones PPL1 pour les stimuli aversifs et les neurones PAM pour les stimuli gratifiants 25,26,27,28,29,30 . On pense que l’acquisition de la mémoire implique l’activation simultanée des voies CS et US, ce qui entraîne une augmentation synergique de l’AMP cyclique (cAMP), qui code la mémoire31,32. Ce processus induit une plasticité au niveau des synapses KC→MBON, modifiant leur poids synaptique 11,12,13,33,34,35,36,37. La plasticité médiée par DAN conduit finalement les neurones de sortie du corps du champignon (MBON) à susciter soit une approche, soit un comportement d’évitement envers l’odeur apprise34. Le modèle actuel suggère que le flux d’information des KC vers les MBON transforme la représentation de l’odeur de l’identité de l’odeur dans les KC à des informations plus abstraites dans les MBON, telles que la valence d’une odeur basée sur l’expérience antérieure34,38. Contrairement aux KC, les MBON ont des réponses olfactives largement ajustées ; toute odeur donnée entraîne une réponse à la plupart des MBON39. L’ajustement des odeurs des MBON est modifié par la plasticité synaptique et varie considérablement entre les mouches individuelles, ce qui suggère que les MBON modifient leur réponse aux odeurs en fonction de l’expérience. Il y a 34 MBON, la majorité du réseau MBON semblant divisée en deux classes mutuellement antagonistes qui déterminent l’une ou l’autre approche du comportement d’évitement34. Pour cette raison, l’utilisation de l’imagerie in vivo pour étudier la récupération de la mémoire par enregistrement dans différents MBON a été largement utilisée.

Les premières méthodes d’imagerie fonctionnelle in vivo comprennent la réalisation d’interventions chirurgicales pour retirer une section de la cuticule du haut de la capsule cérébrale, qui a ensuite été recouverte d’un petit morceau de pellicule plastique18. Bien que cela ait marqué le début de l’imagerie in vivo chez la drosophile, il y a eu depuis des progrès significatifs dans les techniques de préparation des mouches et l’administration de stimuli au microscope pour étudier des processus tels que l’apprentissage et la mémoire. Cependant, même aujourd’hui, la plupart des techniques de préparation des mouches pour l’imagerie in vivo impliquent l’anesthésie des mouches. Cette pratique présente des défis, car il existe de nombreuses preuves - et tout un domaine de recherche - démontrant comment l’anesthésie affecte la mémoire, ainsi que d’autres processus cognitifs et physiologiques. Par exemple, une étude a été menée pour comprendre les effets de différents anesthésiques très couramment utilisés en laboratoire (dioxyde de carbone, isoflurane, sévoflurane et choc thermique). Ils ont constaté que plus l’exposition à l’anesthésie était longue, plus le temps de récupération augmentait, modifiait l’activité locomotrice, réduisait la fécondité et pouvait avoir un impact sur les réserves d’eau et de lipides. De plus, il a été rapporté que l’administration d’une anesthésie par choc froid immédiatement après l’entraînement peut complètement perturber la mémoire à court terme21. De cette première étude, on sait maintenant que chez la drosophile, il existe une mémoire non consolidée (mémoire sensible à l’anesthésie) qui se dégrade en 6 à 8 heures, et une forme de mémoire consolidée (mémoire résistante à l’anesthésie) qui se forme progressivement après l’apprentissage et peut durer environ 24 h41. Sur cette base, l’anesthésie peut affecter le traitement cognitif et l’activité des neurones, ce qui permet finalement une bonne expression de la mémoire.

Les effets de l’anesthésie sur la mémoire ne se limitent pas à la drosophile. De nombreuses études sur l’homme et d’autres mammifères ont démontré des résultats similaires. Par exemple, une étude transversale réalisée dans un hôpital universitaire a révélé que la mémoire à court terme était significativement réduite chez les patients 24 h après l’anesthésie générale42. Une autre étude réalisée chez la souris a révélé que l’anesthésie générale réduisait considérablement la dynamique des pointes, les ensembles cellulaires décorrélés et modifiait la dynamique de la colonne vertébrale dans la région CA1 de l’hippocampe, une zone cérébrale importante impliquée dans l’apprentissage et la mémoirechez les mammifères. Pour surmonter ces difficultés, l’objectif de cette étude est de fournir un nouveau protocole qui élimine l’utilisation de l’anesthésie lors de la préparation de la mouche pour l’imagerie in vivo , laissant le corps de la mouche complètement libre. Cette approche permet des enregistrements plus précis de l’activité neuronale, améliore la santé des mouches pour les enregistrements plus longs et élimine les effets confondants possibles de l’anesthésie par rapport aux autres approches. Ce protocole est conçu pour enregistrer l’activité des neurones chez la drosophile, en examinant spécifiquement comment les neurones présentent une plasticité pendant et après l’expérience d’apprentissage. Cependant, le protocole de dissection est polyvalent et peut être adapté à diverses applications dans la recherche en imagerie en direct.

Protocole

Les détails de l’équipement et des réactifs utilisés pour cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Mouches des fruits transgéniques, Drosophila melanogaster

  1. Croisez des mouches vierges femelles et des mouches mâles (élevées à 25 °C dans une humidité relative de 60 % sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures) portant respectivement les constructions Gal4 et UAS souhaitées pour produire des mouches chez lesquelles des neurones spécifiques d’intérêt expriment le rapporteur d’activité génétiquement codé souhaité.
  2. Vieillir la progéniture du croisement ci-dessus jusqu’à ce qu’elle soit dans la gamme de 2 à 5 jours après l’éclosion. Les hommes et les femmes peuvent être utilisés, car les chambres d’imagerie sont fabriquées sur mesure pour s’adapter aux deux sexes.

2. Construction d’un aspirateur (flux de travail de 5 minutes)

  1. Coupez un tube en silicone de 6 mm à environ 8 pouces de long à l’aide d’une lame de rasoir. Prenez une pointe de pipette p200 et coupez-en environ la moitié à l’aide d’une lame de rasoir pour l’embout buccal (Figure 1A). Insérez l’embout coupé dans le tube. Coupez une pointe de pipette p1000 suffisamment pour qu’une mouche puisse la traverser.
  2. Prenez un petit morceau de coton et couvrez le tube en silicone. Il s’agit d’empêcher la mouche d’aspirer dans la bouche de l’expérimentateur. Placez l’embout coupé p1000 sur le tube recouvert de coton.
  3. Couvrez la pointe de la pipette p1000 avec une nouvelle pointe de pipette p200. Pour déterminer la longueur appropriée pour couper la pointe de la pipette p200, retirez d’abord la pointe de la pipette p200 et aspirez une mouche dans la pointe de la pipette p1000. Remettez l’embout p200. Soufflez doucement et tapotez la mouche pour la déplacer aussi loin que possible dans la pointe du p200.
    1. Une fois qu’elle ne peut plus avancer, utilisez un microscope à dissection pour marquer le point où la tête de la mouche se termine et le thorax commence, à l’aide d’une lame de rasoir. Aspirez la mouche dans la pointe de la pipette p1000 et coupez la pointe de la pipette p200 à l’endroit indiqué.

3. Construction de l’aspirateur de trompe à tube métallique (flux de travail de 5 à 10 minutes)

  1. Coupez le tube métallique hypodermique de calibre 22X à la taille souhaitée (~10 cm) à l’aide d’outils Dremel et d’une lame de scie diamantée. Polissez les extrémités des tubes métalliques avec une meule à tronçonner Dremel 420 pour créer une ouverture lisse et propre. Cette ouverture accueillera la trompe de la mouche.
  2. Enroulez le tube autour d’un tube à centrifuger de 15 ml pour obtenir la forme incurvée souhaitée (figure 1A). La courbe doit créer une forme en forme de crochet qui permettra au corps de la mouche d’être aligné avec la chambre.
  3. Coupez un morceau (~7 cm de long) de la tubulure métallique hypodermique de calibre 12TW à l’aide d’outils Dremel (cette tubulure doit s’insérer dans une pointe de pipette de 2 μL). Prenez une pointe de pipette de 2 μL et coupez l’extrémité à l’aide d’une lame de rasoir pour s’adapter au tube métallique de calibre 22X. Insérez le tube métallique le plus grand dans l’autre extrémité de la pointe de la pipette de 2 μL.
  4. Mélangez une petite quantité de résine et un durcisseur de colle époxy. Appliquez le mélange à l’endroit où le petit tube métallique rencontre la pointe de la pipette et à l’endroit où le plus grand tube métallique se connecte à la pointe de la pipette. Laissez l’adhésif durcir complètement pendant la nuit avant de connecter l’ensemble à un support sur un micromanipulateur. Ajustez l’angle si nécessaire.

4. Fabrication d’une pipette à choc et à libération d’odeurs pour des expériences d’apprentissage et de mémoire au microscope (flux de travail de 10 minutes)

  1. À l’aide d’un outil diamanté Dremel, coupez 1 mL dans une pipette en verre 1/100 au repère de 3 mL. Découpez un petit morceau rectangulaire de feuille acrylique de dimensions 24,5 mm x 8 mm et d’une épaisseur de 1/8 de pouce.
    REMARQUE : Alternativement, cette pièce peut être imprimée en 3D pour mieux s’adapter à la grille de choc (les fichiers stl et obj peuvent être trouvés dans le fichier supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 2).
  2. Coupez la grille d’amortisseur en cuivre pour l’adapter à la pièce acrylique rectangulaire de l’étape précédente. Soudez deux fils électriques aux extrémités opposées de la grille en cuivre. Placez la grille de cuivre dans la pièce rectangulaire en acrylique et courbez-la de manière à ce que l’abdomen et les pattes de la mouche s’emboîtent sur la grille de choc (Figure 1I).
  3. Collez la grille de cuivre sur le plastique rectangulaire à l’aide d’un morceau de ruban isolant. À l’aide d’un pistolet à colle chaude, fixez solidement la pipette en verre à la grille de choc, en vous assurant qu’elle est droite et correctement centrée. À l’aide d’un multimètre numérique, vérifiez que la grille de cuivre fonctionne pour délivrer efficacement un choc aux pattes de la mouche.

5. Assemblage de la résistance en platine pour la fusion de la colle (acide myristique) (flux de travail de 20 minutes)

  1. À l’aide d’une pince à dénuder, coupez 200 mm de fils à la longueur souhaitée et dénudez une extrémité des deux fils. Coupez environ 60 mm de fil de platine (cette longueur devrait être suffisante pour créer une boucle qui servira à faire fondre la colle).
  2. À l’aide d’un pistolet à souder, soudez une extrémité du fil de platine au fil électrique. Passez une gaine thermorétractable dans le fil électrique et utilisez un bec Bunsen pour rétrécir la gaine sur le fil afin de couvrir les pièces soudées.
  3. Coupez deux morceaux de 20 mm du tube en caoutchouc de 2,55 mm de diamètre intérieur et passez-les dans le fil de platine (gardez le fil de platine droit pour faciliter ce processus). Utilisez le pistolet à souder l’autre extrémité du fil de platine à l’autre fil électrique. Utilisez une nouvelle gaine thermorétractable pour couvrir cette nouvelle pièce soudée.
  4. Retirez le piston d’une seringue BD tb 1 mL et passez les fils des étapes précédentes dans le cylindre. Le platine doit dépasser de l’extrémité du corps de la seringue. Il ne doit pas y avoir de fils exposés et le petit tube en caoutchouc doit recouvrir le fil de platine, sauf jusqu’à la toute fin.
  5. À l’aide d’une pince à dénuder, dénudez une petite quantité des deux autres extrémités des fils électriques. À l’aide d’un pistolet à souder, soudez chaque fil à une fiche banane jusqu’à ce qu’il soit solidement connecté.
  6. Utilisez de la colle époxy pour coller le haut et la base du corps de la seringue afin de coller les fils et le cylindre ensemble ; Cela évitera la tension des fils à l’intérieur de la seringue et assurera une durée de vie plus longue à la résistance. Laissez la colle durcir pendant la nuit.
  7. Connectez la résistance finie à l’alimentation CC.

6. Construction de la chambre d’enregistrement - (flux de travail de 2 jours)

  1. Après le fichier supplémentaire 3, découpez au laser une feuille de cale noire (épaisseur 0,0125 po). La taille de l’ouverture au milieu de la chambre peut être modifiée pour s’adapter à la taille des mouches (la taille de la lime convient généralement aux femelles et aux mâles).
  2. Prenez une lame de microscope en verre qui servira de base à la chambre. Mélangez la résine et l’époxy. Prenez la chambre en acrylique noir et, à l’aide de colle époxy, fixez des aimants en néodyme de 3 mm x 2 mm aux quatre coins. Il est recommandé de coller un aimant à la fois et de le tenir pendant que la colle durcit avec un trombone.
  3. Placez deux nouveaux aimants sur chacun des aimants collés précédemment sur la chambre. À l’aide d’époxy, collez le dernier aimant attaché à une lame de verre et utilisez des trombones pour le maintenir en place pendant la conservation.
    REMARQUE : Une fois la colle préparée, la chambre est terminée et d’autres aimants peuvent être ajoutés pour ajuster la hauteur de la chambre pour les expériences. Les dossiers supplémentaires 4, 5 et 6 montrent la chambre d’enregistrement assemblée.

7. Protocole de dissection in vivo sans anesthésie - (flux de travail de 5 à 7 minutes)

  1. Retirez la pointe de la pipette p200 de l’aspirateur. Insérez l’aspirateur dans le flacon et aspirez une seule mouche dans l’embout de la pipette p1000. Replacez l’embout de la pipette p200 sur l’aspirateur. Soufflez doucement et agitez l’aspirateur de manière à ce que la mouche soit immobilisée en haut de la pointe de la pipette p200, la tête la première.
  2. Placez la chambre de dissection sur le support du manipulateur. Raccorder l’aspirateur au tube de retenue à mouche et ajuster le niveau de débit au besoin (~500 mL/min). Utilisez un connecteur rapide pour connecter-déconnecter facilement et rapidement l’aspirateur (Figure 1A).
  3. Déplacez le tube métallique sous vide pour le centrer dans le champ de vision lorsque vous regardez à travers le microscope. Confirmez que la chambre est correctement positionnée afin qu’elle aille directement sur le tube métallique lorsque vous serez prêt à coller la mouche. Aspirez doucement la trompe de la mouche dans le support d’aspirateur (Figure 1A).
  4. Une fois que la mouche est dans la bonne position, déplacez le manipulateur de manière à ce que la tête de la mouche soit alignée avec l’ouverture de la chambre.
  5. Allumez l’alimentation CC. Le courant doit être réglé pour se situer entre 0,40 et 0,50 ampères. Des courants plus élevés peuvent faire fondre l’acide myristique au point que sa viscosité devient trop faible, ce qui augmente le risque que la colle se répande sur la tête de la mouche.
  6. À l’aide de la résistance au platine, collez les côtés des yeux et le thorax à la chambre à l’aide d’acide myristique fondu (Figure 1B). Pour éviter de mettre de la colle sur la cuticule de la tête, utilisez le moins de colle possible, surtout lorsque vous collez les côtés des yeux.
  7. Une fois les yeux et le thorax collés, débranchez la tubulure à vide et utilisez le manipulateur pour retirer la chambre d’enregistrement de la tubulure à vide. Retournez la chambre et utilisez la résistance au platine pour coller la trompe par le bas (Figure 1C). Le collage des yeux par le bas est facultatif et peut aider à maintenir la mouche en place pendant la dissection, mais ce n’est pas nécessaire.
  8. Une fois que tout est collé, coupez l’alimentation CC, retournez la chambre à la verticale et fixez-la à la base latérale en verre. Coupez un petit morceau de ruban adhésif à l’aide de ciseaux et appliquez-le juste devant et derrière la tête de la mouche (figure 1D).
  9. Tournez la chambre de manière à ce que la tête soit face à l’expérimentateur à 90. À l’aide d’une aiguille de dissection, faites une coupe verticale le long des côtés des yeux (figure 1E). Tournez la chambre de manière à ce qu’elle soit placée horizontalement. À l’aide de l’aiguille de dissection, coupez la cuticule (Figure 1E).
    REMARQUE : Assurez-vous que la « fenêtre » de cuticule qui vient d’être créée peut être soulevée à l’aide de l’aiguille de dissection. S’il se soulève sans aucune résistance, remettez l’aiguille de dissection sur son couvercle. La solution saline n’est pas utilisée aux étapes 13 et 14 pour éviter la réfraction de la lumière, qui pourrait obstruer une vue dégagée lors des coupes.
  10. Ajouter 100 μL de solution saline sur le dessus de la tête de la mouche (figure 1F). À l’aide d’une pince tranchante, retirez délicatement la fenêtre (Figure 1G). À l’aide de la pince bien aiguë, retirez soigneusement tout reste de graisse ou de trachée. Le cerveau devrait maintenant être prêt pour l’imagerie (Figure 1H-1J).

8. Visualisation de la plasticité induite par l’apprentissage par conditionnement olfactif aversif (flux de travail de 20 minutes)

  1. À l’aide d’un microscope confocal équipé d’un laser et d’un objectif à immersion dans l’eau, placez la mouche préparée sur la platine du microscope. En option, utilisez un appareil photo avec un objectif macro pour faire la mise au point sur la mouche, en vous assurant que la mouche est en bonne santé et en mouvement.
  2. Ajustez la position de la grille de choc/pipette odorante à l’aide d’un micromanipulateur de sorte que la mouche repose sur la grille de choc.
    REMARQUE : La mouche doit toujours être capable de se déplacer librement car la grille de choc touche juste les jambes et légèrement l’abdomen (la mouche doit être capable de retirer ses pattes et son abdomen de la grille si elle est rétractée). La pipette de distribution d’odeurs doit être dirigée vers les antennes de la mouche.
  3. À l’aide du bouton de réglage Z grossier, balayez l’axe Z du cerveau et localisez la région cérébrale d’intérêt. Ajustez la taille du cadre à 512 x 512 px. La fréquence de balayage doit être ajustée à la vitesse souhaitée - avec un minimum de 2 Hz. Enfin, réglez la durée de l’enregistrement.
  4. Commencez à enregistrer le neurone d’intérêt à l’aide d’un système de diffusion d’odeurs sur mesure ou commercial, et lancez simultanément une diffusion d’odeurs « pré-entraînement » (Figure 2C). Réglez l’enregistrement sur 2 min. La présentation des odeurs avant l’entraînement commence par l’enregistrement des réponses à une première impulsion d’odeur de 5 secondes (CS-) suivie d’une deuxième impulsion d’odeur de 5 secondes (CS+) avec un intervalle d’inter-stimuli de 30 s.
  5. Après avoir recueilli les réponses de pré-formation, attendez 5 min avant de lancer un protocole de formation dans le système de diffusion des odeurs. Pour cet exemple, seul le CS+ a été présenté lors de la formation. L’odeur CS+ est présentée pendant 1 min initiée à 30 s après le déclenchement du système de diffusion des odeurs. Le stimulateur de choc est programmé pour délivrer simultanément des chocs de 12 à 90 V pendant que l’odeur est présentée.
  6. Après l’entraînement, attendez 5 min ou 15 min avant d’obtenir des réponses post-entraînement. Enregistrez les réponses post-formation de la même manière que les réponses pré-formation ont été enregistrées à l’étape 6. Enregistrez tous les fichiers dans le format approprié pour l’analyse ultérieure des images.

9. Analyse d’images

  1. Pour analyser les enregistrements, dessinez une région d’intérêt (ROI) autour de la zone du neurone. Celle-ci doit être aussi précise que possible pour limiter l’influence de la fluorescence de fond.
  2. Utilisez l’outil de mesure pour extraire les données d’intensité de fluorescence moyenne dans le retour sur investissement pour chaque image de l’enregistrement. Exportez ces données sous forme de fichier CSV.
  3. Ouvrez les données dans MATLAB ou dans n’importe quel programme d’analyse de données pour calculer les valeurs ΔF/Fo pour chaque trace d’odeur. Combinez les données pour obtenir l’ensemble moyen des enregistrements de mouches individuelles ΔF/Fo et créez un graphique des traces de réponse moyenne aux odeurs avant et après l’entraînement (figures 2E, F).

Résultats

Ici, l’imagerie in vivo de la drosophile adulte sans anesthésie est utilisée pour étudier le conditionnement olfactif aversif induisant la plasticité dans un neurone de sortie de corps champignon bien caractérisé (MBON γ2α'1)12. L’indicateur calcique GCaMP6f2, ainsi que la protéine fluorescente rouge TdTom, sont exprimés dans un neurone de sortie MB, dont les dendrites innervent le compartiment de la γ MB et les lobes de α' et est génétiquement ciblé sur le MBON γ2α'1 à l’aide de la lignée Gal4 scindée MB077C34 (Figure 2A,B).

Pour observer la plasticité post-conditionnement olfactif aversif, la mouche est placée sous le microscope confocal, avec son abdomen et ses pattes alignés au milieu de la grille de choc et la pipette de distribution d’odeurs pointée vers l’antenne de la mouche. Tout d’abord, les réponses d’odeur de calcium ont été enregistrées à une impulsion de 5 s de 4-méthylcyclohexanol (MCH) suivie d’une impulsion de 5 s de 3-octanol (OCT), séparée par un intervalle inter-stimulus de 30 s. Cinq minutes plus tard, les mouches ont été entraînées par la présentation simultanée d’une impulsion OCT de 1 minute (CS+) et de chocs de 12 à 90 V. Ce programme de conditionnement associatif produit une mémoire aversive comportementale robuste. Enfin, 5 min et 15 min après le conditionnement, les réponses calciques à la MCH et à l’OCT ont été enregistrées comme avant l’entraînement. MBON γ2α'1 répond vigoureusement par des transitoires calciques à la fois à la MCH et à l’OCT avant le conditionnement (Figure 2D-F). Néanmoins, les réponses calciques post-conditionnantes de12,5 min à CS+ (OCT) sont complètement déprimées (Figure 2D-F). De plus, les réponses à la CS- (MCH) ont été significativement potentialisées. Quinze minutes après l’entraînement ont montré des résultats similaires, car la réponse calcique au CS+ était significativement déprimée et le CS- était potentialisé. Ces résultats indiquent que la trace mnésique observée dans les deux odeurs dure au moins 15 min (Figure 2D-F). Ces réponses ont été quantifiées à l’aide de la réponse moyenne de l’odeur pendant l’impulsion de 5 s et comparées à l’intérieur de la mouche. Ces changements dans les réponses olfactives peuvent également être visualisés par une représentation pseudo-couleur du changement dans l’entraînement pré et post-aversif de fluorescence de GCaMP6 (Figure 2E). En revanche, l’anesthésie de la mouche pendant la préparation montre une plasticité réduite à la fois pour CS+ et CS-. Seule une dépression partielle à la CS+ est observée chez les animaux anesthésiés, car les réponses post-entraînement sont toujours présentes. De plus, les réponses CS- ne sont pas significativement différentes après l’entraînement (Figure 2G,H). Pour mieux observer cela, nous avons calculé la plasticité induite comme le rapport CS+/CS- et montré que les mouches non anesthésiées présentent une plasticité significativement accrue par rapport aux animaux anesthésiés (Figure 2I). Ces résultats représentatifs indiquent que ce protocole est adapté à l’étude de l’apprentissage et de la mémoire au microscope et garantit la santé de la mouche lors de l’imagerie à partir des neurones pendant une longue période de temps. Ce protocole est suffisamment polyvalent et peut être appliqué à d’autres types d’imagerie in vivo et à d’autres neurones d’intérêt.

figure-results-1
Figure 1 : Préparation de l’imagerie in vivo de la drosophile sans anesthésie. (A) Panneau supérieur : Schéma illustrant les étapes de la préparation de l’aspirateur. Panneau inférieur : Schéma montrant la chambre maintenue dans un micromanipulateur pendant le positionnement de la mouche. Le proboscis de la mouche est placé à l’ouverture d’un tube métallique relié à un vide à 500 mL/min à l’aide d’un aspirateur. La chambre est ensuite positionnée au-dessus de la mouche. (B) Les côtés des yeux et le thorax sont collés avec de l’acide myristique à l’aide d’une résistance en platine fabriquée sur mesure. (C) La trompe de la mouche est retirée du tube métallique, et la chambre est inversée pour permettre au trompe d’être collé en place, minimisant ainsi les mouvements pendant les enregistrements. (D) La chambre est fixée à une base de diapositive en verre. Du ruban adhésif est appliqué sur le haut de la chambre, couvrant les antennes, et à l’arrière pour empêcher la solution saline de fuir. (E) Deux coupes verticales sont faites le long de la cuticule près des yeux composés, suivies d’une troisième coupe à travers la cuticule près du thorax, créant une « fenêtre » sur le cerveau. (F) Entre 100 et 200 μL de solution saline sont ajoutés à la tête de la mouche à l’endroit des coupes. (G) La fenêtre de la cuticule est soulevée, tirée et détachée à l’aide de pinces fines et tranchantes pour exposer le cerveau. (H) La graisse et le tissu trachéal sont retirés pour permettre une visualisation claire des cellules cérébrales au microscope. (I) La mouche préparée est placée sous le microscope et positionnée avec son corps aligné sur le dessus de la grille de choc. (J) Image pseudo-couleur montrant le motif d’expression de MBON γ2α′1. La région d’intérêt est délimitée par une ligne pointillée entourant la tonnelle dendritique. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Plasticité induite par l’apprentissage dans MBON γ2α′1 suite à un conditionnement olfactif aversif. (A) Modèle d’expression du pilote MB077C-splitGal4 exprimant GCaMP. Les cerveaux ont été disséqués et colorés avec de l’anti-GFP et contre-colorés avec de l’anti-nc82. Barre d’échelle : 50 μm. (B) Image pseudo-couleur de MBON γ2α′1 mettant en évidence le corps cellulaire, le processus d’extension et l’arbre dendritique. La région dendritique représente la zone à partir de laquelle les réponses calciques ont été recueillies. Barre d’échelle : 50 μm. (C) Schéma du protocole d’entraînement aversif. Les mouches ont été exposées à des impulsions de 5 secondes de MCH et d’OCT avec 30 s d’air pur entre les deux. Après un intervalle de 5 minutes, des mouches ont été entraînées à associer l’OCT à douze chocs électriques de 90 V. Des enregistrements des réponses calciques à la MCH et à l’OCT ont été effectués 5 min et 15 min après l’entraînement. (D) Les traces de réponse aux odeurs à la MCH (panneau supérieur) et à l’OCT (panneau inférieur) sont indiquées pour la pré-formation, et à 5 min et 15 min après la formation. D’épaisses barres noires indiquent le moment de la présentation de l’odeur. (E) Images pseudo-couleur de l’arborescence dendritique du MBON γ2α′1 avant l’entraînement, et 5 min et 15 min après l’entraînement, en réponse à la fois à la MCH et à l’OCT. La potentialisation de la fluorescence est observée pour le CS- (MCH), tandis que la fluorescence est abolie pour le CS+ (OCT). Barre d’échelle : 20 μm. (F) La réponse moyenne aux odeurs de MCH est significativement potentialisée à 5 min et 15 min après l’entraînement, tandis que les réponses à l’OCT (CS+) sont significativement supprimées. Test apparié de Wilcoxon non paramétrique, N = 12. (G) Les traces de réponse olfactive à la MCH (panneau supérieur) et à l’OCT (panneau inférieur) sont montrées pour les mouches anesthésiées avant et 5 minutes après l’entraînement. D’épaisses barres noires indiquent l’évacuation des odeurs. (H) Chez les animaux anesthésiés, les réponses odorantes moyennes à la MCH ne montrent pas de potentialisation significative après l’entraînement, et les réponses à l’OCT ne présentent qu’une suppression partielle par rapport aux animaux non anesthésiés. (I) La plasticité induite par l’entraînement, calculée comme le rapport CS+/CS-, est significativement plus faible chez les mouches anesthésiées par rapport à celles préparées sans anesthésie. Test apparié de Wilcoxon non paramétrique, N = 8-12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dossier supplémentaire 1 : Grid_holder (TSL). Fichier STL du composant conçu sur mesure utilisé pour maintenir le réseau électrique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : Grid_holder (OBJ). Fichier OBJ du composant conçu sur mesure utilisé pour maintenir le réseau électrique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Chamber_LaserCut. Fichier Adobe Illustrator utilisé pour la découpe laser du composant supérieur des chambres d’enregistrement pour les mouches mâles et femelles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 4 : Recording_chamber (TSL). Fichier STL de la chambre d’enregistrement conçue sur mesure. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 5 : Recording_chamber (OBJ). Fichier OBJ de la chambre d’enregistrement conçue sur mesure. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 6 : Recording_chamber_animation. Vidéo MP4 montrant une animation de la chambre d’enregistrement assemblée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Comprendre les circuits neuronaux qui sous-tendent l’apprentissage et la mémoire est un objectif central dans le domaine des neurosciences. La boîte à outils génétique disponible chez la drosophile, combinée à la simplicité et à la polyvalence des tests comportementaux, en fait un organisme modèle idéal pour l’étude de ces processus. Des études publiées par divers laboratoires ont décrit différents protocoles pour préparer les mouches à l’imagerie fonctionnelle sans l’utilisation d’anesthésie44,45. Cependant, ces protocoles varient considérablement et s’appuient souvent sur des outils hautement spécialisés et personnalisés, avec peu de conseils sur la façon de les créer ou de les utiliser. Dans ce protocole, une méthode d’imagerie fonctionnelle in vivo chez les mouches qui évite les effets confondants de l’anesthésie générale est présentée. De plus, cette approche permet de capturer l’activité neuronale en temps réel chez la même mouche, ce qui permet des comparaisons directes des réponses neuronales avant et après l’exposition à divers stimuli.

Lors de la réalisation de ce protocole, les étapes critiques consistent à s’assurer que la trompe de la mouche est correctement placée dans le tube à vide. Cette étape garantit que le collage ultérieur aura lieu aux bons endroits, et elle s’assure que la tête est à l’angle correct pour visualiser les neurones d’intérêt. Une application minimale de colle est essentielle pour maintenir la santé des mouches ; L’idéal est d’utiliser la plus petite quantité nécessaire pour fixer la mouche en place. Ce protocole permet également certaines modifications pour répondre à des besoins spécifiques, comme coller uniquement les côtés des yeux afin que tout le corps soit libre. De même, une chambre de perfusion peut être fixée au sommet de la chambre d’enregistrement pour faciliter la perfusion de la sonnerie ou l’administration du médicament. Enfin, un tapis roulant flottant rotatif peut être placé sous la mouche comme indiqué précédemment, permettant l’analyse de la directionnalité de la locomotion46,47.

Ce protocole présente certaines limites, notamment le stress auquel les mouches sont soumises pendant la microchirurgie pour préparer les mouches à l’imagerie en direct. La manipulation des petites mouches, l’application parcimonieuse de la colle et l’ouverture soigneuse de la capsule cérébrale sans endommager les tissus cérébraux ou le corps nécessitent une expertise substantielle, qui ne peut être acquise que par une pratique méticuleuse et la répétition. Bien que cette méthode soit particulièrement bénéfique pour l’étude des processus cognitifs au niveau cellulaire, l’imagerie in vivo présente encore certaines limites par rapport aux enregistrements électrophysiologiques. De plus, bien que notre protocole évite l’utilisation d’une anesthésie avant l’imagerie, la mouche est toujours confinée à une chambre physique, ce qui peut toujours modifier les réponses cellulaires. Néanmoins, notre méthodologie fournit le moyen le plus proche de préserver la santé de la mouche pour une imagerie in vivo optimale. Par rapport aux méthodes existantes qui utilisent l’anesthésie et contraignent la mouche, notre méthode vise à garder la mouche aussi libre que possible tout en étant capable d’imager à partir de cellules avec un mouvement minimal.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Institute for General Medical Science pour 1R01GM147917-01A1 et la Brain and Behavior Research Foundation pour 30442.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fil de platine 0,102 mmSurepure Chemetals2690
0,25 OD, 0,125 ID, tube en silicone durci au platineVWR89068-474
0,3 mm ID Tube en silicone  ;Fisher Scientific11-189-14
Fiches bananesAmazon
Feuille acrylique noire pour chambre 0.0125 inPrecision Brand44250
Chlorure de calciumSigma-Aldrich746495
Copper shock gridsur
pour résistance en platineFisher ScientificS35740
Outil Dremel 3000-1Dremel3000-N/18
Drosophila melanogaster / ;; uas-tdtomBDSC36328
Drosophila melanogaster / ; uas-GCAMP6F ;BDSC42747Cette ligne uas a été combinée avec ;; uas-td-tom pour générer un stock contenant les deux insertions
Drosophila melanogaster/ ;; MB077C-gal4BDSC68287
Colle époxyGorilla4200102
Débitmètre de gaz 1,5 LPMAmazoneB01N0UWZ2T
Glass 1 mL pipette sérologique  ;Fisher Scientific50-232-9516
Lames de verreFisher Scientific  ;12-550-A3
GlucoseSigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH4034
Tube hypodermique de calibre 12TWMicrogroup316H12TW
Tube hypodermique de calibre 22XMicrogroup304H22X
Chlorure de magnésium hexahydratéSigma-AldrichM9272
Acide myristiqueAcros Organics156961000
Aimants en néodyme 3X2 mmAmazonB0CXSQ387M
P1000 pointesGenesee Scientific  ;23-165RL
P200 pointesGenesee Scientific  ;23-150RL
Connecteur poussoir pneumatique 6mmOD AmazonB07ZHG8Y1Y
Chlorure de potassiumSigma-AldrichP3911
Tube PTFE 6mm ODAmazon
Razor lames  ;AmazonB08LYD6645
Bicarbonate de sodiumSigma-AldrichS5761
Chlorure de sodiumFisher ScientificS271-500
Phosphate de sodium dibasiqueSigma-AldrichS0876
SaccharoseSigma-AldrichS9378
TréhaloseSigma-AldrichT0167
Alimentation DC mesure

Références

  1. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  2. Chen, T. W., Wardill, T. J., Sun, Y., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  3. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  4. Akerboom, J., Chen, T. W., Wardill, T. J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  5. Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  6. Sun, F., Zeng, J., Jing, M., et al. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  7. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  8. Wang, L., Wu, C., Peng, W., et al. A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging. Nat Commun. 13 (1), 5363(2022).
  9. Jing, M., Zhang, P., Wang, G., et al. A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies. Nat Biotechnol. 36 (8), 723-737 (2018).
  10. Yu, D., Akalal, D. B. G. B., Davis, R. L. Drosophila alpha/beta mushroom body neurons form a branch-specific, long-term cellular memory trace after spaced olfactory conditioning. Neuron. 52 (5), 845-855 (2006).
  11. Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic plasticity underlies aversive olfactory learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
  12. Berry, J. A., Phan, A., Davis, R. L. Dopamine neurons mediate learning and forgetting through bidirectional modulation of a memory trace. Cell Rep. 25 (3), 651-662 (2018).
  13. Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L., Berry, J. A. Rac1 impairs forgetting-induced cellular plasticity in mushroom body output neurons. Front Cell Neurosci. 14, 258(2020).
  14. Martinez-Cervantes, J., Shah, P., Phan, A., Cervantes-Sandoval, I. High order unimodal olfactory sensory preconditioning in Drosophila. Elife. 11, 79107(2022).
  15. Faber, T., Joerges, J., Menzel, R. Associative learning modifies neural representations of odors in the insect brain. Nat Neurosci. 2 (1), 74-78 (1999).
  16. Yu, D., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Davis, R. L. Detection of calcium transients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo reporters. J Neurosci. 23 (1), 64-72 (2003).
  17. Yu, D., Keene, A. C., Srivatsan, A., Waddell, S., Davis, R. L. Drosophila DPM neurons form a delayed and branch-specific memory trace after olfactory classical conditioning. Cell. 123 (5), 945-957 (2005).
  18. Yu, D., Ponomarev, A., Davis, R. L. Altered representation of the spatial code for odors after olfactory classical conditioning: Memory trace formation by synaptic recruitment. Neuron. 42 (3), 437-449 (2004).
  19. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophilamelanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  20. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (3), 708-712 (1974).
  21. Quinn, W. G., Dudai, Y. Memory phases in Drosophila. Nature. 262 (5569), 576-577 (1976).
  22. Tempel, B. L., Bonini, N., Dawson, D. R., Quinn, W. G. Reward learning in normal and mutant Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (5), 1482-1486 (1983).
  23. Turner, G. C., Bazhenov, M., Laurent, G. Olfactory representations by Drosophila mushroom body neurons. J Neurophysiol. 99 (2), 734-746 (2008).
  24. de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1979).
  25. Schwaerzel, M., Monastirioti, M., Scholz, H., Friggi-Grelin, F., Birman, S., Heisenberg, M. Dopamine and octopamine differentiate between aversive and appetitive olfactory memories in Drosophila. J Neurosci. 23 (33), 10495-10502 (2003).
  26. Kim, Y. C., Lee, H. G., Han, K. A. D1 dopamine receptor dDA1 is required in the mushroom body neurons for aversive and appetitive learning in Drosophila. J Neurosci. 27 (29), 7640-7647 (2007).
  27. Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Curr Biol. 15 (21), 1953-1960 (2005).
  28. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: Anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3 (5), 1-17 (2009).
  29. Liu, C., Plaçais, P. Y., Yamagata, N., et al. A subset of dopamine neurons signals reward for odour memory in Drosophila. Nature. 488 (7412), 512-516 (2012).
  30. Burke, C. J., Huetteroth, W., Owald, D., et al. Layered reward signaling through octopamine and dopamine in Drosophila. Nature. 492 (7429), 433-437 (2012).
  31. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  32. Gervasi, N., Tchenio, P., Preat, T. PKA dynamics in a Drosophila learning center: Coincidence detection by rutabaga adenylyl cyclase and spatial regulation by dunce phosphodiesterase. Neuron. 65 (4), 516-529 (2010).
  33. Séjourné, J., Plaçais, P. Y., Aso, Y., et al. Mushroom body efferent neurons responsible for aversive olfactory memory retrieval in Drosophila. Nat Neurosci. 14 (7), 903-910 (2011).
  34. Aso, Y., Sitaraman, D., Ichinose, T., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, 04580(2014).
  35. Pai, T. P., Chen, C. C., Lin, H. H., et al. Drosophila ORB protein in two mushroom body output neurons is necessary for long-term memory formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (19), 7898-7903 (2013).
  36. Owald, D., Felsenberg, J., Talbot, C. B., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
  37. Perisse, E., Owald, D., Barnstedt, O., Talbot, C. B., Huetteroth, W., Waddell, S. Aversive learning and appetitive motivation toggle feed-forward inhibition in the Drosophila mushroom body. Neuron. 90 (5), 1086-1099 (2016).
  38. Aso, Y., Rubin, G. M. Dopaminergic neurons write and update memories with cell-type-specific rules. Elife. 5, 16135(2016).
  39. Hige, T., Aso, Y., Rubin, G. M., Turner, G. C. Plasticity-driven individualization of olfactory coding in mushroom body output neurons. Nature. 526 (7572), 258-262 (2015).
  40. MacMillan, H. A., Nørgård, M., MacLean, H. J., Overgaard, J., Williams, C. J. A critical test of Drosophila anaesthetics: Isoflurane and sevoflurane are benign alternatives to cold and CO2. J Insect Physiol. 101, 97-106 (2017).
  41. Margulies, C., Tully, T., Dubnau, J. Deconstructing memory in Drosophila. Curr Biol. 15 (17), R700-R713 (2005).
  42. Amiri, A., Karvandian, K., Ramezani, N., Amiri, A. Short-term memory impairment in patients undergoing general anesthesia and its contributing factors. Saudi J Anaesth. 14 (4), 454-458 (2020).
  43. Wang, R., Zhang, L., Wang, X., et al. Electrophysiological activity pattern of mouse hippocampal CA1 and dentate gyrus under isoflurane anesthesia. Front Cell Neurosci. , 18(2024).
  44. Berry, J. A., Cervantes-Sandoval, I., Chakraborty, M., Davis, R. L. Sleep facilitates memory by blocking dopamine neuron-mediated forgetting. Cell. 161, 1656-1667 (2015).
  45. Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Sci Rep. 10, 1-15 (2020).
  46. Moore, R. J. D., et al. FicTrac: A visual method for tracking spherical motion and generating fictive animal paths. J Neurosci Methods. 225, 106-119 (2014).
  47. Seelig, J. D., Chiappe, M. E., Lott, G. K., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

Imagerie fonctionnelleoubli de la mémoiremicroscopie confocaleimagerie calciquecorps pedunculéspréparation de mouche éveilléeplasticité synaptique
In vivo Imagerie de l’activité neuronale chez des mouches adultes drosophiles non anesthésiées
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.