Visualisation par rayons X d’une perfusion ablative intracanalaire à base d’éthanol pour la prévention du cancer du sein dans des modèles de lapin

Résumé

Ce protocole présente une procédure de perfusion guidée par l’image dans le système arborescent canalaire de la glande mammaire du lapin. Nous démontrons l’infusion contrôlée d’une solution ablative à base d’éthanol contenant un agent de contraste à rayons X dans toutes les ouvertures des trayons par imagerie en temps réel par fluoroscopie.

Résumé

Le cancer du sein est la deuxième cause de décès chez les femmes. Bien qu’il existe peu d’interventions proactives pour les femmes à risque moyen, la mastectomie prophylactique est l’intervention la plus efficace pour réduire les risques pour les femmes à risque élevé. Cependant, la mastectomie prophylactique est une procédure invasive qui consiste à enlever toutes les cellules épithéliales mammaires ainsi que le stroma, le tissu adipeux et/ou la musculature environnants. Notre objectif global de recherche est de développer une procédure d’administration intracanalaire (DI) non invasive qui tue localement les cellules épithéliales mammaires en remplissant l’ensemble de l’arbre canalaire avec une solution ablative. Nous avons précédemment démontré que l’administration d’éthanol par ID en tant que solution ablative est efficace dans des modèles de rongeurs (souris et rats). Ce protocole présente une administration ID d’une solution d’éthanol à 10-70 % contenant de l’iohexol (90-300 mg/mL) comme agent de contraste à rayons X dans le système d’arbre multicanalaire de la glande mammaire du lapin. La glande mammaire d’un lapin (Oryctolagus cuniculus) avec un système multi-canaux ressemble davantage à la poitrine humaine que celles d’autres grands animaux (par exemple, les vaches, les moutons). Ce protocole pour lapins relève les défis techniques de l’évolutivité, de l’imagerie en temps réel et de la transmission d’ID dans un système d’arbre multicanalaire dans un modèle intermédiaire de grand animal. Ce protocole établit une administration d’identification multi-conduits guidée par fluoroscopie avec des instruments, des matériaux et des réactifs qui pourraient être appliqués directement en clinique. L’analyse tissulaire permet d’optimiser la concentration d’éthanol pour une ablation épithéliale maximale et des lésions tissulaires collatérales minimales, comme point de départ pour la future première évaluation chez l’homme de cette procédure ablative pour la prévention primaire du cancer du sein.

Introduction

Le cancer du sein est le décès par cancer le plus fréquent et le deuxième plus élevé chez les femmes aux États-Unis. Les projections pour 2025 estiment qu’il y aura 316 950 nouveaux cancers du sein et que 42 170 femmes mourront de la^1ère ère année de la Colombie-Britannique. À l’heure actuelle, la mastectomie prophylactique bilatérale est la procédure la plus efficace pour prévenir la carcinome. Cependant, il s’agit d’une procédure très invasive qui implique une ablation complète des cellules épithéliales, à partir desquelles le carcinome du sein se développe, et des tissus environnants. En raison de son caractère invasif ainsi que de l’impact psychologique et social de cette procédure, moins de 50 % des femmes à haut risque subissent une mastectomie à risque^réduit 2. Avec d’autres, nous avons mis au point des procédures d’administration intracanalaire (DI) pour la prévention primaire et/ou le traitement local du cancer du sein chez^{les rongeurs 2,3} comme alternative aux préventions et aux traitements actuels. L’éthanol (EtOH) a un faible profil de toxicité et d’innocuité qui est bien établi et est utilisé dans de multiples applications cliniques, telles que les agents sclérosants pour le traitement des malformations veineuses et comme agent ablatif pour le traitement local de certains cancers³. En règle générale, plusieurs millilitres d’EtOH sont perfusés ou délivrés à une concentration de 90 à 100 % dans ces procédures cliniques. Dans nos travaux précédents, l’administration de 70 % d’EtOH directement dans le système d’arbre canalaire de modèles de souris et de rats a été efficace pour ablater chimiquement les cellules épithéliales mammaires avec des dommages limités aux tissus normaux adjacents, et pour prévenir la formation de tumeurs mammaires 4,5,6,7. Au fur et à mesure que cette procédure est mise à l’échelle du système d’arbre canalaire plus grand d’un lapin avec un rapport plus grand volume luminal / surface des cellules épithéliales luminales, nous explorons les propriétés ablatives d’une solution avec un pourcentage plus faible d’EtOH (10 % à 70 %). En cherchant une traduction clinique, nous pensons que le pourcentage le plus faible d’éthanol efficace pour ablater les cellules épithéliales sera le mieux toléré et aura le meilleur profil d’innocuité.

La confirmation d’un remplissage complet de l’arbre canalaire est nécessaire pour garantir que la solution ablative est entrée en contact direct avec les cellules épithéliales mammaires. Dans nos études précédentes sur des modèles de rongeurs, la visualisation par rayons X d’arbres ductaires infusés par imagerie microCT a été utilisée après la procédure. En raison du temps nécessaire pour anesthésier, transférer, régler et positionner l’animal pour l’imagerie, l’Omnipaque (iohexol) approuvé par la FDA ou des agents de contraste à diffusion rapide similaires contenant de l’iode ne convenaient pas à la visualisation canalaire chez les rongeurs ^6,8. Nous avons constaté que les agents de contraste à base de nanoparticules, en particulier ceux contenant des nanocristaux d’oxyde de tantale, se diffusaient plus lentement et convenaient mieux à la visualisation d’arbres canalaires chez les rongeurs 6,7,8,9. Cependant, cette confirmation a posteriori par imagerie microCT ne nous permet pas de surveiller ou de contrôler la quantité de volume perfusé et s’écarte des procédures de diagnostic cliniquement établies, telles que la ductographie^10,11, pour la visualisation de l’arbre canalaire. Ainsi, une étape clé pour établir la faisabilité technique de l’application de cette procédure d’identification à l’homme est de démontrer la visualisation par fluoroscopie en temps réel de l’arbre canalaire infusé dans un modèle animal de taille et de complexité croissantes de ses glandes mammaires. Ce protocole étend cette procédure ablative des rongeurs ^4,5 aux modèles de lapins. Sur le plan de l’évolution, de l’anatomie et de la physiologie, les glandes mammaires du lapin ressemblent davantage à la poitrine humaine qu’à celles des rongeurs ou d’autres grands modèles animaux, tels que les vaches et les moutons 12,13,14. Les lapines ont quatre paires de glandes mammaires, chacune contenant quatre arbres ductaires, tandis que les rongeurs n’ont qu’un seul arbre canalaire par glande mammaire. Les trayons de lapin peuvent être canulés ^15,16 en utilisant une procédure similaire à l’administration ID d’un agent de contraste en ductographie clinique dans la première recherche clinique chez l’homme. Par conséquent, les lapins fournissent un modèle intermédiaire pratique et pertinent pour l’application translationnelle de cette procédure ablative d’identification aux humains. Ce protocole répond aux défis techniques de l’administration de l’identification et de l’imagerie in vivo d’un système d’arbre multicanalaire qui n’auraient pas pu être abordés dans des modèles de rongeurs. Ce protocole utilise des instruments, des réactifs et des matériaux compatibles avec la pratique clinique actuelle pour la visualisation des arbres canalaires. Ainsi, la procédure décrite pour la perfusion guidée par fluoroscopie d’une solution ablative à base d’éthanol contenant de l’iohexol pourrait être facilement mise en œuvre et évaluée dans les premiers essais cliniques chez l’homme.

Cette méthode a été mise en œuvre dans notre laboratoire pour réussir à canuler et à infuser séquentiellement les quatre arbres ductaires d’une ou plusieurs glandes mammaires chez un lapin, en une seule séance, avec une solution ablative à base d’éthanol contenant un agent de contraste (Figure 1, Figure 2, Figure 3). Cette méthode consiste à infuser la solution ablative directement dans l’ouverture du trayon canulé avec une aiguille à pointe émoussée de 27 G d’un lapin (vierge de 4 mois) sur une table de fluoroscopie. Cette intervention est réalisée sur un animal sous anesthésie générale (isoflurane) avec un traitement anti-inflammatoire péri- et post-intervention (kétoprofène, anti-inflammatoire non stéroïdien). L’imagerie par fluoroscopie nous permet de surveiller le remplissage de l’arbre canalaire en temps réel, de contrôler le taux et la quantité de volume distribué et/ou de déterminer le succès de l’administration de l’identification dans chaque système d’arbre individuel (Figures 1, Figure 2, Figure 3). Cette technique de fluoroscopie se rapproche davantage de l’application clinique prévue pour le guidage par l’image du traitement ablatif et peut aider à limiter la dose globale de rayonnement imposée au patient. Ce protocole démontre que l’Omnipaque (iohexol) approuvé par la FDA est un agent de contraste approprié pour visualiser le remplissage initial de l’arbre canalaire du lapin (Figure 3). Les observations par examen macroscopique et l’analyse histologique montrent qu’une concentration d’éthanol de 70 % provoque des lésions tissulaires rapides à l’intérieur et à l’extérieur de l’arbre canalaire et s’étendant au-delà de la structure de la glande mammaire (Figure 3). Une concentration d’éthanol de l’ordre de 10 à 40 % permet une ablation adéquate des cellules épithéliales avec des lésions tissulaires collatérales inférieures à celles de l’éthanol à 70 % (figure 4). Des études longitudinales utilisant cette procédure avec une taille de groupe par solution ablative appropriée et des collectes de tissus chronométrées seront nécessaires pour établir les paramètres optimaux de la solution ablative pour son évaluation clinique chez les patients humains.

Protocole

Toutes les expériences décrites ont été menées selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Michigan. Les lapins (Oryctolagus cuniculus) ont été soignés conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et à la loi sur le bien-être des animaux de l’USDA dans un établissement accrédité par l’AAALAC.

REMARQUE : Cette méthode a été mise en œuvre chez des animaux blancs de Nouvelle-Zélande vierges (nullipares) et reproducteurs retraités (multipares) âgés (4 mois à > 1 an) et pesant (2,6 à 4,2 kg) acquis auprès de sources commerciales. D’après notre expérience, la taille de l’animal déterminée par le poids est plus fiable que l’âge de l’animal pour prédire la taille des tétines. Généralement, les animaux qui pèsent plus de 3,3 kg se présentent avec des trayons adaptés à la canulation. Le protocole décrit ci-dessous se concentre sur les animaux vierges âgés de 4 à 5 mois et pesant plus de 3,3 kg, car ils sont plus appropriés pour les études d’efficacité à long terme, de cicatrisation des plaies, de toxicité et d’innocuité.

1. Préparation préopératoire

1. Acclimater les animaux dans la nouvelle installation pendant au moins 1 semaine à leur arrivée, en particulier pour les animaux destinés aux procédures de récupération et aux études à long terme. Au cours de cette première semaine, surveillez / vérifiez les lapins quotidiennement et fournissez des friandises, un enrichissement nutritionnel tel que recommandé par les directives de l’établissement, pour aider au processus d’acclimatation.
2. Achetez le lapin (~ 4 mois New Zealand White) dans l’établissement d’hébergement approuvé. Notez le poids corporel avant l’intervention.
   REMARQUE : Le poids corporel peut être enregistré la veille de l’intervention pour préparer les calculs requis pour l’anesthésie. Les reproducteurs à la retraite (> 1 an, > 3,5 kg) peuvent également être utilisés car ils ont des trayons plus grands et permettent une canulation plus facile des canaux individuels (figure 3). Pour ces raisons, les éleveurs à la retraite peuvent être utilisés dans des expériences initiales pour se familiariser avec le processus intracanalaire et l’optimiser.
3. Injecter 35 mg/kg de kétamine et 5 mg/kg de xylazine par voie intramusculaire 20 min avant l’administration d’isoflurane pour calmer l’animal.
   REMARQUE : L’anesthésie est administrée en fonction du poids du lapin et les plages pour chaque médicament sont les suivantes : 15-35 mg/kg pour la kétamine et 2-5 mg/kg pour la xylazine. Assurez-vous que l’animal est sous sédatif avant de passer à l’épilation et à l’intubation. Ceci est pour le bien-être et la sécurité des animaux et du personnel. Après confirmation de la sédation, le lapin peut ensuite être placé dorsalement sur la table d’imagerie/opération.
4. Injecter 5 mg/kg de kétoprofène par voie sous-cutanée pour l’analgésie après l’apparition de signes cliniques de sédation (c.-à-d. comportement silencieux et yeux partiellement fermés et de couleur rose).
   REMARQUE : L’analgésie est administrée en fonction du poids du lapin et la plage pour le kétoprofène est de 2 à 5 mg / kg.
5. Intubez le lapin avec l’équipement approprié (p. ex., sonde endotrachéale ou dispositif supraglottique) et branchez-le à un appareil isoflurane (1 à 2 % d’isoflurane, 1,0 L/min d’oxygène) qui a été testé et certifié pour anesthésier le lapin. Surveillez attentivement la respiration de l’animal pour vous assurer que l’anesthésie est maintenue à 1-2 % d’isoflurane. Surveillez la saturation en oxygène du lapin via la SpO₂, la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire et la température tout au long de la procédure.
   REMARQUE : La taille du tube d’intubation est basée sur le poids et la taille du lapin. Cependant, la gamme de tailles n’est pas toujours précise, il est donc utile d’avoir une variété de tailles pour voir laquelle convient le mieux à ce lapin particulier. Un masque à cône nasal peut également être utilisé à la place d’un tube endotrachéal à des fins d’anesthésie¹⁷, sachant que ce masque n’offre pas de protection des voies respiratoires de l’animal offerte par l’intubation. Des couvertures de circulation d’eau chaude (couvertures chauffantes) réglées à 37°C sont placées sous des serviettes pour maintenir la température corporelle du lapin.
6. Placez et fixez un cathéter veineux de 25 G dans la veine marginale de l’oreille pour permettre l’administration d’urgence du médicament.
   REMARQUE : Une plage de calibre de 24 à 26 peut être utilisée en fonction de la taille de la veine de lapin.
7. Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir l’irritation oculaire et le dessèchement de la cornée.
8. Rasez la fourrure autour des deuxième et troisième paires de trayons avec un rasoir électrique. À l’aide d’un coton-tige, étalez la crème dépilatoire sur la zone des trayons. Laissez la crème entrer en contact avec la zone pendant 15 s.
   REMARQUE : Une extrême prudence doit être prise afin de ne pas endommager les trayons avec le rasoir. Un aspirateur sans fil peut également être utilisé pour aider à maintenir une zone de procédure propre.
9. Mouillez un tampon de gaze avec une solution saline stérile et utilisez-le pour rincer la crème et détacher la fourrure de l’animal après 15 secondes d’application de la crème démaquillante. Confirmez une bonne visibilité et un bon accès à la zone du trayon d’où la fourrure a été enlevée. Répétez l’opération si nécessaire.
   REMARQUE : La crème doit rester sur le lapin pendant l’intervalle le plus court possible, entre 10 et 30 s et être complètement retirée pour éviter les brûlures chimiques de la peau.

2. Perfusion intracanalaire

1. Préparez une solution ablative en mélangeant des volumes appropriés de solutions mères dans des conditions stériles dans une hotte de culture tissulaire BSL2.
   REMARQUE : L’iohexol (350 mg d’iode/mL) doit être conservé dans un endroit sombre en raison de la sensibilité à la lumière. Une gamme de concentrations d’EtOH a été utilisée au cours de cette expérience. Pour tester d’autres pourcentages d’EtOH, diluez les solutions mères à la concentration nécessaire de solution ablative. Pour maintenir la même concentration d’iode dans une solution ablative avec différents pourcentages d’EtOH, de PBS ou d’eau stérile, on peut utiliser pour combler la différence de volume.
2. Pour cet exemple, préparez une solution ablative fraîche de 10 % d’EtOH, 280 mg d’iode/mL d’iohexol, 1 % de colorant alimentaire dans un tube de 5 mL. Pour un volume final de 5 ml, ajoutez 4 ml de stock d’iohexol (350 mg d’iode/mL), 500 μL d’EtOH à 100 % (200 proof), 450 μL de PBS, 50 μL de colorant alimentaire bleu de base.
   REMARQUE : Chaque arbre canalaire peut être rempli jusqu’à 400 μL, mais généralement 250-350 μL pour les animaux de moins de 3,5 kg. Evans Blue jusqu’à 0,2 % peut être utilisé à la place du colorant alimentaire. Evans Blue peut être une option privilégiée si des analyses de montage entier ou d’autres analyses tissulaires sont prévues immédiatement après la ou les perfusions.
3. Enlevez toute peau morte qui recouvre les ouvertures canalaires à l’aide d’une pince fine et pointue.
   REMARQUE : Les lapins peuvent avoir un bouchon kératinisé dépassant du trayon qui peut empêcher la canulation réussie s’il n’est pas retiré. La lidocaïne topique peut également être appliquée autour du trayon pour aider à minimiser l’irritation autour du site d’injection (tableau 1).
4. Essuyez le site de perfusion avec des compresses de gaze de chlorhexidine.
   REMARQUE : La chlorhexidine est utilisée comme agent nettoyant pour désinfecter le site d’injection avant la canulation (tableau 1).
5. Insérez le biseau d’une aiguille de 28 G (longueur : 12,7 mm) sur le côté du trayon et injectez lentement 200 μL de solution saline à 0,9 % à un débit de 200 μL/min. Cela permet une meilleure visualisation des ouvertures canalaires.
   REMARQUE : Il n’est peut-être pas nécessaire d’injecter tous les 200 μL de solution saline dans le trayon ; Arrêtez l’injection une fois que vous voyez la solution saline sortir d’une ou de plusieurs ouvertures canalaires.
6. Aspirer 1 mL de solution ablative préparée à l’aide d’une seringue Luer lock de 1 mL. Fixez la seringue à l’extrémité femelle « ailée » de la ligne d’extension mâle-femelle de 12 pouces. Fixez avec précaution une aiguille à pointe émoussée de 27 g (longueur : 12,7 mm) à l’extrémité mâle de la ligne d’extension. Amorcez la ligne avec la solution. Essuyez l’aiguille avec un tampon de gaze imbibé d’alcool. Veillez également à ne pas renverser la seringue avec la solution ablative, car cela pourrait provoquer la formation de bulles d’air.
   REMARQUE : Il s’agit des volumes recommandés pour remplir complètement l’arbre canalaire : jusqu’à 300 μL dans chaque arbre et jusqu’à 1,2 mL par glandes mammaires cervicales et/ou inguinales (1^ère et 4^ème paires), jusqu’à 400 μL dans chaque arbre et jusqu’à 1,6 ml par glandes mammaires thoraciques et/ou abdominales (2^ème et 3ème^paires ). Pour d’autres applications, il peut être approprié d’utiliser des volumes plus petits ou plus grands en fonction des exigences expérimentales et/ou des conseils de fluoroscopie pour éviter de trop remplir l’arbre canalaire. La ligne d’extension permet un meilleur contrôle du débit et une imagerie simultanée par perfusion et fluoroscopie en direct. À titre de comparaison, les volumes recommandés de perfusion intracanalaire chez^{les souris âgées} de 9 à 12 semaines 4 sont les suivants : jusqu’à 30 μL dans les glandes mammaires cervicales et inguinales et jusqu’à 50 μL dans les glandes mammaires thoraciques et abdominales, et modèles chez le rat⁵ : jusqu’à 100 μL dans les glandes mammaires cervicales et inguinales et jusqu’à 300 μL dans les glandes mammaires thoraciques et abdominales.
7. Utilisez une lampe loupe 10x pour aider à localiser les ouvertures canalaires. Tenez doucement la tétine à l’aide des doigts et canulez l’aiguille dans l’ouverture canalaire. Continuez doucement à insérer l’aiguille à pointe émoussée de 27 g jusqu’à ce que la pointe soit complètement à l’intérieur de la tétine. Pour loger l’aiguille dans la tétine, amenez la tétine vers l’aiguille au lieu de pousser l’aiguille vers le bas dans la tétine. Prenez soin de suivre le trajet de l’ouverture canalaire.
   REMARQUE : Chez certains lapins, vous pouvez ressentir une résistance lorsque vous essayez d’insérer l’aiguille dans la ou les ouvertures du trayon. Appliquez délicatement une légère pression pour percer la couche supérieure des cellules épithéliales. D’après notre expérience, un appareil de grossissement est nécessaire pour identifier clairement l’ouverture canalaire pour la canulation. Il peut s’agir d’une lampe loupe, d’une lentille, d’une loupe ou d’un appareil similaire.
8. Perfusez lentement 300 μL de la solution à un débit constant d’environ 200 μL/min une fois l’aiguille complètement insérée. Attendre 30 s après l’infusion pour retirer l’aiguille de l’arbre canulé ; Cela garantit que le volume injecté reste dans l’arbre canalaire et réduit le risque de fuite.
   REMARQUE : En règle générale, il y a un chercheur qui canule et tient l’aiguille, tandis qu’un deuxième chercheur tient la seringue et pousse le piston à la vitesse souhaitée. Un tire-seringue peut être utilisé pour avoir un débit plus contrôlé, car des changements brusques de débit de perfusion peuvent éclater ou endommager les arbres ductaires.
9. Nettoyez toute solution renversée avec de la gaze humidifiée ou une lingette EtOH pour éviter la présence de solution de contraste étrangère dans les images.

3. Imagerie par fluoroscopie

1. Prenez des images de fluoroscopie après la perfusion de chaque arbre canalaire. Les paramètres de la fluoroscopie sont : 30 fps, 67 kV et 17,3 mA sur un instrument de fluoroscopie à rayons X. Cependant, ajustez-les en fonction de l’expérience et des besoins d’imagerie.
2. Utilisez les images de fluoroscopie pour déterminer si un volume supplémentaire est nécessaire pour remplir complètement l’arbre canalaire.
   REMARQUE : L’imagerie par fluoroscopie peut avoir lieu en direct en même temps que la perfusion de la solution abattive. Des pinces en métal ou en plastique peuvent être utilisées pour tenir le trayon pendant l’imagerie afin de protéger le personnel des rayons X nocifs. Cela permet de surveiller le remplissage du ou des arbres ductaux. La fluoroscopie en direct peut indiquer quand arrêter la perfusion en fonction de l’augmentation du volume aux extrémités des alvéoles. La fluoroscopie après la perfusion peut confirmer si l’arbre canalaire a été complètement rempli ou s’il y a eu une fuite. Une fluoroscopie de confirmation est généralement réalisée après la perfusion de chaque canal dans la même glande mammaire.

4. Soins postopératoires et récupération

1. Interrompre l’écoulement de l’isoflurane après la dernière perfusion intracanalaire.
2. Injecter 0,5 mg/kg d’atipamézole par voie intramusculaire.
   REMARQUE : Le temps de récupération varie d’un animal à l’autre, mais le lapin doit commencer à montrer des signes de récupération 5 à 20 minutes après l’injection.
3. Fournir un soutien thermique continu à l’animal sur une couverture chauffante jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli de l’anesthésie. Maintenez le débit d’oxygène jusqu’à 5 minutes avant de retirer l’anesthésie.
   REMARQUE : Les signes de récupération comprennent des mouvements de la bouche tels que la mastication, la toux, les contractions du nez et/ou les mouvements oculaires. Les lapins doivent avoir un réflexe de redressement et être capables de se maintenir en position sternale avant d’être remis dans le transporteur de récupération. L’agent de récupération est administré en fonction du poids du lapin avec une plage de 0,1 à 1 mg/kg d’atipamezole.
4. Injecter 5 mg/kg de kétoprofène par voie sous-cutanée.
5. Retirez le cathéter intraveineux une fois que le lapin peut se maintenir en position sternale. Tenez un tampon de gaze à l’endroit où le cathéter a été retiré pour arrêter tout saignement excessif.
   REMARQUE : Le retrait du cathéter peut avoir lieu lorsque le lapin est dans le transporteur de transport.
6. Transportez le lapin vers le logement approprié.
7. Poursuivre les injections de 5 mg/kg de kétoprofène par voie sous-cutanée pendant au moins 3 jours après l’intervention.
8. Surveillez le lapin pour détecter des signes d’inconfort, de détresse, de douleur et d’automutilation une fois par jour pendant au moins 3 jours après l’intervention. Si le lapin présente l’un de ces signes cliniques, le traitement au kétoprofène peut être prolongé. Enregistrez et surveillez le poids corporel pour évaluer les signes d’anorexie.
   REMARQUE : Le kétoprofène est administré en fonction du poids du lapin avec une plage de 2 à 5 mg / kg. Il peut être administré toutes les 24 heures jusqu’à 5 jours après la perfusion intracanalaire pour réduire l’inflammation et minimiser les cicatrices. Pour minimiser les effets indésirables de l’ulcération cutanée ou d’autres problèmes liés à la cicatrisation des plaies, appliquez la lidocaïne par voie topique sur le site d’injection. Tout animal présentant des signes persistants d’inconfort, de détresse, de douleur ou de blessure après un traitement au kétoprofène doit être euthanasié.

5. Analyse tissulaire

1. Administrer une solution d’euthanasie (pentobarbital sodique et phénytoïne sodique) par voie intraveineuse à 100 mg/kg. Après 60 secondes, vérifiez les signes de vie par pincement des orteils/oreilles, des signes de respiration ou de rythme cardiaque, un réflexe cornéen et/ou une stimulation de la pupille.
2. Effectuez une nécropsie pour prélever le tissu de la glande mammaire et le processus pour la procédure d’enrobage de paraffine de routine après 24 à 36 h dans du formol¹⁸ tamponné neutre à 10 %. Ensuite, effectuez une coloration standard à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et/ou une coloration immunohistochimique avec un marqueur spécifique au type de cellule pour aider à l’analyse souhaitée¹⁸. Éliminer la carcasse selon le protocole d’élimination approprié (p. ex., incinération).
3. Analysez les tissus de la glande mammaire en consultation avec un pathologiste. Utilisez un logiciel pour aider à quantifier le taux d’ablation et les lésions tissulaires collatérales.
   REMARQUE : L’analyse des tissus a été effectuée sur des lapins blancs de Nouvelle-Zélande âgés de 4 mois dans l’heure suivant les perfusions (Figure 4) avec le logiciel ouvert QuPath pour l’analyse des bioimages (https://qupath.github.io/). Cette analyse est basée uniquement sur des tissus colorés à l’H&E. QuPath ou un logiciel informatique similaire nécessite une saisie et un étalonnage par un pathologiste. Certaines cellules peuvent être mal classées en utilisant uniquement des caractéristiques morphologiques (Figure 4). L’utilisation de marqueurs spécifiques au type cellulaire tels que les cytokératines et l’actine musculaire α-lisse peut être utilisée pour améliorer la classification assistée par ordinateur⁶. En fin de compte, l’analyse de la classification cellulaire doit être organisée et validée par un pathologiste.

Résultats

Chacune des 8 glandes mammaires d’une lapine contient 4 arbres ductaires qui s’ouvrent au niveau d’orifices indépendants des trayons (Figure 2). En raison de la différence de taille et de nombre d’arbres canalaires par glande mammaire entre les rongeurs (seulement 1 conduit par glande mammaire), les lapins sont un bon modèle intermédiaire pour la traduction humaine. Nous pouvons infuser jusqu’à 400 μL de solution d’EtOH à 10-70 % pour remplir tout l’arbre canalaire de n’importe quelle glande mammaire de lapins blancs de Nouvelle-Zélande âgés de 4 mois (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, ^{4, 8, 9}). Nous pouvons infuser jusqu’à 4 arbres ductaires dans jusqu’à 8 glandes mammaires avec la solution ablative en une seule séance. Un plan expérimental typique consiste à infuser 2 à 3 arbres ductaires dans une seule glande mammaire dans un maximum de 4 glandes mammaires avec une solution ablative particulière contenant un agent de contraste à rayons X à base d’iode (Figure 2,  Figure 3). Pour la solution ablative contenant de l’iohexol (90-300 mg d’iode/mL), une fluoroscopie est effectuée pendant et/ou après chaque perfusion afin de déterminer le succès individuel de la perfusion de chaque arbre canalaire avec une quantité partielle ou totale de solution perfusée (Figure 2, Figure 3). Le prélèvement du tissu de la glande mammaire permet d’évaluer comment les changements de formulation affectent la destruction des cellules épithéliales mammaires (Figure 4). Ces analyses d’imagerie fournissent des informations permettant de comprendre la solution la plus appropriée pour obtenir une ablation maximale tout en minimisant les dommages aux tissus environnants. Nous avons déterminé qu’une solution d’EtOH à 10 % offre un taux d’ablation comparable aux solutions ablatives contenant un pourcentage plus élevé d’EtOH (Figure 4).

Figure 1 : Déroulement de la procédure intracanalaire. Les étapes clés de la procédure d’identification sont mises en évidence. Veuillez consulter la vidéo pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Étapes clés de la canulation et de la perfusion intracanalaires. (A) Injection de solution saline perpendiculaire au trayon pour dilater les ouvertures canalaires pour la canulation (vue du plan médian). (B) La canulation et le remplissage d’un arbre canalaire (D1) peuvent être suivis avec un colorant bleu dans la solution ablative (vue du plan médian). (C) L’imagerie par fluoroscopie en temps réel offre un suivi précis et à haute résolution du remplissage de l’arbre canalaire (D1) avec de l’iohexol dans la solution ablative (vue du plan dorsal). Les ouvertures de l’arbre ductal sont numérotées de gauche à droite, en commençant par le quadrant supérieur (D1, quadrant supérieur gauche) et en terminant par le quadrant inférieur (D4, quadrant inférieur droit). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Taille de la tétine et administration réussie de la solution ablative à plusieurs conduits. Présentation typique de la taille des trayons chez les lapins blancs de Nouvelle-Zélande. La taille des trayons varie en fonction du poids et de l’âge du lapin. Les glandes mammaires sont numérotées du haut à gauche (L1, cervicale gauche) au bas à droite (R8, inguinal droit). Toutes les images sont affichées dans le plan dorsal. (A) Lapin vierge de 2,8 kg (en haut) avec des trayons plus petits, difficiles à canuler, lapin vierge de 3,5 kg (au milieu) avec des trayons adaptés à la canulation, et lapin multipare de 4,1 kg (en bas) avec des trayons plus grands, beaucoup plus faciles à canuler. (B) Un colorant alimentaire bleu dans la solution infusée peut être utilisé comme preuve in vivo d’administration intracanalaire et de remplissage de l’arbre canalaire. L’infusion infructueuse est indiquée par un contour rouge (administration du coussinet adieux, en haut) et les perfusions réussies par un contour bleu (administration intracanalale, milieu et bas). Une solution d’EtOH à 70 % cause plus de dommages à la peau (érythème) quelques minutes après la perfusion (bleu foncé, panneau du milieu) qu’une solution à 10 % (bleu clair, panneau inférieur). (C) La fluoroscopie fournit des preuves in vivo d’administration intracanalaire. Infusion infructueuse (administration du coussinet adieux, panneau supérieur). Perfusion séquentielle réussie de D1 ductal d’abord et de D2 d’arbre ductal ensuite (panneau en bas à gauche). La fluoroscopie en direct fournit un guidage d’image pour le remplissage (flèches blanches) de l’arbre canalaire D3 (panneau en bas à droite) ; La ligne d’extension remplie d’une solution ablative contenant de l’iohexol et la pince pour tenir la tétine sont également visibles. Les barres d’échelle correspondent à 1 cm dans les images à différents grossissements. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse tissulaire des glandes mammaires chez des lapins blancs de Nouvelle-Zélande après procédure intracanalaire avec une solution ablative à base d’éthanol. (A-B) Coloration H&E représentative d’une glande mammaire inguinale droite d’un animal de 4 mois sans traitement ablatif par rapport à une glande mammaire inguinale droite d’un autre animal avec un traitement ablatif à 10 % d’EtOH. Les tranches de tissu sont coupées le long du plan médian, de sorte que D1 et D3 (arbres ductaires gauches) sont représentés sur les mêmes coupes de tissus. La vue du tissu entier (A) et la vue à fort grossissement (B) montrent les effets morphologiques et chromatiques de l’ablation par l’EtOH sur la coloration H&E (panneaux supérieurs) et les classes de cellules épithéliales et stromales déduites sur la base d’un classificateur entraîné par ordinateur (panneaux inférieurs). La barre d’échelle noire correspond à 1 mm en A et la barre d’échelle blanche à 100 μm en B. (C) La barre graphique montre la distribution des classes de cellules dans les arbres ductaires (n > 4 par groupe) traités avec différentes concentrations d’EtOH ou non traités. Les astérisques indiquent la valeur p du test t de Welch non apparié de chaque classe de cellules par groupe par rapport à sa classe de cellules correspondantes dans le groupe traité à 10 % par EtOH (* <0,05, ** < 0,01, **** <0,0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans nos études précédentes, nous avons montré qu’une délivrance ID de 70 % d’EtOH ablate les cellules épithéliales mammaires tout en causant des dommages minimes aux tissus environnants chez les rongeurs ^6,7. Dans cette procédure, nous avons démontré qu’une perfusion ID d’une solution ablative peut être mise à l’échelle jusqu’à un modèle de lapin. En particulier, nous démontrons dans ce modèle plus large avec un système d’arbre multi-canalaire que l’infusion séquentielle de tous les canaux d’une glande mammaire peut être perfusée avec succès. Il s’agit de la prochaine étape de la traduction de cette procédure ablative en une alternative viable à la mastectomie prophylactique pour la prévention primaire chez les personnes à haut risque.

L’agent de contraste à rayons X à base d’iode Omnipaque (iohexol), approuvé par la FDA, nous permet d’évaluer le succès de la perfusion, en visualisant en direct le processus d’administration de la solution à travers l’arbre ductaire. L’utilisation de la fluoroscopie pour visualiser la glande mammaire perfusée correspond étroitement à ce qui est susceptible d’être l’équipement et les instruments déployés pour apporter cette procédure guidée par l’image à la clinique^10,11. Cette modalité d’imagerie nous permettra de savoir quand arrêter la perfusion, faisant ainsi de la fluoroscopie en direct un élément clé de la mise en œuvre clinique de cette procédure ablative. Nous avons établi l’évolutivité de cette procédure des arbres canalaires de rongeurs aux lapins, mais des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer le pourcentage d’EtOH qui ablate le mieux les cellules épithéliales mammaires tout en minimisant les dommages aux tissus environnants dans ce modèle animal plus grand. Ce protocole portait sur la faisabilité d’une perfusion intracanalaire et d’une analyse tissulaire immédiatement après l’intervention. Les stratégies de dépannage et les conseils utiles sont détaillés dans le Tableau 1. Bien que l’objectif principal de ce protocole soit de fournir des solutions ablatives à base d’éthanol, ce protocole peut être utilisé dans d’autres applications pour administrer localement d’autres réactifs d’imagerie, des systèmes de modification de gènes tels que CRISPR/Cas9, des vecteurs lentiviraux, des siRNA, des facteurs de croissance et/ou des cancérogènes ^2,3 pour étudier d’autres aspects du développement des glandes mammaires et de l’oncogenèse chez le lapin.

En conclusion, ce protocole fournit les outils de recherche nécessaires à la réalisation d’une étude systématique et longitudinale des effets locaux et systémiques de différentes solutions ablatives. Ces informations détermineront l’innocuité de cette procédure et identifieront toute préoccupation liée à la poursuite du développement et de l’évaluation clinique dans les premiers essais cliniques chez l’homme.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Loupe 10X avec lumière et pince, grand col de cygne	Amazone	B0D982JCZ2	Pour la visualisation des trayons
Seringues à insuline Exel International	Fisher Scientific	14-841-31	Pour l’injection péricanalaire de solution saline
Aiguilles émoussées en vrac calibre 27 longueur 0,5	Technologies d’infusion SAI	B27-50 100 En vrac	Pour la canulation intracanalaire
Bleu Evans	Sigma	E2129-50G	Pour la visualisation de la glande mammaire
Système d’imagerie par rayons X fluoroscopique	GE Soins de santé	DT-C31-01  ;   ;	Pour l’acquisition d’images fluroscopie
Couverture chauffante vétérinaire HotDog	Hot-dog	WC71V	Pour l’intervention intracanalaire/la préparation préopératoire
Lignes d’extension mâle-femelle, longueur 12 pouces	Technologies d’infusion SAI	POSTE 12	Pour les procédures intracanalaires
Omnipaque 500 mL (350 mg d’iode/mL)	GE Soins de santé	0407-1414-72	Produit de contraste pour la visualisation par rayons X (fluoroscopie)
Colorant alimentaire bleu stérile	Mccormick	930641	Pour la visualisation de la glande mammaire
Solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS)	ThermoFisher	14190250	Pour la préparation de la solution
Seringues	BD	309659	Pour perfusion intracanalaire
V-gel	Docsinnovent	D30001 à 30006	Pour l’intubation (le numéro de catalogue dépend de la taille du V-gel)
Kétoprofène	Convoitise	#005488	Pour l’analgésie
kétamine	Convoitise	71069	Pour l’analgésie
Lidocaïne topique	Covertus	70859	Pour l’analgésie
xylazine	Convoitise	80907	Pour l’anesthésie
Euthasol	Convoitise	#009444	Pour l’euthanasie
Lubrifiant pour les yeux	Convoitise	75848	Pour l’anesthésie
l’atipamézole	Convoitise	82124	Pour l’anesthésie
Croustilles de banane	Bio-Serv	#F7161	Pour l’acclimatation
Gemmes de furité	Bio-Serv	#F5136-1	Pour l’acclimatation
Gouttes de yogourt	Bio-Serv	#F7200-1	Pour l’acclimatation