Article de méthode

Analyse 3D simultanée des lésions cardiaques et de la réponse immunitaire dans l’infarctus aigu du myocarde reperfusé à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière

DOI :

10.3791/68347

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26 septembre 2025

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1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La reconstruction tridimensionnelle (3D) des lésions cardiaques lors d’un infarctus aigu du myocarde reperfusé (repAMI) permet une quantification fidèle et une co-localisation des modèles associés affectant la maladie. Ici, une approche d’imagerie automatisée guidée par feuille de lumière est fournie pour la mesure contemporaine des lésions cardiaques, de la zone à risque et de la réponse des cellules immunitaires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des interactions cellulaires complexes déterminent le remodelage fonctionnel et structurel des tissus lors d’un infarctus aigu du myocarde reperfusé (repAMI). Ces processus présentent une distribution spatiale distincte car le muscle cardiaque lésé est segmenté en différentes zones (zone endommagée, zone à risque (AAR) et zone éloignée). La visualisation tridimensionnelle (3D) de ces zones est essentielle pour l’analyse des différentes interactions entre les cellules cardiaques résidentes et les cellules immunitaires infiltrantes, permettant d’identifier des cibles de traitement possibles. Ici, un protocole est décrit pour la visualisation et la quantification 3D simultanées et automatisables de la zone de lésion cardiaque, de l’ARA et des cellules immunitaires infiltrantes (par exemple, les neutrophiles) après repAMI. Cela comprend la coloration médiée par les anticorps intravitaux de la zone des lésions cardiaques (CD31neg) et de l’infiltration des neutrophiles (Ly6G+) après visualisation ex vivo de l’AAR par perfusion d’anticorps rétrogrades, et d’autres nettoyages tissulaires non toxiques pour l’imagerie par microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM). Cette technique permet l’analyse spatiale des cellules cibles, par exemple, des cellules immunitaires infiltrantes et des zones endommagées dans un cœur de souris intact après repAMI. L’histologie et l’immunohistochimie traditionnelles peuvent être réalisées après l’élimination des tissus non toxiques et l’acquisition d’images avec post-traitement assisté par ordinateur. Cela permet de multiplexer le gain d’informations dans le même cœur de souris, ce qui renforce la robustesse des données et est particulièrement important dans une blessure très complexe comme repAMI.

Introduction

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Les lésions tissulaires dans l’infarctus aigu du myocarde reperfusé (repAMI) sont le principal facteur déterminant du remodelage cardiaque et du développement de l’insuffisance cardiaque1. De multiples médiateurs locaux et cellules cardiaques résidentes, mais aussi des cellules immunitaires infiltrantes affectent son expansion dans une interaction complexe 2,3. Comprendre l’organisation spatiale de ces processus est essentiel pour acquérir des connaissances approfondies afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter les lésions tissulaires après repAMI et améliorer la fonction cardiaque.

Étant donné que le muscle cardiaque lui-même est constitué de différents types de cellules, l’analyse détaillée des lésions cardiaques est difficile car chaque type de cellule présente sa propre capacité de résistance spécifique lors d’une ischémie et d’une lésion de reperfusion 4,5. Une caractéristique importante dans le contexte de la repAMI est une perte majeure de système vasculaire accompagnée d’une détérioration de la fonction des cellules endothéliales6. Le marqueur le plus établi utilisé pour la représentation de la structure vasculaire et l’analyse du dysfonctionnement endothélial chez la souris et l’homme est CD31 (également connu sous le nom de PECAM-1), une molécule d’adhésion exprimée à la surface de la cellule endothéliale7. Dans différents modèles d’ischémie/reperfusion, la perte de CD31 s’est avérée être un bon marqueur de substitution pour la distinction des lésions du tissu endothélial 8,9,10. De plus, trois compartiments de blessures majeurs sont distingués dans l’ensemble du cœur pendant la repAMI. Le tissu cardiaque non affecté par une lésion d’ischémie/reperfusion (I/R) représente la zone éloignée. Le myocarde en aval de l’occlusion d’un vaisseau est défini comme une zone à risque (RAA)11,12. Après le début de la reperfusion, une zone distincte du tissu cardiaque peut être différenciée à l’intérieur de l’AAR, qui a été endommagée par l’ischémie précédente (zone de lésion)13. L’évaluation conventionnelle des lésions cardiaques I/R chez la souris utilise du chlorure de triphényltétrazolium (TTC) en séries de coupes épaisses montrant une activité métabolique réduite des cellules cardiaques endommagées13,14. Simultanément, la coloration bleue ex vivo d’Evan peut être ajoutée pour la détermination de AAR15. Cependant, ces méthodes établies présentent plusieurs limites, notamment la possibilité réduite de co-évaluation de l’infiltration des cellules immunitaires, la distinction des lésions spécifiques au type de cellule et la reconstruction précise des tissus en 3D.

La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM) permet de visualiser des organes entiers de souris intacts avec une résolution du signal de fluorescence jusqu’au niveau cellulaire. Récemment, une méthode améliorée d’élimination des tissus non toxiques a été introduite à l’aide du cinnamate d’éthyle (ECi) pour la visualisation 3D de cœurs de souris intacts8. Pour remédier aux limites de la coloration bleue de TTC/Evan, une coloration par fluorescence CD31 à base d’anticorps intravitaux a été utilisée, révélant des lésions endothéliales cardiaques comme des zones sans coloration CD31 (CD31neg) au cours de la repAMI8. L’administration supplémentaire d’une injection aortique rétrograde ex vivo avec un anticorps anti-CD31 conjugué à un fluorophore avec un autre spectre de fluorescence, comme pour la coloration intravitale, tient compte de la représentation 3D contemporaine de l’AAR. De plus, cette méthode peut être étendue en ajoutant la coloration des neutrophiles, ce qui permet d’analyser la distribution cellulaire séparée par zone distante, RAA et volume de lésions endothéliales cardiaques afin d’améliorer la compréhension de la fonction des neutrophiles pendant la repAMI.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures d’expérimentation animale ont été approuvées par l’agence gouvernementale locale compétente (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) et ont respecté toutes les réglementations éthiques pertinentes pour l’expérimentation animale et la recherche. Les expériences ont été réalisées avec des souris C57BL/6J mâles (âgées de 9 à 30 semaines). Les animaux ont été logés et utilisés dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (SPF) dans l’animalerie locale à raison de 12 h/12 h de jour et de nuit.

REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous induction intrapéritonéale d’une anesthésie à l’aide de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) avec entretien à l’aide d’isoflurane (1,5 Vol %). Pour diminuer la souffrance animale, tous les animaux ont reçu des injections sous-cutanées de 0,1 mg/kg de buprénorphine avant et après l’anesthésie pendant la journée en association avec de la buprénorphine contenant de l’eau potable pendant la nuit. Le protocole chirurgical d’induction de la repAMI a déjà été décrit ailleurs16,17. Avant de commencer l’injection intravitale d’anticorps, préparez deux boîtes de Pétri de 6 cm qui sont utilisées pour l’injection d’anticorps rétrogrades ex vivo dans les étapes ultérieures décrites ci-dessous. Une boîte de Pétri peu profonde avec du PBS sur de la glace est nécessaire pour l’élimination grossière de l’excès de tissu environnant du cœur (il est recommandé d’utiliser des morceaux de gaze coupés à la taille voulue à l’intérieur de la boîte pour faciliter le processus de manipulation ultérieur). Une autre boîte est nécessaire pour la canulation aortique avec une aiguille de canule en acier émoussé de 20 G immergée dans du PBS sur de la glace avec un nœud lâche de suture 5-0 sur l’encoche de la canule. Évitez ou éliminez les bulles d’air à l’intérieur de la canule, car elles peuvent bloquer les vaisseaux coronaires et empêcher la perfusion totale.

1. Injection intravitale d’anticorps

  1. Anesthésier la souris à l’aide de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
  2. Injecter 10 μg chacun d’anticorps anti-CD31 de souris (clone : MEC13.3 ; fluorophore : AlexaFluor 790) et d’anticorps anti-Ly6G de souris (clone : 1A8 ; fluorophore : AlexaFluor 647) dans du PBS d’un volume total de 5 μL par g de poids corporel (100 μL pour une souris de 20 g) par injection intraveineuse dans la veine de la queue.
    REMARQUE : Cette injection d’anticorps marquera tout l’endothélium à l’intérieur du cœur et vise à quantifier la taille des lésions de l’AMIrep.
  3. Laissez circuler les anticorps injectés pendant 10 min avant de poursuivre l’intervention.

2. Prélèvement cardiaque

REMARQUE : Les sections 2 et 3 sont urgentes et doivent être terminées en moins de 6 minutes.

  1. Sacrifiez l’animal par luxation cervicale 10 min après l’injection d’anticorps. Contrôlez la mort en évaluant les réflexes.
    REMARQUE : Si des échantillons de sang sont nécessaires, prenez-les avant de passer à l’étape suivante.
  2. Placez la souris sous un stéréomicroscope.
  3. Ouvrez la cavité thoracique et incisez la veine cave supérieure exposée près de la sortie du vaisseau de la cage thoracique vers le cou.
    REMARQUE : Gardez l’aorte intacte car elle est nécessaire pour l’injection d’anticorps rétrogrades ex vivo .
  4. Perfuser les cœurs in situ via le pavillon auriculaire droit et gauche avec du PBS contenant de l’héparine (20 IE/mL) à l’aide d’une aiguille de 27 G avec une pompe à rouleaux (70 μL/s) pour un total de 3 min. L’élimination suffisante du sang cardiaque devient perceptible par l’estompement du dessin vasculaire superficiel du cœur et le blanchiment des poumons et du foie.
    REMARQUE : Évitez la perfusion cardiaque par le ventricule droit ou gauche car elle pourrait provoquer des artefacts d’imagerie lors de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière.
  5. Exciser le cœur et au moins 5 mm de l’aorte restante ainsi que le tissu pulmonaire environnant.
    REMARQUE : Ne tenez pas le muscle cardiaque directement pendant l’excision pour éviter de lésion tissulaire et d’artefacts d’imagerie pendant la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière.

3. Injection d’anticorps rétrogrades ex vivo

  1. Transférez le cœur dans une boîte de Pétri de 6 cm avec du PBS glacé et de la gaze préparée plus tôt.
  2. Coupez le reste des tissus tendre, adipeux et vasculaires environnants jusqu’à ce qu’il ne reste que le cœur avec une aorte d’environ 5 mm.
  3. Transférer le cœur dans le plat préparé pour la canulation aortique.
  4. Tirez l’aorte restante sur la canule en acier émoussé 20 G et ligaturez-la avec la suture pré-nœud 50 à l’encoche de la canule.
    REMARQUE : L’extrémité de la canule doit être poussée près de la valve aortique pour éviter toute fuite de liquide de perfusion.
  5. Ligaturer de nouveau l’artère descendante antérieure gauche (DAL) de façon permanente avec une suture 6-0 à l’endroit exact utilisé pour l’induction de la repAMI précédemment.
  6. Injecter 400 μL de PBS contenant 20 μg d’anticorps anti-CD31 de souris (clone : MEC13.3), marqué avec AlexaFluor 546, rétrogradement via une canule insérée.
    REMARQUE : Fermez la jonction entre la seringue d’injection et la canule insérée avec un film d’étanchéité pour assurer une perfusion complète d’anticorps via les artères coronaires. Cette injection d’anticorps ne colorera l’endothélium qu’en dehors de l’AAR et peut donc être utilisée pour la quantification de l’AAR.
  7. Retirez la canule insérée de l’aorte.
  8. Transférez le cœur dans un tube de réaction en polypropylène de 15 ml contenant 10 ml de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et incubez sans agitation pendant la nuit à 4 °C dans l’obscurité.

4. Traitement et clarification des échantillons

  1. Laver le cœur fixé en trois changements de 5 mL de PBS pendant 10 min chacun à température ambiante (RT) dans l’obscurité, en agitant toujours avec une rotation proche de la tête dans des tubes de réaction en polypropylène de 5 mL.
  2. Déshydrater le cœur fixé dans une série ascendante d’éthanol de 5 mL à 50 %, 70 % et 100 % dans de l’eau désionisée, chacun pendant au moins 2 h à RT dans l’obscurité en agitant toujours avec une rotation presque aérienne dans des tubes de réaction en polypropylène de 5 mL.
    REMARQUE : L’incubation dans de l’éthanol à 50 % et à 70 % peut être prolongée jusqu’au lendemain, tandis que l’incubation dans de l’éthanol à 100 % peut être prolongée jusqu’à 3 jours.
  3. Cœur déshydraté à l’eau de Javel dans des tubes de réaction en polypropylène de 15 mL contenant 10 mL d’éthanol à 5 % de DMSO et 5 % de H2O2 sans agitation pendant 4 h à 4 °C dans l’obscurité.
    REMARQUE : La pression peut s’accumuler à l’intérieur du tube pendant le processus de blanchiment ; Faites attention lorsque vous ouvrez le tube par la suite.
  4. Laver le cœur blanchi dans 5 mL d’éthanol à 100 % trois fois pendant 12 h chacune à RT dans l’obscurité, en agitant toujours avec une rotation presque aérienne dans des tubes de réaction en polypropylène de 5 mL.
    REMARQUE : Chaque étape d’incubation peut être prolongée jusqu’à 3 jours.
  5. Transférez le cœur dans un tube de réaction en polypropylène de 5 ml contenant 4 ml de cinnémate d’éthyle (ECi) pour éliminer les tissus et incubez sans agitation pendant 3 jours à RT dans l’obscurité.
    REMARQUE : Le cœur dégagé peut rester en ECi pendant au moins 3 mois sans diminution de l’intensité de la fluorescence dans le cadre d’un stockage correct dans l’obscurité à RT. Ne stockez pas ECi ou les échantillons stockés dans ECi en dessous de 6 °C, car ECi gèle à cette température, ce qui nuit à l’échantillon au cours du processus.

5. Préparation des blocs de gomme gellane

  1. Mélangez 1 g de poudre de gomme gellane dans 100 mL d’eau du robinet chauffée (50-60 °C).
  2. Laisser mélanger jusqu’à résolution complète à l’aide d’un agitateur magnétique.
    REMARQUE : Si la poudre ne se résout pas correctement, chauffez la solution jusqu’à ébullition au micro-ondes.
  3. Filtrez la solution de gomme gellane à travers une passoire à cellules de 100 μm.
  4. Plaque de solution filtrée dans une boîte de Pétri peu profonde de 10 cm.
  5. Laisser refroidir jusqu’à ce que le gel durcisse.
  6. Coupez le gel en blocs de 15 mm, 15 mm, 5 mm.
  7. Déshydrater des blocs dans 50 mL de séries ascendantes d’éthanol à 50 % et 70 % dans de l’eau désionisée, chacun pendant au moins 2 h à RT, en agitant toujours avec une rotation presque aérienne dans un tube de réaction en polypropylène de 50 mL.
    REMARQUE : Remplissez le tube de réaction avec de l’éthanol après avoir ajouté des blocs de gel. Ne remplissez le tube de réaction qu’à moitié avec des blocs de gel.
  8. Incuber des blocs déshydratés dans 50 mL d’éthanol à 100 % trois fois pendant 12 h chacun à RT, en agitant toujours avec une rotation proche de la tête dans un tube de réaction en polypropylène de 50 mL.
    REMARQUE : Remplissez le tube de réaction avec de l’éthanol après avoir ajouté des blocs de gel. Ne remplissez le tube de réaction qu’à moitié avec des blocs de gel. Les blocs de gel peuvent rester dans le dernier tube de réaction avec de l’éthanol à 100 % pendant de longues périodes jusqu’à ce qu’ils soient éliminés dans ECi.
  9. Transférez les blocs dans un tube réactionnel en polypropylène de 50 mL contenant 25 mL d’ECi et incubez sans agitation pendant 3 jours à RT.
    REMARQUE : Ne mettez que quelques blocs dans un tube de réaction avec ECi pour éviter d’effacer les artefacts. Les blocs effacés peuvent rester dans ECi pendant au moins 6 mois et stockés chez RT.

6. Imagerie

  1. Coupez les blocs de gomme gellane clairus à la taille nécessaire pour stabiliser le cœur dégagé dans le porte-échantillon du microscope.
    REMARQUE : Les blocs de gomme gellane peuvent être réutilisés plusieurs fois.
  2. Détectez les signaux de fluorescence d’intérêt (autofluorescence, coloration AAR [anticorps anti-CD31 marqué avec AlexaFluor 546], anticorps anti-Ly6G couplé à AlexaFluor647 et colorationnégative CD31 [anticorps anti-CD31 marqué avec AlexaFluor 790]) avec les paramètres de filtre d’excitation et d’émission appropriés. Pour l’acquisition, utilisez un objectif de 0,1 NA avec une distance de travail de 17,6 mm.
    REMARQUE : Détectez les signaux avec un laser à lumière blanche (200 mW ; 480-2400 nm). Pour la détection de l’autofluorescence dérivée du tissu conjonctif, utiliser un filtre d’excitation passe-bande 470/30 nm et un filtre passe-bande 525/50 nm ; La coloration CD31 avec un anticorps couplé à AlexaFluor 546 est détectée avec un filtre d’excitation passe-bande 520/40 nm et un filtre d’émission passe-bande 585/40 nm ; La coloration Ly6G avec un anticorps couplé à AlexaFluor 647 est détectée avec un filtre d’excitation passe-bande 630/30 nm et un filtre d’émission passe-bande 680/30 nm ; La coloration CD31 avec un anticorps couplé à AlexaFluor 790 est détectée avec un filtre d’excitation passe-bande 740/40 nm et un filtre d’émission passe-bande 824/55 nm. Les temps d’éclairage et le pourcentage d’atténuation du laser doivent être ajustés en fonction de la qualité du signal.
  3. Choisissez les paramètres suivants pour l’imagerie par microscopie à feuillet de lumière :
    1. Choisissez une feuille NA de 0,079, ce qui permet d’obtenir une épaisseur de feuille légère de 5 μm.
    2. Choisissez 10 μm comme distance entre deux plans z individuels.
      REMARQUE : Il en résulte un sous-échantillonnage et une perte de précision pour le traçage et les mesures de volume. Pour éviter cela, une distance entre deux plans z individuels doit être égale à la moitié de l’épaisseur de la feuille légère, donc dans ce cas, 2,5 μm. Cette étude a choisi de sous-échantillonner les données, car les avantages obtenus par la réduction du temps d’imagerie et de la taille de la pile de données l’emportent sur la perte minimale de précision de l’analyse.
    3. Utilisez une largeur de feuille de 100 % pour obtenir un éclairage homogène de l’échantillon.

7. Post-traitement de l’image

REMARQUE : Les données d’image numérique acquises ont été traitées à l’aide d’un logiciel scientifique de traitement et d’analyse d’images 3D répertorié dans la Table des matériaux.

  1. Démarrez le logiciel Imaris file converter 10.1 et chargez l’ensemble de données brutes dans le logiciel soit par glisser-déposer le dossier contenant les fichiers image dans la fenêtre du convertisseur de fichiers Imaris, soit en cliquant sur Parcourir et en accédant au dossier contenant les fichiers image.
  2. Sélectionnez le dossier de sortie via Sélectionner un dossier.
  3. Cliquez sur Démarrer tout et attendez que les fichiers soient convertis en fichiers .ims Imaris.
  4. Démarrez le logiciel et sélectionnez Surpasser dans le coin supérieur gauche.
  5. Ouvrez les piles d’images en choisissant Ouvrir et sélectionnez le fichier de données .ims correspondant.
  6. Pour créer une surface générée automatiquement de l’ensemble du cœur, sélectionnez Vue 3D et Surfaces.
  7. Choisissez Nechoisir qu’une région d’intérêt, Traiter l’image entière et Statistiques objet-objet tout en désactivant Classer les surfaces dans la section Paramètres de l’algorithme .
    REMARQUE : L’activation des statistiques objet-objet permet le calcul de superposition de différentes surfaces et fonctions ponctuelles.
  8. Cliquez sur le bouton flèche bleue dans le coin inférieur droit de la feuille Créer pour passer aux étapes suivantes.
  9. Déterminez la région tridimensionnelle d’intérêt à l’aide des manipulateurs apparaissant dans la vue de l’image.
  10. Passez à l’étape suivante en choisissant le canal source (canal d’autofluorescence).
  11. Activez Smooth et choisissez le réglage par défaut de 11,8 μm.
  12. Passez à l’étape suivante et déterminez le seuil nécessaire pour créer une surface tridimensionnelle optiquement satisfaisante apparaissant à l’intérieur de la vue de l’image.
  13. Dans la dernière étape, ajustez le filtre de surface, en choisissant Nombre de voxels comme type de filtre et en déterminant 10 comme seuil.
  14. Créez une surface en cliquant sur le bouton flèche verte dans le coin inférieur droit de la section Créer . À l’aide de la feuille de couleur , modifiez le matériau et la couleur de la surface créée selon vos besoins.
  15. Générez deux surfaces supplémentaires créées manuellement pour AAR (volumenégatif CD31 dans le canal AlexaFluor 546) et volume de lésion endothéliale cardiaque (volumenégatif CD31 dans le canal AlexaFluor 790) en choisissant à nouveau Vue 3D et Surfaces .
  16. Choisissez Segmenter uniquement une région d’intérêt, Traiter l’image entière et Statistiques objet-objet tout en désactivant Classer les surfaces dans la section Paramètres de l’algorithme et cliquez sur Ignorer la création automatique, modifier manuellement.
  17. À l’intérieur de la feuille Tableau , sélectionnez XY pour l’orientation, Aucun pour la visibilité et ajustez manuellement le contrôleur de résolution au maximum.
  18. Accédez à la feuille Modèle , cliquez sur l’icône Distance et définissez l’espacement des sommets sur 100 μm.
  19. Activez l’option Dessiner et encercler les zonesnégatives CD31 dans le canal AlexaFluor 546 ou le canal AlexaFluor 790 toutes les 10 tranches d’image.
  20. Une fois que vous avez terminé d’encercler toutes les zones appropriées, choisissez Ajustement automatique et Effectuer l’ajustement automatique.
  21. Cliquez sur Créer une surface et ajustez le matériau et la couleur des surfaces générées dans la feuille de couleur .
  22. Pour afficher les neutrophiles sous forme de points Ly6G+ , générez une fonction de point en choisissant Vue 3D et Points.
  23. Sélectionnez Segmenter uniquement une région d’intérêt, Traiter l’image entière et Statistiques objet-objet tout en désactivant l’option Classer les taches dans la section Paramètres de l’algorithme.
  24. Passez aux étapes suivantes à l’aide du bouton flèche bleue dans le coin inférieur droit de la feuille Créer .
  25. Déterminez la région tridimensionnelle d’intérêt à l’aide des manipulateurs apparaissant dans la vue de l’image, comme mentionné ci-dessus.
  26. Passez à l’étape suivante à l’aide du canal source (canal AlexaFluor 647).
  27. Définissez le diamètre XY estimé sur 10 μm, activez l’allongement PSF du modèle le long de l’axe Z et définissez le diamètre Z estimé sur 20 μm.
  28. Désactivez l’option Soustraction d’arrière-plan.
  29. Passez à l’étape suivante, sélectionnez Intensité minimale comme filtre et définissez un seuil approprié.
    REMARQUE : Pour estimer le niveau de seuil, cliquez sur Slice dans la partie supérieure de la fenêtre du programme et sélectionnez le canal AlexaFluor 647. Déplacez le curseur sur différents points de la tranche d’image brute représentant une coloration Ly6G positive et lisez la valeur d’intensité dans le coin inférieur gauche de la fenêtre du programme.
  30. Générez des spots en cliquant sur le bouton flèche verte dans le coin inférieur droit de la feuille Créer .
  31. Définissez l’échelle de rayon sur 3,0 dans la section Style/Qualité des points de la feuille Créer .
  32. Accédez à la feuille de couleur pour ajuster la couleur d’accompagnement comme vous le souhaitez.

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Résultats

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L’approche présentée utilisant la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM) permet l’analyse simultanée de l’AAR, des lésions endothéliales et de l’infiltration des neutrophiles après repAMI. La figure 1A illustre la coloration intravitale et ex vivo des anticorps chez les souris C57BL/6J 24 h après l’induction de la repAMI. Des anticorps pour la coloration des lésions endothéliales cardiaques (anti-CD31 marqué avec AlexaFluor 790) et l’infiltration de neutrophiles (an...

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Discussion

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Il existe plusieurs entités d’imagerie pour détecter les lésions du tissu cardiaque pendant la repAMI chez la souris. Ces techniques offrent différents avantages mais ont aussi des limites. La coloration de la diminution de l’activité métabolique des cellules cardiaques à l’aide de la TTC est la méthode la plus couramment utilisée pour quantifier les lésions cardiaques I/R et peut être combinée avec la coloration bleue d’Evan pour la distinction de AAR 13,14,15.

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elias Haj-Yehia rapporte des honoraires personnels et d’autres d’AstraZeneca, qui sont en dehors du travail soumis. Simon F. Merz et Lea Bornemann travaillent actuellement chez Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. Matthias Totzeck et Tienush Rassaf font état d’honoraires personnels, et d’autres d’Edwards et Novartis, de Bristol Myers Squibb, de Bayer, de Daiichi Sankyo et d’Astra Zeneca, qui ne font pas partie du travail soumis. Tienush Rassaf et Ulrike B. Hendgen-Cotta ont cofondé Bimyo, une société spécialisée dans le développement de peptides cardioprotecteurs. Matthias Gunzer a reçu un financement général de la recherche de Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient les sources de financement suivantes : Fondation allemande pour la recherche (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia ; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) et la Société allemande de cardiologie (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Une partie de ce travail a été réalisée au Centre d’imagerie d’Essen (IMCES), une plate-forme de service de la Faculté de médecine de l’Université de Duisburg-Essen, en Allemagne. Nous remercions le personnel de l’IMCES pour son soutien technique continu et l’utilisation de ses instruments.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille de 27 gBecton Dickinson305889BD Eclipse
Traitement d’images 3D & logiciel d’analysePlan binaireVers. 10.1.0Imaris
Suture 5-0Serag-WiessnerIC108000Soie
Suture 6-0ÉthiconEH7814Prolène
Kit d’étiquetage d’anticorps AlexaFluor 546InvitrogenN° A20183
Kit d’étiquetage d’anticorps AlexaFluor 790InvitrogenA20189
Anticorps anti-souris Ly6G (AlexaFluor 647)Biolégende127610Clone : 1A8
Passoire à cellules (100 µ ; m)Corning431752
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Carl Roth7029.1
ÉthanolCarl Roth0911.4
Cinnémate d’éthyle (ECi)Sigma-Aldrich112372
Logiciel de conversion de fichiersPlan binaireVers. 10.1.0Imaris
GazeFuhrmann10021
Gomme gellane en poudreSigma-AldrichRéf. P8169Le phytagel
Héparine (25.000 IE/5 mL)LEO Pharma15261203
Peroxyde d’hydrogène (H2O2, 30 %)Carl Roth8070.2
Seringue d’injectionB BraunRéférence 9161502SOmnican F
Kétamine (100 mg/mL)bela-pharma402581.00.00
Système de microscope à feuillet de lumièreMiltenyi Biotec-UltraMicroscope Blaze
Seringue Luer LockBecton Dickinson303172BD Plastipak
Agitateur magnétiqueVWR444-0572
Appareil photo Neo sCMOS (4,2 MP)Technologie AndorCellule ZL41 4.2
ObjectifMiltenyi Biotec130-133-625MI Plan 1,1x NA 0,1, WD 17,6 mm
Paraformaldéhyde (PFA, 4 %)Sigma-Aldrich1.0049610 % formol, tamponné neutre
PétriGreiner Bio-One632181
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Gibco14190-094Sans MgCl2/CaCl2
Tube en polypropylène (15 mL)Greiner Bio-One188261
Tube en polypropylène (5 mL)Carl RothEKY9.1Noir
Tube en polypropylène (50 mL)Greiner Bio-One227261
Plat de préparation pour la canulation du cœur de sourisHugo Sachs Elektronik73-4327Canule incluse
Anticorps CD31 anti-souris purifiéBecton Dickinson53369Clone : MEC13.3
Pompe à rouleauxIsmatecISM597-230
Film d’étanchéitéBemisRéf. PM-996Parafilm
StéréomicroscopeLeicaS6D
Rotateur de tubeHeidolphPolymax 1040
Laser à lumière blanchePhotonique NKTSuperK extrême200 mW, 480&ndash ; 2400 milles marins
Souche de souris WTJanvier Labs-C57BL/6JRj
Xylazine (2 %)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Références

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  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol. 30 (3), 240-245 (2015).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction: from inflammation to fibrosis. Circ Res. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Koch, A., et al. Capillary endothelia and cardiomyocytes differ in vulnerability to ischemia/reperfusion during clinical heart transplantation. Eur J Cardiothorac Surg. 20 (5), 996-1001 (2001).
  5. Singhal, A. K., Symons, J. D., Boudina, S., Jaishy, B., Shiu, Y. T. Role of endothelial cells in myocardial ischemia-reperfusion injury. Vasc Dis Prev. 7, 1-14 (2010).
  6. Robbers, L. F., et al. Magnetic resonance imaging-defined areas of microvascular obstruction after acute myocardial infarction represent microvascular destruction and haemorrhage. Eur Heart J. 34 (30), 2346-2353 (2013).
  7. DeLisser, H. M., Newman, P. J., Albelda, S. M. Molecular and functional aspects of PECAM-1/CD31. Immunol Today. 15 (10), 490-495 (1994).
  8. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10 (1), 2312(2019).
  9. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  10. Zhong, X., et al. Tubular epithelial cells-derived small extracellular vesicle-VEGF-A promotes peritubular capillary repair in ischemic kidney injury. NPJ Regen Med. 7 (1), 73(2022).
  11. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).
  12. Arai, A. E. Magnetic resonance imaging for area at risk, myocardial infarction, and myocardial salvage. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 313-320 (2011).
  13. Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Res Cardiol. 113 (5), 39(2018).
  14. Rassaf, T., et al. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circ Res. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  15. Haj-Yehia, E., et al. CD47 blockade enhances phagocytosis of cardiac cell debris by neutrophils. IJC Heart Vasculature. 48, 101269(2023).
  16. Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., French, B. A., Rassaf, T. A practical approach to remote ischemic preconditioning and ischemic preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury. J Biol Methods. 3 (4), e57(2016).
  17. Michel, L., et al. Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice. J Vis Exp. (137), e57621(2018).
  18. Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2435-H2443 (2008).
  19. Clasen, L., et al. Cardiac ischemia and reperfusion in mice: a comprehensive hemodynamic, electrocardiographic and electrophysiological characterization. Sci Rep. 13 (1), 5693(2023).
  20. Lang, C. I., et al. Expedient assessment of post-infarct remodeling by native cardiac magnetic resonance imaging in mice. Sci Rep. 11 (1), 11625(2021).
  21. Coolen, B. F., et al. Three-dimensional T1 mapping of the mouse heart using variable flip angle steady-state MR imaging. NMR Biomed. 24 (2), 154-162 (2011).
  22. Zhong, X., et al. Comprehensive cardiovascular magnetic resonance of myocardial mechanics in mice using three-dimensional cine DENSE. J Cardiovasc Magn Reson. 13 (1), 83(2011).
  23. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  25. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nat Commun. 10 (1), 1944(2019).
  26. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy. J Vis Exp. (123), e55450(2017).
  27. Taki, J., et al. 14C-Methionine uptake as a potential marker of inflammatory processes after myocardial ischemia and reperfusion. J Nucl Med. 54 (3), 431-436 (2013).
  28. Michel, L., et al. PD1 deficiency modifies cardiac immunity during baseline conditions and in reperfused acute myocardial infarction. Int J Mol Sci. 23 (14), 7533(2022).
  29. Park, K. C., Gaze, D. C., Collinson, P. O., Marber, M. S. Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease. Cardiovasc Res. 113 (14), 1708-1718 (2017).
  30. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Curr Protoc Neurosci. 81 (2), 28.21-28.28 (2017).
  31. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using light sheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  32. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nat Protoc. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  33. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  34. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  35. Merz, S. F., et al. High-resolution three-dimensional imaging for precise staging in melanoma. Eur J Cancer. 159, 182-193 (2021).
  36. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Front Immunol. 11, 599495(2020).
  37. Pichardo, A. H., et al. Optical tissue clearing to study the intra-pulmonary biodistribution of intravenously delivered mesenchymal stromal cells and their interactions with host lung cells. Int J Mol Sci. 23 (22), 14171(2022).

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