Article de méthode

Utilisation de la méthode de transfert de gouttelettes pour préparer de manière fiable des vésicules unilamellaires géantes

DOI :

10.3791/68340

⸱

19 septembre 2025

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce guide du débutant présente un protocole général pour la préparation des vésicules unilamellaires géantes (GUV) via la méthode de transfert de gouttelettes, en discutant des étapes critiques et en fournissant des informations pour aider aux ajustements possibles requis pour différentes applications, y compris la biologie synthétique et la microrobotique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours des deux dernières décennies, la méthode de transfert de gouttelettes, également connue sous le nom d’émulsion inversée, d’émulsion double, de transfert de phase ou de transfert d’émulsion, s’est avérée avantageuse pour la préparation des vésicules unilamellaires géantes (GUV) et en particulier, pour les charger avec différentes cargaisons, jouant ainsi un rôle crucial en biologie synthétique. En raison de l’efficacité de l’encapsulation et de la simplicité d’exécution, il a été largement utilisé pour le développement de cellules artificielles. Une grande variabilité de plusieurs paramètres est observée dans la littérature, ce qui conduit à des résultats extrêmement variables. Cela est dû en partie aux ajustements nécessaires pour répondre aux différents besoins et applications de cette méthode polyvalente, mais cela peut s’avérer désorientant pour les chercheurs qui abordent cette technique pour la première fois.

Pour fournir aux débutants une compréhension de base de la méthode et du rôle des paramètres critiques, un protocole est présenté avec des conseils sur les principes physico-chimiques fondamentaux sous-jacents à la formation de GUV par transfert de gouttelettes. Ce guide étape par étape pour la préparation des GUV comprend donc des considérations et des suggestions pratiques basées sur la littérature et l’expérience directe.

En ce qui concerne les sources possibles de variabilité, quelques aspects sont identifiés comme critiques : la sensibilité des phospholipides à la lumière, à l’oxydation et à l’hydrolyse ; le choix de l’huile pour dissoudre les phospholipides (la solution lipidique ou LS) ; et la récupération des GUV après centrifugation. Des mesures rentables sont proposées pour minimiser l’interférence de l’oxygène et de l’humidité atmosphériques. Pour aider à identifier les combinaisons appropriées d’huile et de phospholipides, le protocole général est complété par une discussion sur les propriétés physicochimiques pertinentes du LS. Enfin, pour éviter des procédures peu pratiques, une méthode simple et sûre est proposée pour éliminer complètement la phase huileuse en une seule fois et récupérer une dispersion GUV propre. Ces mesures accélèrent la mise en œuvre d’ajustements aux nouvelles compositions GUV, ce qui pourrait élargir leur adoption en biologie synthétique et dans les domaines voisins, y compris la microrobotique.

Introduction

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En mettant en œuvre une technique précédemment décrite pour produire des liposomes1, Pautot et al. ont établi un protocole pour produire des vésicules lipidiques d’un diamètre variant de 0,1 à 1 μm de diamètre2. La méthode de transfert de gouttelettes s’est rapidement avérée efficace dans la production de vésicules encore plus grandes (diamètres supérieurs à 1 μm)3, gagnant de plus en plus en popularité pour sa simplicité d’exécution et sa grande efficacité d’encapsulation. En effet, par rapport aux méthodes de gonflement (comme le gonflement sur gel ou l’électroformation), ce protocole permet de réduire le volume de solution cargo nécessaire pour former un nombre comparable de vésicules et les déchets associés4. Les GUV peuvent être assemblés à partir d’interfaces fluides par des méthodes alternatives avec une efficacité d’encapsulation comparable. Cependant, comparé à ceux basés sur des puces microfluidiques 5,6 ou l’encapsulation continue par croisement d’interface de gouttelettes (cDICE)7, le transfert de gouttelettes offre la configuration la plus simple abordable dans tout laboratoire doté d’un équipement de base. De plus, les méthodes microfluidiques peuvent conduire à des GUV avec des inclusions d’huile indésirables dans la membrane. Pour ces raisons, le transfert de gouttelettes a été la méthode de choix pour charger des GUV avec des cargaisons précieuses dans les domaines des cellules artificielles 3,8,9,10 et, récemment, de la microrobotique 11,12.

La méthode est basée sur la formation des folioles des membranes par la stabilisation des interfaces eau/huile médiée par les phospholipides. Tout d’abord, les phospholipides sont dissous dans une huile (solution lipidique, LS), puis une émulsion eau dans huile est préparée avec la solution aqueuse contenant la cargaison GUV souhaitée (solution interne, IS) dans la LS huileuse. L’émulsion est ensuite transférée dans un tube où une autre solution aqueuse (appelée solution externe, OS) a été préalablement équilibrée avec LS pour former une interface eau-huile. Les GUV se forment lorsque les gouttelettes d’eau sont forcées de traverser cette interface OS/LS par centrifugation : le feuillet interne des GUV se forme à la surface des gouttelettes IS, tandis que le feuillet externe est formé entre le OS et le LS (Figure 1).

De nombreuses variantes de protocole ont été décrites avec des paramètres ajustés en fonction des besoins expérimentaux contingents. Une première tentative extensive d’optimisation du processus a été décrite par Moga et al.13, tandis que Zhang et al. ont rassemblé la plupart des exemples pertinents dans une revue récente14. Malgré les nombreux paramètres décrits influençant le protocole, il n’y a aucune indication sur la manière dont un processus d’optimisation pourrait être mené pour une nouvelle formulation de GUV, ni sur les meilleures pratiques pour la récupération et la manipulation des GUV après la production. Sur la base de la littérature scientifique disponible et de notre expérience directe, nous fournissons ici un protocole général pour produire des GUV tout en discutant des principes de base. Ce faisant, nous fournissons des indications utiles pour l’optimisation de nouvelles formulations de GUV et deux précautions toujours applicables au protocole : la préparation de LS dans un environnement contrôlé et une méthode permettant d’éliminer facilement la phase supérieure de l’huile pour la récupération d’un échantillon de GUV propre. Nous avons choisi deux exemples : l’un avec 240 mM de saccharose en IS et 0,2 mM de DOPC dans de l’huile de silicone AR20 en LS (condition E [vide], voir tableau 1) et l’autre composé de 0,2 % de microparticules de polystyrène de 1,1 μm dans du saccharose de 240 mM en IS et de 3,18 mM de DOPC dans de l’huile minérale en LS (condition P [avec particules], voir tableau 1). Les deux échantillons ont été produits avec 240 mM de glucose comme OS. Nous avons choisi cette osmolarité pour obtenir des GUV qui, dans des conditions physiologiques, ont une membrane lipidique détendue (faible tension membranaire).

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Figure 1 : Représentation schématique de la méthode de transfert de gouttelettes. (A) Trois solutions sont préparées dans des flacons séparés : des phospholipides dans de l’huile (phase jaune) pour former une solution lipidique, une solution contenant du saccharose (en cyan) comme solution interne et une solution de glucose équiosmolaire (blanc) comme solution externe. (B) LS est ensuite mélangé avec l’IS pour former une émulsion stable, puis (C) une interface entre OS et LS est autorisée à s’équilibrer avant que (D) l’émulsion ne soit versée par-dessus. (E) Les gouttelettes d’eau sont forcées de traverser l’interface LS/OS par la force centrifuge pour (F) permettre la formation de GUV. La figure n’est pas à l’échelle et ne vise qu’à fournir un schéma de la méthode. Abréviations : LS = solution lipidique ; IS = solution interne ; OS = solution externe ; GUV = vésicule unilamellaire géante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

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REMARQUE : Sauf indication contraire, les processus sont effectués à température ambiante.

1. Préparation des solutions

  1. Préparation de solutions aqueuses (IS et OS)
    1. Dans deux bateaux de pesée différents, peser 2,16 g de glucose et la quantité de saccharose spécifiée dans le tableau 1. Ajouter les poudres dans deux béchers de 150 ml, ajouter 40 ml d’eau ultrapure et mélanger en remuant.
    2. Transvasez les solutions dans deux cylindres de 50 mL et ajoutez de l’eau ultrapure jusqu’à 50 mL pour obtenir des solutions de glucose de 240 mM et des solutions de saccharose aux concentrations indiquées au tableau 1. Couvrez les cylindres avec un morceau de parafilm et mélangez les solutions en inversant les cylindres plusieurs fois.
    3. Filtrez les solutions avec des seringues de 50 ml et des filtres de 0,22 μm pour éviter la contamination par des micro-organismes.
    4. Pour la condition P, préparer le mélange suivant : 2 μL de dispersion de particules de polystyrène 1,1 μm à 100 mg/mL, 24 μL de solution de saccharose préparée à l’étape 1.1.1 et de l’eau ultrapure jusqu’à 100 μL (suspension finale : 0,2 % de microparticules dans une solution de saccharose à 240 mM). Conserver les solutions à +4 °C jusqu’à 1 semaine ou préparer des aliquotes de 1 mL dans des tubes de 1,5 mL et les conserver à -20 °C pour un stockage à long terme.
  2. Mise en place d’une chambre à gants pour préparer les LS dans un environnement contrôlé
    1. Coupez cinq morceaux de tuyau en silicone d’un diamètre intérieur de 7 mm, d’un diamètre extérieur de 13 mm et des longueurs indiquées dans le tableau 2 (tuyaux 1 à 5).
    2. Coupez quatre morceaux de tuyaux en silicone d’un diamètre intérieur de 3 mm, d’un diamètre extérieur de 7 mm et des longueurs indiquées dans le tableau 2 (tuyaux 6 à 9).
    3. Raccordez une extrémité du tuyau 1 à une vanne à deux voies et l’autre extrémité à une jonction à trois voies (Figure 2A).
    4. Raccorder le tuyau 2 aux autres extrémités de la vanne à deux voies, puis raccorder le tuyau 3 et le tuyau 4 à la jonction à trois voies, le tuyau 3 étant relié à l’extrémité opposée au tuyau 1 (figure 2A).
    5. Connectez l’extrémité libre du tuyau 4 à l’entrée de la chambre du gant (tuyau d’entrée, Figure 2B).
    6. Connectez la vanne à trois voies fournie avec la chambre du gant à la sortie, puis connectez la vanne au tuyau 5 (tuyau de sortie, Figure 2C).
    7. Connectez une extrémité du tuyau 6 à une aiguille 18 G et l’autre extrémité à une jonction à deux voies. Répétez cette opération avec le tube 7 et l’aiguille 21 G (Figure 2D).
    8. Insérez les deux aiguilles dans un bouchon de flacon avec septum : ce capuchon porteur d’aiguilles permettra de contrôler l’entrée et la sortie d’azote et de chloroforme. Rangez le capuchon dans un tube vide de 50 ml sans capuchon pour éviter tout contact avec les aiguilles (figure 2D).
    9. Pressez et insérez les tuyaux 8 et 9, respectivement, dans les ouvertures d’entrée et de sortie à partir du côté intérieur de la chambre du gant (Figure 2E).
  3. Préparation du LS
    1. Déplacez la chambre du gant à l’intérieur ou à côté d’un capot chimique. Ouvrez la chambre du gant et insérez un cristalliseur rempli de particules de silice au fond de la chambre (Figure 2F). Couvrez le cristalliseur avec la surface de support blanche et couvrez-le d’essuie-tout.
    2. Insérez tout le matériel nécessaire dans la chambre du gant (figure 2G) : un hygromètre, la 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) dans une solution de chloroforme, l’huile (tableau 1), des flacons en verre foncé propres de 20 ml (ouverts et avec les bouchons respectifs), une seringue Hamilton (tableau 1), une micropipette P10000 et des pointes. Placez le flacon en verre contenant la solution de chloroforme sur un support à anneau en liège, un bécher de 150 ml ou tout autre support approprié aussi près que possible du côté de l’opérateur.
      REMARQUE : Cette précaution empêchera les bouteilles de basculer causées par le gonflage et le dégonflage des gants sur les cycles de vide et d’écoulement d’azote.
    3. Fermez la chambre à gant en vous assurant que les deux moitiés ne peuvent pas glisser, et scellez-les avec les vis en plastique fournies avec la chambre à gant.
    4. Fermez le robinet de sortie et plongez le tuyau 5 dans un bécher de 500 ml à moitié rempli d’eau (Figure 2H).
    5. Raccorder l’extrémité régulée par soupape du tuyau d’entrée (tuyau 2) à la conduite de vide et l’autre extrémité à l’azote (tuyau 3, figure 2A). La chambre du gant est maintenant complètement réglée, comme le montre la figure 2J.
    6. Ouvrez la valve et la conduite de vide jusqu’à ce que la dépressurisation gonfle les gants au point qu’ils soient trop rigides pour être pliés. Fermez la conduite de vide et la vanne.
    7. Ouvrez l’azote jusqu’à ce que la pression dégonfle les gants au point qu’ils sortent de la chambre à gants. Fermez la conduite d’azote.
    8. Répétez les étapes 1.3.6 à 1.3.7 au moins 10 fois, en vous assurant que l’humidité intérieure descend en dessous de 40 %.
    9. Contrôlez la pression intérieure avec du vide et de l’azote pour faciliter le port de gants par l’opérateur.
    10. À l’aide de la seringue Hamilton, transférez le volume de DOPC dans la solution de chloroforme indiqué au tableau 1 dans un flacon en verre foncé. Fermez le flacon à l’aide du capuchon muni des aiguilles préparé à l’étape 1.2.9.
    11. Raccorder le tuyau 6 au tuyau 8 et le tuyau 7 au tuyau 9 via les jonctions à double sens (Figure 2I).
    12. Retirez les gants et ouvrez la soupape de sortie.
      REMARQUE : Un deuxième opérateur peut aider à partir des étapes 1.3.13 à 1.3.15 pour accélérer le processus.
    13. Ouvrez le flux d’azote très lentement et vérifiez le flux de gaz en observant les bulles dans le bécher où le tuyau 5 a été placé précédemment (étape 1.3.4). Ajustez progressivement le débit d’azote jusqu’à ce qu’il atteigne un taux relativement élevé auquel les bulles individuelles restent observables. Laissez couler l’azote pendant 3 min, puis fermez la ligne d’azote.
      REMARQUE : Une pression excessive d’azote peut provoquer la dispersion de la solution de DOPC dans le chloroforme, diminuant ainsi la quantité de phospholipides disponible pour la solution lipidique (LS) ultérieure. De plus, une pression élevée augmente le risque d’expulsion des aiguilles du flacon. Par conséquent, il est essentiel d’ajuster soigneusement le débit d’azote à un niveau optimal qui remue doucement le chloroforme sans provoquer d’éclaboussures incontrôlées.
    14. Pendant ce temps, préparez un bain-marie dans un cristalliseur et chauffez-le à 80 °C sur une plaque chauffante.
    15. Attendez que la dernière bulle soit sortie dans le bécher, puis fermez la vanne de sortie. Remettez les gants et débranchez les tuyaux 8 et 9 des jonctions à double sens.
    16. Vérifiez que tout le chloroforme s’est évaporé de la fiole sombre, puis ouvrez-la et remettez le capuchon dans le tube de 50 ml. Ouvrez la bouteille d’huile, transférez le volume d’huile requis (tableau 1) dans le flacon sombre et fermez-le avec le bouchon. Retirez les gants et ouvrez la chambre à gants.
    17. Scellez le LS avec du parafilm. Agitez vigoureusement le flacon pendant au moins 30 s. Incuber à 80 °C pendant 30 min dans le bain-marie préparé à l’étape 1.3.14. Agitez vigoureusement le flacon pendant au moins 30 s. Incuber à température ambiante pendant la nuit.
    18. Procédez à la préparation des GUV ou conservez-les à +4 °C jusqu’à 1 semaine.
      REMARQUE : Dans les préparations GUV asymétriques, deux LS différents peuvent être utilisés pour l’interface et l’émulsion afin d’obtenir deux folioles membranaires différentes15.

2. Production de GUV

  1. Mise en place d’un récipient pour faciliter l’évacuation de l’huile
    1. À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez le capuchon d’un tube de 5 ml. Percez un trou de ~8 mm au centre du capuchon et vérifiez que le trou est suffisamment large pour permettre à une pointe P1000 de s’installer et de se verrouiller (Figure 3A). Si le trou est trop étroit, répétez les deux étapes précédentes ; S’il est trop large, jetez le capuchon et redémarrez avec un nouveau à partir de l’étape 2.1.1.
    2. Découpez un morceau de papier de verre de 2 x 5 cm et poncez le trou. Replacez le capuchon troué sur le dessus du tube de 5 ml et centrifugez à 3 000 × g pendant 5 minutes pour éliminer tous les débris de plastique résiduels du trou. Retirez le capuchon et jetez le tube.
    3. Coupez le capuchon d’un nouveau tube de 5 ml et remplacez-le par le capuchon troué. Placez un joint torique sur le capuchon et insérez une pointe P1000 dans le trou. Verrouillez le joint torique entre l’embout et le capuchon et vérifiez que l’embout ne peut pas être poussé plus bas dans le tube (Figure 3B). Remplissez le tube de 5 ml avec 5,5 ml de SG par l’embout.
  2. Formation de l’interface OS/LS
    1. Préparez un bain-marie dans un cristalliseur et chauffez-le à 50 °C sur une plaque chauffante.
    2. Agitez vigoureusement le flacon de LS préparé à la section 1.3 pendant au moins 30 s. Chauffer le LS à 50 °C au bain-marie pendant 30 min.
    3. Équilibrer les solutions aqueuses préparées au point 1.1 à température ambiante pendant au moins 10 min.
    4. Pipette 300 μL de SG dans un tube de 1,5 mL ou un tube de 5 mL modifié selon l’étape 2.1. Pipetez lentement 100 μL de LS sur le dessus du système d’exploitation, en vous assurant que deux phases distinctes et continues se forment dans le tube. Laissez l’interface s’équilibrer pendant 10 min.
      REMARQUE : Pour permettre la formation d’une monocouche homogène de phospholipides, les LS doivent être répartis de manière homogène sur le dessus de l’OS (Figure 4A). Si la couche de LS n’est pas continue, redistribuez le volume de LS à l’aide d’une micropipette ou augmentez le volume de LS (cela peut être très utile avec des huiles très visqueuses comme la paraffine).
  3. Formation d’émulsion eau dans huile
    1. Dans un tube de 2 mL, pipetez, dans cet ordre, 250 μL de LS et 6,25 μL de IS pour une émulsion eau dans huile à 2,5 %.
      REMARQUE : D’après notre expérience, ce rapport eau-d’huile fournit très probablement une émulsion stable, augmentant ainsi le taux de réussite du protocole (Figure 5). Pour augmenter le rendement GUV, nous recommandons d’augmenter le volume de l’émulsion plutôt que le rapport IS/LS.
    2. Mélangez les deux phases en utilisant une ou plusieurs des méthodes suivantes jusqu’à ce que le mélange apparaisse homogène et stable : vortex, agitation mécanique sur un support de microtubes standard ou tapotement du tube avec un doigt (voir la figure 5 pour des exemples d’émulsion homogène).
    3. Transférez 200 μL de l’émulsion sur l’interface OS/LS préparée au point 2.2.
    4. Si vous utilisez un tube de 1,5 ml, fermez simplement le tube ; si vous utilisez le tube de 5 mL modifié de la section 2.1, placez un capuchon en caoutchouc sur le dessus de l’embout et transférez soigneusement le tube dans un tube conique de 50 mL.
  4. Transfert de gouttelettes par centrifugation
    1. Centrifugez les tubes à température ambiante en suivant les indications du tableau 1. A la fin de la centrifugation, vérifiez la présence d’une pastille opaque au fond du tube et d’une phase huileuse claire dans la partie supérieure.

3. Récupération GUV

  1. Élimination de l’huile
    REMARQUE : Selon les besoins expérimentaux, l’huile peut être retirée en trois étapes alternatives différentes.
    1. Si les GUV ont été préparés dans des tubes standard de 1,5 mL, retirez lentement l’huile à l’aide d’une pipette P1000 et d’une P200 pour les dernières gouttes, en vous assurant que la pastille n’est pas dérangée.
      REMARQUE : Les pointes plus étroites aident à éliminer l’huile, donc l’insertion d’une pointe pour des volumes plus petits (10-200 μL) dans une pointe P1000 améliorera la précision de cette étape.
    2. Si vous utilisez plusieurs préparations GUV dans différents tubes de 1,5 ml, retirez l’huile à l’aide d’une fiole Büchner. Connectez un morceau d’un tuyau en silicone épais (diamètre intérieur 7 mm, extérieur 13 mm) à la conduite de vide et insérez un autre tuyau sur l’ouverture du ballon, en le scellant avec un joint en caoutchouc. À l’autre extrémité de ce tuyau, insérez une pointe P1000, enveloppez-la avec du parafilm, coupez environ 3 mm de la pointe et insérez-la dans une pointe P200. Ouvrez l’aspirateur et aspirez l’huile avec l’embout P200, puis fermez l’aspirateur et retirez les dernières gouttes à l’aide d’une pipette P200.
    3. Si les GUV ont été préparés dans le contenant décrit à l’étape 2.1, retirez l’embout du tube en vous assurant que le capuchon en caoutchouc ne se détache pas (figure 3D). Ensuite, jetez l’embout et conservez le capuchon en caoutchouc, le joint torique et le capuchon troué pour les réutiliser.
    4. À l’aide d’une micropipette P1000, retirez le système d’exploitation du tube (Figure 3E) en laissant environ 50 μL du volume, en veillant à ce que la pastille ne soit pas dérangée.
    5. Changez l’embout, remettez la pastille en suspension dans le volume restant et transférez-la dans un tube propre de 2 ml.
  2. Lavages GUV
    REMARQUE : Le but de ces étapes est d’éliminer les traces de la phase huileuse qui n’ont pas été éliminées à l’étape 3.1. Si nécessaire, les étapes 3.2.1 et 3.2.2 doivent être répétées jusqu’à ce qu’aucune goutte d’huile ne soit observée dans le tube.
    1. Remplissez le tube avec 2 ml de SG et centrifugez à 1 500 × g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Retirez le système d’exploitation en laissant environ 50 μL du volume, en vous assurant que la pastille n’est pas dérangée.
    3. Répétez les deux dernières étapes.
  3. Équilibrage du volume
    REMARQUE : Nous incluons cette section pour permettre une comparaison des rendements entre différentes préparations GUV.
    1. À l’aide d’une micropipette P200, remettre la pastille en suspension dans les 50 μL du volume restant de la dernière répétition de l’étape 3.2.2.
    2. Mesurez ce volume en réglant la pipette sur 20 et en augmentant le volume avec la pointe trempée dans la dispersion GUV sans toucher la paroi du tube pour permettre au liquide de s’écouler à l’intérieur de la pointe.
    3. Ajouter OS pour atteindre le volume final de 100 μL.

4. Observation et analyse dimensionnelle

  1. Acquisition d’images microscopiques
    1. Mélangez doucement la dispersion GUV en tapotant le tube avec un doigt.
    2. Chargez une chambre Burker avec 10 μL de l’échantillon GUV et attendez au moins 5 min pour permettre aux GUV de sédimenter au fond de la chambre.
    3. Observez l’échantillon à l’aide d’un microscope à contraste de phase. En utilisant les lignes de Burker comme références, déplacez-vous sur l’échantillon et acquérez au moins 20 images, en vous assurant que les zones d’observation ne se chevauchent pas.
  2. Analyse dimensionnelle
    1. Chargez les images sur ImageJ.
    2. Pour calculer le facteur de conversion pixel/μm, choisissez une image montrant un carré de 50 x 50 μm de la chambre Burker (reportez-vous à la fiche technique du fabricant pour une identification correcte), puis sélectionnez l’outil de sélection de ligne droite , tracez une ligne entre deux coins consécutifs du carré et mesurez la ligne en cliquant sur Analyser | Mesurer. Répétez l’opération 3x et calculez la valeur moyenne.
    3. Définissez le facteur de conversion en cliquant sur Analyser | Réglez l’échelle. Insérez la valeur de l’étape 4.2.2 dans la case Distance en pixels, puis insérez la valeur 50 dans Distance connue et μm dans Unité de longueur.
    4. Cliquez sur Analyser | Définissez les mesures et sélectionnez la case Surface . Sélectionnez l’outil de sélection ovale , puis cliquez sur le bouton gauche de la souris et maintenez la touche Maj enfoncée pour superposer le cercle résultant autour d’un GUV. Mesurez le diamètre en cliquant sur Analyser | Mesurer. Répétez cette opération pour chaque GUV dans chaque image.
    5. Dans la fenêtre Résultats, cliquez sur Fichier | Enregistrer sous... pour exporter le fichier csv de la zone de GUV, puis analyser la distribution de taille avec le script disponible sur GitHub16.
      REMARQUE : Il est possible de sauter l’étape 4.2.3 et d’exécuter le script spécifiant le facteur de conversion pixel/μm. Pour calculer cette valeur, divisez la valeur obtenue à l’étape 4.2.2 par 50.

Résultats

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Une préparation optimale du GUV se caractérise par la formation d’une phase huileuse claire et d’une pastille distincte (Figure 4A). Dans les cas où les gouttelettes d’eau ne se convertissent pas en GUV, elles s’effondrent généralement et laissent des débris de phospholipides à l’interface OS/LS (Figure 4C). Cet effet est très probablement causé par l’agrégation de phospholipides et d’autres molécules de la phase huileuse, résultant d’un équilibre insuffisant des phospholipides à l’interface eau/huile. Néanmoins, malgré l’absence de pastille visible ou la présence de débris à l’interface, des GUV peuvent toujours se former, permettant au processus de se poursuivre. Bien que les étapes de lavage ne soient pas entièrement efficaces pour éliminer tous les débris de phospholipides, elles aident considérablement à éliminer les gouttelettes d’huile, améliorant ainsi la qualité globale de l’échantillon (comparer la figure 6A et la figure 6B).

L’utilisation d’anciens LS ou de LS préparés dans des conditions d’humidité élevée entraîne souvent une réduction des dispersions GUV avec un rendement plus faible et une teneur plus élevée en agrégats désordonnés qui sont très probablement formés par des phospholipides et d’autres molécules de la phase huileuse (Figure 6C). Pour les LS préparés dans des conditions d’humidité élevée, nous avons observé des coefficients de variation supérieurs à 0,8 dans la production de GUV (avec des échantillons contenant très peu de GUV), tandis que pour les LS préparés dans la chambre à gants modifiée, le coefficient de variation était inférieur à 0,5.

Différentes conditions de centrifugation peuvent avoir un impact sur le rendement et la qualité du GUV. D’après une analyse qualitative, 20 min à 3 300 × g ont été identifiés comme une bonne condition pour les GUV chargés en saccharose (échantillon E). La réduction de la vitesse (45 min à 500 × g) a entraîné une réduction du rendement, tandis qu’une augmentation (5 min à 16 600 × g) a conduit à une formation plus élevée d’agrégats de phospholipides désordonnés. Une force centrifuge faible peut empêcher de nombreuses gouttelettes de traverser l’interface OS/LS, d’où le rendement réduit, tandis qu’une force forte peut ne pas fournir suffisamment de temps pour l’organisation des phospholipides sur le feuillet externe lors du croisement de l’interface (Figure 7). L’encapsulation des microparticules peut également être optimisée en ajustant les paramètres de centrifugation, à condition que la densité massique des microparticules corresponde à peu près à celle du SI. À cette fin, la réduction de l’accélération de la centrifugation (et à son tour l’augmentation du temps de centrifugation) permet une encapsulation plus homogène des particules, en évitant la rupture de la membrane phospholipidique due à la force exercée par les particules solides (un exemple de bonne encapsulation est montré à la figure 6D alors que l’étude des paramètres optimaux de centrifugation est toujours en cours17).

Étant donné que la diffusion des phospholipides peut être affectée par la phase huileuse, un simple test qualitatif peut être effectué pour évaluer la stabilité de l’émulsion (Figure 5). À l’aide d’un colorant (Brilliant Blue FCF) dissous dans l’IS pour améliorer la visualisation, des émulsions avec différents rapports eau/huile peuvent être préparées et observées au fil du temps. La perte de stabilité peut être visualisée par l’agrégation des gouttelettes d’eau et la séparation conséquente de la phase huileuse. Étant donné que les grosses gouttelettes (visibles à l’œil nu) sont moins susceptibles d’être converties en GUV, nous vous recommandons d’utiliser la condition d’émulsion qui offre le moins de séparation de phase.

L’effet des variations dans le protocole peut être vérifié par une analyse de distribution de taille comme décrit dans la section 4 du protocole : les diamètres des GUV peuvent être mesurés à l’aide d’ImageJ à partir d’images de microscope à contraste de phase, et la distribution de taille peut être analysée avec un script disponible sur GitHub16. Suite à ce protocole, il a été possible, par exemple, d’observer une augmentation des GUV de plus grands diamètres lorsque l’huile minérale est choisie plutôt que l’huile de silicone AR20 (Figure 8).

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Figure 2 : Configuration de la chambre à gants. Cette figure montre les principales modifications apportées à la chambre du gant pour la préparation de la solution lipidique. (A) Raccordement d’entrée avec de l’azote et du vide ; (B) connexion d’entrée avec la chambre du gant ; (C) soupape de sortie ; (D) capuchon porteur d’aiguilles pour l’évaporation des solvants ; (E) des tuyaux minces pour l’évaporation des solvants ; (F) des particules de silice pour absorber l’humidité ; (G) articles à placer dans la chambre à gants : thermo-hygromètre numérique (1), solution lipidique dans un solvant organique (2), porte-anneau en liège (3), seringue en verre (4), capuchon ouvert avec septum et aiguilles (5), solution d’huile (6), flacon noir ouvert avec capuchon (7), pointes de 10 mL (8), pipette P10000 (9) ; (H) l’extrémité du tuyau de sortie est trempée dans l’eau ; (I) flacon fermé avec un capuchon à aiguilles relié à l’entrée et à la sortie ; (J) les schémas de la chambre à gants modifiée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 3 : Récipient pour faciliter l’évacuation de l’huile. Principales étapes de la préparation des GUV dans un récipient pour faciliter l’évacuation de l’huile conformément au protocole section 2.1. (A) Un trou est percé dans un capuchon de tube de 5 mL pour permettre à une pointe P1000 de s’adapter ; puis (B) le capuchon est placé sur un tube vide de 5 mL avec l’embout inséré dans le trou à travers un joint torique. (C) Les solutions sont placées dans le tube conformément aux sections 2.2 et 2.3 du protocole, l’embout est bouché et le tube est placé à l’intérieur d’un tube de 50 ml. Des GUV préparés à partir de 0,2 mM de DOPC dans de l’huile de silicone ont été chargés avec 230,7 mM de saccharose et 3,1 mM de bleu brillant FCF pour améliorer la visualisation. (D) Après la centrifugation, la phase supérieure de l’huile est piégée à l’intérieur de la pointe avec une partie du tampon GUV (qui apparaît cyan en raison du fait qu’une partie des gouttelettes ne se transforme pas en GUV et libère le colorant dans le système d’exploitation). Grâce au capuchon en caoutchouc, l’embout peut être facilement retiré du tube de 5 mL avec le contenu liquide, ce qui permet un retrait rapide et facile de toute la phase huileuse. (E) La pastille GUV peut être facilement collectée au fond d’un tube dans une dispersion claire, sans contamination apparente par l’huile, comme vérifié (F) par microscopie à contraste de phase. Barre d’échelle = 20 μm. Abréviations : LS = solution lipidique ; IS = solution interne ; OS = solution externe ; GUV = vésicule unilamellaire géante ; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Formation de GUV. Exemples d’interface OS/LS, (B) une pastille GUV propre avec une phase huileuse claire, et (C) une pastille GUV avec des débris à l’interface OS/LS (les débris et la pastille apparaissent rougeâtres parce que l’IS de cette population GUV a été complétée par 1,65 mM de nouveau colorant coccine pour améliorer la visualisation). Abréviations : LS = solution lipidique ; IS = solution interne ; OS = solution externe ; GUV = vésicule unilamellaire géante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Stabilité de l’émulsion avec différents rapports d’huile et d’eau dans l’huile. La figure montre la stabilité des émulsions dans le temps, en fonction du type d’huile et du rapport eau/huile (p/o) utilisé. L’IS était composé de 230,7 mM de saccharose et de 3,1 mM de bleu brillant FCF pour améliorer la visualisation des émulsions. Les émulsions préparées avec de l’huile minérale sont moins stables que leurs homologues à base d’huile de silicone AR20. Cet effet est encore amplifié par l’augmentation des ratios s/o. Bien que les émulsions dans l’huile de silicone AR20 soient nettement plus stables, leur stabilité diminue également à mesure que le rapport m/s augmente, la séparation de phase étant visible immédiatement après l’émulsification (huile de silicone AR20 à 10 %). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Observation des GUVs avec un microscope à contraste de phase. Un grossissement de 20x de GUVs chargés en saccharose préparé à partir d’un LS composé de 3,18 mM de DOPC dans de l’huile minérale. (A) Échantillon récupéré après l’enlèvement de l’huile ; (B) échantillon récupéré après les étapes de lavage ; (C) faible rendement GUV obtenu à partir d’un LS préparé dans des environnements où l’oxygène et l’humidité ne sont pas régulés ; (D) GUV chargés en microparticules. Barre d’échelle = 10 μm ; Les gouttes d’huile sont encerclées, et des exemples d’agrégats désordonnés de phospholipides et de molécules d’huile sont indiqués par une flèche. Abréviations : LS = solution lipidique ; GUVs = vésicules unilamellaires géantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-6
Figure 7 : Effet de différentes conditions de centrifugation sur la formation de GUV. Images en contraste de phase de GUVs chargés en saccharose préparées avec un LS composé de 0,2 mM de DOPC dans de l’huile de silicone AR20. La figure montre une comparaison qualitative des valeurs géométriques à (A) 16 600 × g pendant 5 min, (B) 3 300 × g pendant 20 min et (C) 500 × g pendant 45 min. Alors qu’une vitesse de centrifugation élevée entraîne une présence plus élevée d’agrégats de phospholipides, une faible vitesse de centrifugation entraîne une réduction du rendement. Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations : LS = solution lipidique ; GUV = vésicule unilamellaire géante ; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-7
Figure 8 : Analyse de la distribution granulométrique. Comparaison de deux échantillons de GUV chargés en saccharose obtenus à partir de (A) 0,2 mM de DOPC dans de l’huile minérale et (B) 0,2 mM de DOPC dans de l’huile de silicone AR20 (*l’échantillon a été dilué 10x pour permettre une distinction claire des GUV sous un microscope à contraste de phase). L’analyse effectuée selon le protocole section 4 montre une distribution granulométrique décalée vers des diamètres plus élevés pour l’échantillon d’huile minérale par rapport aux échantillons d’huile de silicone AR20. Cependant, le rendement de l’échantillon de silicone est presque 20 fois plus élevé. Abréviations : GUV = vésicule unilamellaire géante ; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

PasCondition ECondition PDescription
1.1.14,11 grammes17,11 grammesMasse de saccharose
1.1.12,16 grammes2,16 grammesMasse de glucose
1.1.2240 millions d’euros1000 mMConcentration de saccharose
1.1.2240 millions d’euros240 millions d’eurosConcentration de glucose
1.3.2Huile de siliconeHuile minéralePhase d’huile pour LS
1.3.2Seringue en verre de 0,1 mLSeringue en verre de 0,5 mLSeringue en verre pour transférer le DOPC dans des solutions de chloroforme
1.3.1063 μL500 μLVolume de DOPC dans une solution de chloroforme
1.3.1610 ml5 mLVolume d’huile
2.4.13300 g 20 minutes500 g 45 minutesCondition de centrifugation

Tableau 1 : Variations dans le protocole. Le tableau présente les variations pour les différentes étapes du protocole (indiquées dans la première colonne) permettant de préparer deux populations de GUV différentes : les GUV chargées de saccharose (condition E) et les GUV chargées de microparticules (condition P).

IDÉtapes à suivreDiamètre intérieur (mm)Diamètre extérieur (mm)Longueur (mm)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

Tableau 2 : Tuyaux pour les raccords de gaz et de vide dans la chambre à gants. Le tableau répertorie les dimensions des tuyaux en silicone utilisés pour relier la chambre à gants aux conduites d’azote et de vide. Les ID de référence sont fournis pour faciliter le processus d’assemblage.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les méthodes de production des GUV peuvent être divisées en deux groupes principaux : les méthodes basées sur le gonflement des substrats par hydratation et celles basées sur l’assemblage à partir d’interfaces fluides. Les méthodes du premier groupe sont très efficaces pour fournir de grandes populations de GUV pour les caractérisations biophysiques des membranes lipidiques ou des protéines transmembranaires. En revanche, les méthodes telles que le transfert de gouttelettes sont principalement choisies pour l’encapsulation des cargaisons en raison de la consommation réduite des cargaisons et de l’efficacité d’encapsulation plusélevée18.

Pour cette raison, une pléthore de cargaisons différentes ont été encapsulées dans les GUV, faisant du transfert de gouttelettes un processus de référence pour les cellules artificielles 3,8,9,10 et une solution possible pour construire de nouveaux microrobots biomimétiques 11,12. Pour moduler les propriétés physicochimiques des membranes GUV, différentes molécules peuvent être incluses, telles que les phospholipides ioniques10, les acides gras19, les polymères comme le PEG20 ou le cholestérol21 (bien que les molécules hydrophobes comme le cholestérol aient une grande affinité pour l’huile, ce qui entraîne un contrôle plus faible de la composition de la membrane par rapport aux méthodes de gonflement22). Le protocole est suffisamment polyvalent pour permettre ces modifications, mais certaines étapes ont un impact plus important que d’autres.

Pour discuter des criticités de la méthode, nous avons décrit ici un protocole pour la préparation de deux populations de GUV différentes : une préparation de GUV contenant une solution de saccharose et une préparation de GUV encapsulant des microparticules. Les différences dans le protocole sont détaillées dans le tableau 1 comme la condition E (vide) et la condition P (avec particules). Cette méthode permet la formation de GUV en transférant des gouttelettes d’eau d’une phase huileuse à une phase aqueuse dans un processus bisstable piloté par les phospholipides23 et influencé par les propriétés physicochimiques des trois phases impliquées : IS, OS et LS.

Parmi les trois, le LS est le plus sensible en raison de la sensibilité des phospholipides à la lumière, à l’oxydation et à l’hydrolyse 24,25,26. Pour cette raison, l’étape initiale d’évaporation du solvant organique utilisé pour le stockage à long terme des phospholipides à -20 °C (généralement du chloroforme ou du méthanol) doit être effectuée dans des flacons ambrés sous flux d’azote ou d’argon. Si de faibles niveaux d’humidité ne sont pas garantis dans l’environnement de laboratoire, les phospholipides pourraient être endommagés13, 14, 27. Par conséquent, le LS doit être préparé dans un environnement confiné tel qu’une boîte à gants ou la chambre à gants modifiée économique décrite dans le présent protocole. Une fois que l’huile est ajoutée au film lipidique, le LS peut être retiré de la chambre du gant, et la dissolution complète des phospholipides est effectuée par vortex et chauffage de la solution.

Bien que certains protocoles incluent la sonication à cette étape13, des augmentations localisées de la température peuvent entraîner des dommages encore non décrits pour certaines formulations de LS. Pour cette raison, chauffer la solution dans un bain-marie peut fournir un processus mieux contrôlé et homogène. Pour réduire davantage les risques d’endommager le LS, ce protocole suggère l’utilisation de deux températures différentes : étant donné que la dissolution d’un LS nouvellement préparé nécessite une énergie plus élevée qu’un LS précédemment dissous (en raison d’un empilement plus dense de molécules de phospholipides dans le film étalé à la surface du flacon en verre), 80 °C sont adoptés pour la première dissolution du film lipidique et 50 °C pour simplement redissoudre les phospholipides juste avant leur utilisation. Étant donné qu’une augmentation de la variabilité de la performance au fil du temps est généralement observée pour 3,18 mM de CODPC dans l’huile minérale (figure 4C), l’utilisation de la LS dans un délai d’une semaine est une pratique généralement recommandée. Néanmoins, certaines combinaisons d’huile et de phospholipides peuvent avoir une durée de vie prolongée, et l’utilisation d’une chambre à gants semble également améliorer la stabilité du LS au fil du temps.

La personnalisation des membranes GUV avec des combinaisons spécifiques de phospholipides peut nécessiter des mises en œuvre personnalisées du protocole. Pour naviguer parmi toutes les variations possibles, il est possible de s’appuyer sur les propriétés physico-chimiques du LS. Les concentrations micellaires critiques (CMC) et la diffusivité des phospholipides dans le LS sont influencées par les interactions chimiques avec les molécules de la solution28. La formation de gouttelettes d’eau dans l’émulsion IS/LS est donc influencée par la vitesse à laquelle les phospholipides peuvent se diffuser dans la phase huileuse et atteindre les interfaces eau/huile pour former une monocouche stable (le feuillet interne de la membrane). Des différences de diffusivité ont été observées pour les deux huiles exploitées dans ce protocole, l’huile de silicone AR20 apportant une plus grande stabilité de l’émulsion IS/LS (Figure 6). Étant donné que l’émulsion la plus stable pour les deux huiles a été observée lorsque l’eau était dispersée à un rapport de 2,5 % (ce qui est cohérent avec les observations précédentes dans l’huile minérale13), nous avons fixé ce rapport comme généralement valide.

Néanmoins, comme des rapports plus élevés pourraient fournir des caractéristiques utiles (par exemple, le POPC dans l’huile minérale a montré un changement vers des GUV13 plus grands), nous recommandons d’effectuer un test qualitatif préliminaire comme celui rapporté à la figure 6 pour avoir un aperçu de la stabilité de l’émulsion et, par conséquent, de l’efficacité attendue de l’encapsulation. Ici, nous conseillons aux lecteurs de ne pas se fier à un timing précis ou à des itérations de procédures pour la formation de l’émulsion, car l’efficacité dépend strictement de l’opérateur ou de l’instrument adopté. Nous fournissons plutôt un point de contrôle pour aider l’opérateur à comprendre quand la qualité de l’émulsion est suffisamment bonne pour - du moins en théorie - maximiser les chances de convertir les gouttelettes en GUV. La diffusivité des phospholipides dans l’huile influence également leur capacité à se réorganiser lors du transfert de gouttelettes et à former le feuillet externe de la membrane GUV 2,7,18,29. Cette étape est favorisée par un bon équilibrage de l’interface LS/OS. Bien que le temps d’incubation adopté par ce protocole soit conforme aux recommandations générales18, aux mesures de tension interfaciale des rapports précédents7 et à nos expériences préliminaires, les GUV préparés avec différents LS pourraient bénéficier d’un temps d’incubation plus long.

La formation du feuillet externe est également influencée par la vitesse des gouttelettes d’eau traversant l’interface LS/OS, une étape liée à la densité et à la viscosité des trois phases30. Les différences de densité doivent toujours suivre l’ordre : IS > OS > LS. Ceci est essentiel pour permettre d’abord la sédimentation des gouttelettes de SI vers l’interface LS/OS, puis le croisement de l’interface pour la conversion en GUVs et leur sédimentation vers le fond du tube. Bien que le processus puisse se produire spontanément même lorsque de l’eau désionisée est utilisée à la fois comme IS et OS23, une différence de densité entre IS et OS a été introduite pour favoriser la formation de GUV31. La paire la plus courante à cet effet est le saccharose dans l’IS et le glucose dans l’IS : aux concentrations équiosmolaires nécessaires pour éviter d’endommager les GUVs en formation en raison du stress osmotique, le saccharose fournit une solution plus dense que le glucose. Comme la différence de densité augmente avec l’osmolarité de ces solutions, le rendement des GUVs varie en conséquence, sans qu’aucune amélioration supplémentaire ne soit observée au-delà de 600 mOsm13.

Les conditions optimales de centrifugation sont étroitement liées à la densité et à la viscosité des trois phases et à la diffusivité des phospholipides. En l’absence d’une caractérisation complète des trois phases, plusieurs conditions doivent être examinées. À partir d’essais qualitatifs (Figure 4E et Figure 5) et d’analyses systématiques préliminaires17, il a été possible de définir de bonnes conditions de centrifugation pour les deux échantillons décrits dans ce protocole ; Cependant, la qualité des échantillons est susceptible d’être améliorée si davantage de conditions sont examinées. Lorsque l’équilibre entre la diffusivité des phospholipides dans le LS et la densité et la viscosité des trois phases n’est pas correctement maintenu, les phospholipides n’ont pas le temps de s’équilibrer à l’interface LS/OS et de se réorganiser correctement lorsque les gouttelettes d’eau se déplacent vers le SG. Cela conduit souvent à la formation d’un précipité blanchâtre à l’interface ou juste en dessous, probablement composé de phospholipides et d’autres molécules en phase huileuse entraînées par des gouttelettes qui ne s’assemblent pas en GUV pendant la centrifugation.

L’encapsulation d’une solution homogène peut être pilotée par l’augmentation de la densité IS tout en préservant un équilibre osmotique avec le SG (comme pour le couple saccharose-glucose), mais l’encapsulation d’une dispersion de microparticules nécessite que la densité de la phase aqueuse corresponde à celle des microparticules32. L’efficacité de l’encapsulation de la cargaison est également affectée par la composition chimique de la solution/dispersion de la cargaison. Des rapports précédents ont montré un effet négatif sur le rendement GUV causé par de nombreux halogénures de métaux alcalins33 ou des variations de pH13, très probablement en raison d’interactions ou de changements dans la charge nette des têtes hydrophiles zwitterioniques des phospholipides. Par conséquent, l’encapsulation de réactions biologiques (telles que la synthèse enzymatique ou acellulaire des protéines) nécessite souvent un compromis, car le pH et les concentrations en sel (tels que KCl ou NaCl) doivent être ajustés à des niveaux sous-optimaux pour la réaction elle-même. Néanmoins, même les mélanges réactionnels complexes tels que la synthèse de protéines acellulaires peuvent être modifiés pour fournir des cellules artificielles fonctionnelles à base de GUV34.

D’un point de vue pratique, bien que la méthode de transfert de gouttelettes offre un processus très simple, la récupération des GUV à partir du système d’exploitation peut présenter certaines limitations. Pour aider à éliminer l’huile de la phase supérieure après l’étape de centrifugation, il est possible d’exploiter deux pointes de pipette pour un retrait plus fin (étape 3.1.1 du protocole) ou une fiole Buchner pour une élimination plus rapide lorsque plusieurs échantillons sont préparés (étape 3.1.2 du protocole). Néanmoins, l’huile n’étant pas complètement éliminée, il est nécessaire d’effectuer une étape de lavage pour obtenir une dispersion GUV propre (étape du protocole 3.2). Bien que les étapes de lavage aient permis d’éliminer efficacement les gouttelettes d’huile résiduelles sans perte appréciable de GUV (figures 4A, B), ce passage peut être moins simple avec de l’huile très visqueuse et prendre beaucoup de temps lorsque plusieurs formulations de GUV sont préparées. Une méthode alternative a été décrite pour contourner l’évacuation de l’huile et récupérer le GUV du fond du tube par un trou percé à l’aide d’une aiguille35. Cependant, ce processus peut ne pas permettre une récupération complète de la pastille GUV si le tube n’est pas percé dans la bonne position et, de plus, il est potentiellement dangereux pour l’opérateur.

Pour aider à la récupération du GUV, nous introduisons ici une nouvelle approche simple pour éliminer rapidement la phase huileuse. Il s’agit de piéger la phase huileuse supérieure, moins dense, dans une pointe de pipette bouchée afin que, après la centrifugation, la pointe puisse être retirée de manière à ce qu’aucun liquide ne s’écoule. Cette stratégie simple permet un retrait rapide et facile de toute la phase d’huile en une seule fois, simplifiant ainsi constamment cette étape chronophage.

Pour évaluer l’efficacité du protocole, quelques méthodes ont été mises en œuvre pour la détection automatique des GUV afin d’accélérer le comptage et l’analyse de la distribution de taille. Le marquage des GUV à l’aide de sondes fluorescentes fournit une stratégie simple et efficace appliquée à la fois à la cytométrie en flux36,37 et à l’imagerie microscopique combinée à des algorithmes de détection de cercles 13,37,38,39. Plus récemment, des outils basés sur l’IA pour la détection d’objets sont à l’étude pour améliorer ce processus40,41. Cependant, les colorants fluorescents peuvent potentiellement affecter les propriétés GUV, introduisant ainsi des artefacts dans l’analyse. Si l’on exclut le signal fluorescent détectable, la microscopie reste l’option la plus fiable, la microscopie à contraste de phase étant la méthode privilégiée pour une visualisation optimale18 et l’application d’algorithmes de détection de cercles38.

Alternativement, il est possible d’exploiter les propriétés particulières de formulations spécifiques pour des stratégies de détection uniques. Hadorn et al., par exemple, ont exploité la présence d’électrolytes dans l’IS pour détecter les GUV avec un compteur de cellules basé sur l’impédance33. Lorsqu’aucune de ces méthodes automatisées ou spécifiques à la formulation n’est réalisable, l’annotation manuelle des cercles reste une solution de repli universellement applicable. Dans de tels cas, ImageJ offre un outil pratique pour accélérer le processus et extraire facilement les mesures de diamètre brutes comme décrit dans ce protocole.

Malgré l’adoption généralisée de la méthode de transfert de gouttelettes, peu d’attention est accordée aux processus d’optimisation requis pour les nouvelles formulations GUV. Dans ce travail, nous avons rassemblé les informations disponibles dans la littérature pour mettre en place un protocole systématique permettant de piloter et de simplifier cette optimisation. Ce guide pratique examine les principes sous-jacents impliqués dans la production de nouvelles formulations de GUV et dans la récupération d’un échantillon minimalement contaminé par l’huile, un aspect souvent négligé du protocole13,14. Bien qu’il ne soit pas possible de prédire l’optimisation requise par toute formulation de GUV, ce guide fournit des conseils et des informations utiles pour accélérer la mise en œuvre de nouveaux GUV, conduisant potentiellement à des applications telles que les cellules artificielles et les microrobots.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces résultats s’inscrivent dans le cadre du projet CELLOIDS (Cell-inspired particle-based intelligent microrobots) qui a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 948590). Ce travail a été soutenu en partie par la Commission européenne dans le cadre du projet NextGenerationEU BRIEF. Nous remercions Michele Ibrahimi pour le soutien technique dans la mise en place de la chambre à gants et pour la discussion utile sur la mise en œuvre du conteneur pour l’élimination facile de l’huile.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 et micro ; Membrane mixte d’esters de cellulose  ; filtres pour seringuesMerckSLGSVR255F
Tubes de 1,5 mLBioclasse06.0279.00
100 &mu ; Seringue en verre LMerck20737
Bécher de 150 mLAvantor  ;213-1123Au moins 3
Flacons en verre foncé de 20 mL ND24Avantor  ;Référence 548-9001A
Tubes de 2 mLBioclasse07.3534.99
Bouteille de 50 mLAvantor  ;612-3843
500 &mu ; Seringue en verre LHamilton549-1166
Tube Falcon de 50 mLMerckCLS352070
Seringue de 50 ml  ;Fisher Scientific8SS50L1
Tubes de 5 mLGreiner bio-one622201
Bécher de 600 mLAvantor  ;213-1126
Bü ; Gourde chnerMerckZ740682
Anneaux en liège pour flacons à fond rondAvantor  ;217-1000
CristalliseurDutscherRéférence 080474A
D-(+)-glucoseSigma-AldrichRéférence G8270
D-(+)-SaccharoseSigma-AldrichS9378
Thermo-hygromètre numériqueBohlenderRéférence V1863-07
DOPCRecherche AvantiRéférence 850375C
ForerDremel4000
Sel d’érioglaucine disodique (Bleu Brillant FCF)Sigma-Aldrich861146
Aiguille de seringue G18TerumoAN1838R1
Aiguille de seringue G21TerumoAN2138R1
Chambre à gantsBel-ArtRéférence F50030-0000Si disponible, une boîte à gants peut être utilisée, mais dans les laboratoires à faible taux d’humidité, cela peut ne pas être nécessaire
Agitateur magnétique à plaque chauffanteMatériel de laboratoire LLG6.263 448
Huile minérale légèreSigma-Aldrich330779
Nouvelle coccineSigma-Aldrich199737
Joint torique en caoutchouc nitrile, alésage de 8 mm, diamètre extérieur de 12 mmRS196-4863
Bouchons à vis ouverts avec septum ND24Avantor  ;Référence 548-0031A
Micropipette P1000Fisher Scientific12346132
Micropipette P10000Avantor  ;89079-978
Micropipette P200Fisher Scientific12326132
Essuie-toutAvantor  ;KIMB6657
ParafilmAvantor  ;291-1214
Pointes de pipette (1000)Eppendorf0030000919
Pointes de pipette (10000)Eppendorf0030000765
Pointes de pipette (200)Eppendorf0030000870
Particules de polystyrène, 1,1 & micro ; mSigma-AldrichLB11-1ML
Capuchon en caoutchoucBioclass S.r.l.12.2300.05
Joint conique en caoutchoucAvantor  ;217-0211
Bouchons à vis  ; ND24Avantor  ;Référence 548-0161A
Huile de silicone AR20Sigma-Aldrich10836
Tuyau en silicone (diamètre intérieur 1,6 mm, diamètre extérieur 3 mm)RS667-8441
Tuyau en silicone (diamètre intérieur 6 mm, diamètre extérieur 12 mm)RS273-2541Au moins 6 m
Jonction à trois voiesRS795-405
Jonction à double sensRS419-7287
Vanne à deux voiesClaber91280
Eau ultra-pureThermo Fisher Scientific  ;22934Lorsqu’il est disponible, ce produit peut être remplacé par de l’eau purifiée par les systèmes Milli-Q
Ciseaux universelsBochem4154

Références

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Transfert d mulsionbiologie synth tiqueencapsulation v siculairesuspension lipidiquelimination de la phase huileusemicrorobotiqueprotocole de centrifugationmembrane phospholipidique

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