Biocapteurs génétiquement codés à base de fluorophores pour l’imagerie de fluorescence ratiométrique chez les microbes

Résumé

Ce protocole décrit l’application de biocapteurs génétiquement codés à base de fluorophores dans les microbes pour l’imagerie quantitative ratiométrique de fluorescence dans des conditions contrôlées. En intégrant ces stratégies de biodétection à des techniques d’imagerie avancées, la méthode permet une analyse haute résolution et en temps réel au niveau de la cellule unique, fournissant ainsi des informations plus approfondies sur la dynamique des petites molécules.

Résumé

L’étude de la dynamique des petites molécules au sein des microbes est essentielle pour des études approfondies de la fonction microbienne. La dynamique des petites molécules intra-organismes et inter-organismes joue un rôle essentiel dans la physiologie microbienne, la symbiose et la maladie. Cependant, le suivi de ces dynamiques reste très difficile avec la plupart des techniques existantes. Les biocapteurs génétiquement codés à base de fluorophores sont des outils puissants pour suivre la dynamique des petites molécules in vivo et présentent un fort potentiel de découvertes. Ces biocapteurs sont le plus souvent utilisés dans l’imagerie de fluorescence, souvent en combinaison avec des dispositifs de perfusion qui permettent un contrôle précis des conditions environnementales. Lorsqu’elle est associée à des techniques d’imagerie avancées, cette approche fournit des données à haute résolution, résolues dans l’espace et dans le temps, ce qui permet de mieux comprendre les réponses microbiennes d’une seule cellule. Malgré leurs promesses, la mise en œuvre de tels biocapteurs reste techniquement difficile. Comprendre les étapes clés est crucial pour une adoption plus large. Ici, nous présentons un protocole conçu pour soutenir le déploiement efficace de biocapteurs nouvellement conçus dans les microbes pour l’imagerie quantitative de fluorescence ratiométrique dans des conditions contrôlées.

Introduction

Les biocapteurs à fluorophore unique, basés sur l’intensité et à double fluorophore sont largement utilisés par les chercheurs pour une variété d’applications¹. Certaines études ont utilisé des analyses de biocapteurs multiplexes pour suivre simultanément plusieurs signaux au sein des mêmes cellules². Beaucoup de ces biocapteurs s’appuient sur des domaines de liaison de ligands, où les événements de liaison induisent des changements conformationnels qui modifient les propriétés de fluorescence ^3,4. Les biocapteurs génétiquement codés sont devenus des outils essentiels pour l’imagerie in vivo dans toute une gamme de systèmes⁵, permettant une surveillance à haute résolution des niveaux d’ions et de métabolites dans l’espace et le temps¹. Cependant, les premiers biocapteurs étaient limités en termes de plage dynamique et de rapport signal/bruit (SNR)⁶. Les progrès récents dans les biocapteurs intensiométriques à fluorophore unique basés sur des protéines fluorescentes sensibles à la conformation (csFP) ont considérablement amélioré les performances. Néanmoins, les variations des niveaux d’expression des protéines peuvent avoir un impact sur les mesures in vivo à l’aide de biocapteurs à base de fluorophores génétiquement codés⁶, qui sont couramment utilisés pour visualiser les molécules de signalisation et les métabolites dans les cellules vivantes ^7,8. Les biocapteurs intensiométriques à fluorophore unique ne permettent pas de normaliser les niveaux d’expression des biocapteurs, qui peuvent fluctuer in vivo. Cependant, l’incorporation d’une protéine fluorescente de référence peut convertir des biocapteurs à fluorophore unique en versions ratiométriques à double fluorophore, ce qui permet des quantifications plus fiables⁹. En raison de la perte d’énergie due aux processus non radiatifs, le spectre d’émission fluorescente est décalé par rapport au spectre d’absorption, un phénomène connu sous le nom de décalage de Stokes¹⁰. Les grandes protéines fluorescentes à décalage de Stokes (LSSFP) ont été utilisées comme fluorophores de référence optimaux dans les biocapteurs ratiométriques à double fluorophore ^9,11. Une avancée récente est le développement de biocapteurs monochromatiquement excitables Green-Apple (GA) Matryoshka, connus sous le nom de GA-MatryoshCaMP6s, qui intègrent un LSSFP rouge, appelé LSSmApple¹². Lorsqu’ils sont combinés à des microdispositifs tels que les systèmes microfluidiques, les biocapteurs génétiquement codés à base de fluorophores offrent une approche peu invasive pour l’imagerie ratiométrique quantitative à l’aide de techniques telles que la microscopie confocale. Cette intégration permet l’imagerie à grande vitesse et la surveillance en temps réel de la dynamique des petites molécules dans des cellules uniques soumises à un stress environnemental. Par exemple, l’AMPc et les biocapteurs de glucose ont été appliqués avec succès chez la levure. Lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec des souches mutantes, ces biocapteurs ont permis d’élucider les principaux réseaux de régulation régissant l’absorption du sucre^13,14. Malgré des progrès significatifs, ces technologies n’ont pas encore atteint leur plein potentiel pour étudier des questions biologiques critiques impliquant la dynamique des petites molécules in vivo¹⁵. Par conséquent, leur adoption généralisée dans les laboratoires reste limitée, et les méthodologies normalisées pour une mise en œuvre plus large font encore défaut.

Par rapport aux méthodologies traditionnelles reposant sur des biocapteurs monofluorophores non ratiométriques ou des mesures de niveau en vrac, notre protocole basé sur les biocapteurs GA Matryoshka permet une imagerie unicellulaire à haute résolution avec une analyse ratiométrique quantitative. En intégrant le fluorophore à grand décalage de Stokes comme référence interne, la méthode compense la variabilité de l’expression des biocapteurs, une limitation clé des conceptions précédentes. De plus, la combinaison avec des dispositifs microfluidiques permet un contrôle précis des conditions environnementales, offrant une amélioration par rapport aux chambres de perfusion conventionnelles ou aux systèmes de culture statiques¹². Cette approche offre également des avantages distincts pour l’étude des interactions dynamiques entre les microbes et leurs hôtes, telles que les interactions plantes-pathogènes et les associations symbiotiques telles que les mycorhizes, où la résolution spatiale et temporelle au niveau cellulaire est essentielle pour découvrir les mécanismes moléculaires de communication et d’échange de nutriments.

Dans ce contexte, nous présentons un protocole détaillé étape par étape pour l’imagerie ratiométrique des biocapteurs chez les microbes. Bien qu’il soit spécifiquement optimisé pour être mis en œuvre chez les levures, ce protocole peut être adapté pour être utilisé dans d’autres microbes, y compris les bactéries, et étendu à des organismes non modèles tels que les microbes associés aux plantes. Par exemple, les biocapteurs peuvent être utilisés en conjonction avec des systèmes microfluidiques pour l’imagerie quantitative par fluorescence de la signalisation calcique chez la levure, permettant ainsi de surveiller en temps réel les réponses du calcium en cas de stress environnemental¹⁴.

Ce protocole vise à guider les chercheurs dans le déploiement efficace de biocapteurs nouvellement conçus, faisant ainsi progresser l’exploration des processus biologiques grâce à l’imagerie fluorescente basée sur des biocapteurs dans les systèmes microbiens. Il comprend des recommandations pratiques sur les conditions de culture de levures, les paramètres optimaux d’excitation/émission et la compatibilité avec les souches de levure couramment utilisées (par exemple, K601 et W303-1A MAT-a). Les limitations notables incluent le photoblanchiment pendant les sessions d’imagerie prolongées et les défis liés à l’expression des biocapteurs dans les échantillons biologiques. Étant donné que de nombreux facteurs peuvent influencer le résultat des expériences d’imagerie de biocapteurs in vivo , ce protocole étape par étape vise également à aider les chercheurs à anticiper et à surmonter les défis potentiels, facilitant ainsi des mises en œuvre reproductibles.

Protocole

1. Conception rationnelle de biocapteurs ratiométriques (Figure 1)

REMARQUE : La protéine de liaison d’intérêt est sélectionnée comme domaine sensoriel sur la base de critères pertinents, notamment (i) la spécificité, (ii) l’affinité, (iii) l’information structurelle et (iv) le réarrangement de la conformation lors de la liaison du ligand. La spécificité garantit que le biocapteur répond de manière sélective à la molécule cible sans réactivité croisée. L’affinité est considérée comme s’alignant sur la plage de concentration attendue de la molécule cible dans le contexte biologique. Les informations structurales, dérivées de données expérimentales ou de modèles informatiques tels que ceux générés par AlphaFold, donnent un aperçu de l’organisation tridimensionnelle du domaine sensoriel et des changements conformationnels induits par les ligands. Ces informations sont utilisées pour identifier les points d’insertion appropriés pour les fluorophores. Une stratégie de validation est ensuite élaborée pour évaluer la réactivité et la plage dynamique du biocapteur, en fonction des applications prévues.

1. Construisez le design de la matriochka in silico en insérant la cassette Green-Apple Matryoshka¹² dans le domaine sensoriel de telle sorte que la protéine fluorescente verte permutée circulairement (cpGFP), qui est sensible aux changements de conformation, réponde aux réarrangements du domaine sensoriel induits par la liaison du ligand.
   1. Utilisez un logiciel de visualisation moléculaire, tel que Chimera, pour analyser la structure du domaine de liaison. Si la structure tridimensionnelle n’est pas disponible, utilisez AlphaFold pour générer un modèle fiable.
   2. Identifier les boucles flexibles au sein de la structure de la protéine comme points faibles et sites d’insertion potentiels pour la cassette à double fluorophore, choisie pour éviter de perturber la fonction globale ou la stabilité de la protéine.
   3. Utilisez à nouveau AlphaFold pour prédire la structure de la protéine chimérique contenant la cassette dual-FP insérée, en confirmant que l’insertion n’introduit pas de changements structurels défavorables.
   4. Clonez les constructions du biocapteur dans l’ADN plasmidique qui permet l’expression dans les cellules de levure. Plus précisément, insérez le gène codant pour le biocapteur nouvellement conçu dans le vecteur navette de levure pAG416, qui contient des éléments appropriés pour l’expression de la levure, en utilisant une technique de clonage appropriée 12,13,14.
   5. Après le clonage, transformer le plasmide recombinant en cellules bactériennes pour l’amplification de l’ADN du plasmide. Utilisez de l’ADN plasmidique purifié pour la transformation de la levure.
   6. Introduire le plasmide purifié dans des cellules de levure par transformation médiée par le polyéthylène glycol (PEG) comme publié¹⁶. Des cellules de levure transformées en plaque sur un milieu déficient en uracile, qui sélectionne les clones positifs contenant le plasmide portant le marqueur de sélection URA3.

2. Préparation de l’échantillon

1. Étalez les transformants de levure exprimant les biocapteurs GA-Matryoshka sur des plaques de milieu sélectif (c’est-à-dire SC-Ura) et incubez à 30 °C pendant 2 à 3 jours pour permettre la croissance de la colonie.
   REMARQUE : La souche de levure est porteuse d’une auxotrophie ura3, qui est complétée par le gène URA3 sur le plasmide, permettant la sélection sur des milieux déficients en uracile. Le plasmide codant pour le biocapteur comprend une cassette qui complète l’auxotrophie (par exemple, pAG416, GPD, GA-MatryoshCaMP6s).
2. Générer des transformants de levure à partir de la souche K601/W303-1A MAT-a (génotype : ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100). Effectuez la transformation avec un vecteur d’expression couramment utilisé pour Saccharomyces cerevisiae, tel que pAG416¹².
3. Après transformation, cultiver des cellules de levure à 30 °C sur un milieu SC-Ura, préparées par litre comme suit, jusqu’à ce que des colonies transformées indépendamment apparaissent : 0,77 g de CSM-Ura, 6,7 g de base d’azote de levure (YNB) avec du sulfate d’ammonium, 20 g de glucose, 20 g de gélose et de l’adénine ajoutés à une concentration finale de 150 μM.
4. Préparer des cellules de levure compétentes et effectuer une transformation médiée par le PEG 3350 selon un protocole établi¹⁶.
5. Pour les expériences de piégeage de cellules microfluidiques, striez des stocks de glycérol à 25 % sur des plaques SC-Ura et incubez à 30 °C pendant 2 jours pour permettre la croissance de colonies uniques indépendantes. Remettre en suspension les colonies individuelles dans 5 mL de milieu liquide SC-Ura et incuber à 30 °C en agitant jusqu’à ce que la DO 600 atteigne 0,5-1,0, ce qui les rend aptes à être chargées dans le système de perfusion.

3. Préparation du système de perfusion (Figure 2)

1. Préparez la plaque microfluidique pour les cellules de levure haploïde en la chargeant de 50 μL de cellules de levure exprimant des biocapteurs GA-Matryoshka, ainsi que du milieu final SC-Ura pour la croissance et de la solution tamponnée pour les traitements (par exemple, NaCl ou sorbitol).
   1. Retirer la solution de stockage des puits 1 à 8. Aspirez la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) des puits et ajoutez 400 μL d’eau stérile.
   2. Laver les puits 1-6 et 8. Lavage 1 : Aspirer la solution d’eau stérile des puits 1 à 8 et ajouter 400 μL d’eau stérile. Lavage 2 : Répétez le lavage en aspirant et en ajoutant 400 μL d’eau stérile. Lavage 3 : Répétez l’opération avec 400 μL d’eau stérile.
   3. Remplissage final pour les puits 1 à 6 : Aspirer la solution aqueuse et ajouter 300 μL de solutions finales de perfusion/croissance telles que SC-Ura pour la croissance des levures, ou une solution tamponnée contenant les analytes d’intérêt pour le traitement.
   4. Chargement cellulaire dans le puits 8 : Ajouter 50 μL de suspension de cellules de levure (OD600 = 0,5-1,0).
2. Scellez les plaques à l’aide du collecteur à température contrôlée de la plateforme microfluidique et connectez-le au système d’imagerie de cellules vivantes. Les collecteurs maintiennent un environnement thermique stable à une température de 28 °C, tandis qu’un tube et une pompe assurent une bonne étanchéité et une perfusion continue.
   1. Alignez la plaque sur le collecteur. Allumez l’aspirateur. Allumez la plate-forme microfluidique.
   2. Appuyez sur Seal et attendez que le voyant vert s’allume. Ouvrez le logiciel de la plate-forme microfluidique, créez une nouvelle expérience et sélectionnez la plaque de levure appropriée dans la liste déroulante.
   3. Cliquez sur le bouton Exécuter la séquence d’amorçage liquide . Cliquez sur la séquence de chargement des cellules pour charger les cellules de levure du puits 8 dans la chambre de culture, où elles seront piégées et cultivées sous perfusion continue d’un milieu sélectif SC-Ura pendant une nuit à 10 kPa à 28 °C.
   4. Sous l’onglet Mode manuel, cliquez sur Exécuter une séquence personnalisée ou utilisez l’éditeur de protocole pour définir des paramètres expérimentaux tels que la température à 30 °C, le débit à 10 kPa, la durée du pas (par exemple, 10 min) et les canaux à ouvrir pour la perfusion.
3. Cultivez les cellules pendant une nuit dans la chambre de culture sous perfusion continue avec un milieu sélectif SC-Ura à 28 °C et à une pression de 10-17 kPa.

4. Imagerie par fluorescence ratiométrique (Figure 3, Figure 4 et Vidéo 1)

1. Évaluez la croissance cellulaire et la fluorescence grâce à une visualisation microscopique rapide.
   1. Placez la plaque microfluidique sur la platine d’un microscope inversé. Concentrez-vous sur le centre de la zone d’observation pour localiser les cellules.
   2. Utilisez la microscopie à fond clair et/ou à fluorescence pour évaluer la morphologie cellulaire, la viabilité et l’expression des biocapteurs.
2. Étudiez la dynamique de l’état d’équilibre du calcium dans des conditions contrôlées avec précision à l’aide du système microfluidique et des plaques microfluidiques compatibles 4,12,13,14.
3. Effectuez l’imagerie de cellules vivantes à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser inversé avec un grossissement de 100x et une ouverture numérique (NA) de 1,40. Surveillez les biocapteurs à double fluorophore en activant GFP et LSSmApple à 488 nm à l’aide d’un laser à argon. Collecter des signaux d’émission à 520 nm pour la GFP et à 610 nm pour LSSmApple (Figure 5) et réaliser des expériences d’imagerie de fluorescence ratiométrique pour quantifier les réponses dynamiques du biocapteur. Mesurer le rapport des intensités d’émission (GFP/LSSmApple) dans le temps pour surveiller les changements induits par l’analyte.

5. Analyse d’images à l’aide d’un logiciel open source (Figure 6)

1. Procurez-vous le CellProfiler ou tout autre logiciel similaire à partir du dépôt officiel et installez-le sur un poste de travail local.
2. Organisez les images de microscopie à fluorescence time-lapse dans un ordre séquentiel (par exemple, img_001.tif, img_002.tif, etc.) pour assurer la compatibilité avec le traitement automatisé par lots.
3. Lancez le logiciel et initialisez un nouveau pipeline d’analyse en sélectionnant Nouveau projet. Importez la séquence d’images en accéléré dans l’espace de travail du pipeline.
4. Intégrez le module IdentifyPrimaryObjects pour détecter des cellules individuelles dans chaque image en fonction du signal de fluorescence ou de critères morphologiques.
5. Ajoutez le module TrackObjects pour établir des correspondances temporelles entre les cellules des trames, ce qui permet le suivi d’une seule cellule au fil du temps.
6. Incluez le module MeasureObjectIntensity pour quantifier les paramètres d’intensité de fluorescence (par exemple, l’intensité moyenne, médiane et intégrée) pour chaque cellule suivie.
7. Utilisez le module ExportToSpreadsheet pour compiler et exporter des données quantitatives dans un format tabulaire (p. ex., CSV) à des fins d’analyse en aval.
8. Analysez les données exportées à l’aide d’outils statistiques ou de visualisation de données tels que des taburs.

Résultats

Pour réussir l’imagerie ratiométrique des biocapteurs dans les systèmes microbiens, plusieurs défis techniques doivent être relevés.

Système d’expression : Le premier défi réside dans le choix du système d’expression ; qu’ils soient à base de plasmides, intégrés chromosomiquement, entraînés par des promoteurs constitutifs ou inductibles, et avec ou sans marqueurs de ciblage subcellulaires. Ces facteurs peuvent affecter de manière significative la stabilité, la toxicité et la localisation du bi...

Discussion

Des biocapteurs à base de fluorophores génétiquement codés permettent de surveiller en temps réel les concentrations d’analytes intracellulaires dans les cellules vivantes¹. Ces biocapteurs fonctionnent généralement en convertissant les changements de conformation en signaux optiques, qui peuvent être détectés de manière ratiométrique ou intensiométrique. Les biocapteurs intensiométriques s’appuient sur les changements d’intensité de fluorescence d’un seul FP, ce ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar	Sigma-Aldrich Co.	A5306-250G
Plaque CellASIC ONIX pour cellules de levure haploïde  ;	Merck KGaA	Y04C-02-5PK
CellASIC ONIX2	Merck KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	Thermo Fisher Scientific	11387899
D-glucose	Sigma-Aldrich Co.	G8270-100G
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich Co.	S1876-10MG
NaCl	Sigma-Aldrich Co.	S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s	NA	7	Pour l’expression des GA-MatryoshCaMP6s dans la levure
TCS SP8 STED	Leica	NA
Souche de levure K601/ W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNB	BocaScientific	GCM16.0500
&alpha ;-Facteur d’acétate sel	Sigma-Aldrich Co.	T6901-.5MG