Modèle murin optimisé pour induire un cancer du côlon associé à la colite à l’aide d’azoxyméthane et de sulfate de dextran sodique pour des études d’immunologie et de thérapie tumorales

Résumé

Le cancer du côlon associé à la colite associée à la colite induite par l’azoxyméthane (AOM)/sulfate de dextran sodique (DSS) est une approche établie et rentable pour modéliser les tumeurs autochtones du gros intestin chez la souris. Nous présentons un protocole mis à jour et discutons des considérations essentielles pour l’optimisation de la dose de DSS spécifiques au sexe et de la contribution du microbiome pour la rigueur, la robustesse et la reproductibilité.

Résumé

L’azoxyméthane (AOM, un agent endommageant l’ADN) et le sulfate de dextran sodique (DSS, un agent favorisant la colite) peuvent induire des tumeurs dans le gros intestin des souris à haute pénétrance. Le modèle du cancer du côlon associé à la colite murine (CAC) induit par l’AOM/DSS constitue une référence dans l’étude du cancer du côlon lié à l’inflammation, compte tenu de sa précision dans la récapitulation des caractéristiques cliniques des CAC humains. Les avantages du modèle comprennent son origine et son développement à partir de tissus endogènes, la compétence immunitaire préservant un répertoire complet d’interactions tumeur-immunitaire, l’adaptabilité à de nombreuses souches de souris, la commodité d’une latence de 3 mois et des coûts relativement faibles. Malgré ces avantages, plusieurs défis limitent l’efficacité du protocole. La variabilité de la posologie du DSS et de la pénétrance tumorale d’une étude à l’autre conduit à des observations incohérentes. De plus, les variations du microbiote intestinal contribuent à une variabilité expérimentale accrue, ce qui a un impact négatif sur la puissance statistique. Les différences entre les sexes en réponse à l’AOM/DSS compliquent encore l’interprétation des résultats. De plus, la variabilité du SSD d’un lot à l’autre entrave la reproductibilité des résultats. Il est essentiel de relever ces défis pour améliorer la fiabilité et l’applicabilité de ce modèle dans la recherche préclinique. Pour résoudre ce problème, en utilisant des souris C57BL/6J comme modèle, nous avons affiné le protocole établi avec des stratégies d’optimisation efficaces pour améliorer la reproductibilité et l’harmonisation entre les études. Il s’agit notamment de recommandations pour la titration de la dose de DSS chez les souris mâles et femelles, la mise en œuvre de l’homogénéisation du microbiote avant chaque cycle de DSS pour atténuer l’hétérogénéité de la flore intestinale de la cage à la cage. Ces étapes ont considérablement réduit la variabilité et amélioré la reproductibilité, ce qui a permis d’obtenir une induction robuste de l’ACE. Reconnaissant le rôle central de l’inflammation et des mécanismes immunitaires cellulaires dans le développement des CAC, le protocole décrit également des procédures de traitement tissulaire adaptées à l’isolement de l’ARN ou des protéines et au profilage des cytokines inflammatoires des tumeurs du côlon et des tissus du côlon environnants. In fine, l’utilisation de cette méthode permet d’assurer une production de CAC plus rigoureuse, plus robuste et plus reproductible.

Introduction

Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus fréquent dans le monde et l’une des principales causes de décès liés au cancer ^1,2. Par rapport au CCR sporadique, le cancer colorectal associé à la colite (CAC) survient à la suite de lésions intestinales prolongées et répétées chez les patients atteints de maladie inflammatoire de l’intestin (MICI)^3,4, se caractérise par un grade malin plus élevé et une tendance à la présentation multifocale à un plus jeune âge. En raison de ces facteurs, le CAC nécessite généralement un traitement plus agressif avec des résultats cliniques moins favorables⁵. Bien que le CAC soit considéré comme une entité distincte, du moins en partie en raison du moment unique de l’acquisition des mutations et du rôle démesuré des mécanismes immunitaires inflammatoires et du microbiome, le CAC et le CCR sporadique partagent de nombreuses similitudes en ce qui concerne les paysages génomiques globaux et les caractéristiques pathogéniques. Pour faire progresser notre compréhension du CCR en général et du CAC en particulier, et pour améliorer les stratégies thérapeutiques, des modèles précliniques robustes sont essentiels.

Parmi les différents modèles utilisés pour étudier le CCR, le modèle CAC induit par l’AOM/DSS est le plus largement adopté et est considéré comme l’étalon-or actuel ^6,7. Initié par une forte agression mutagène délivrée par l’OMA, ce modèle repose sur des épisodes répétés de colite induits par le DSS qui imitent étroitement les MICI humaines, telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, qui sont des facteurs de risque bien établis pour le CAC⁸. Le modèle AOM/DSS offre plusieurs avantages clés par rapport aux autres approches in vivo. Contrairement aux méthodes reposant sur l’injection de matériel exogène initiateur de cancer pour établir des tumeurs de flanc ou même orthotopiques, le CAC induit par l’AOM/DSS est autochtone, ce qui signifie que l’initiation tumorale se produit de manière endogène et que la progression du cancer se déroule dans le microenvironnement du tissu natif, reflétant plus étroitement sa biologie et son histoire naturelle. Contrairement aux xénogreffes de lignées cellulaires humaines ou de matériel dérivé de patients qui ne peuvent être cultivées que chez des souris immunodéprimées, elle est immunocompétente, ce qui permet d’étudier les interactions cancer-immunité. Contrairement aux modèles génétiquement modifiés produisant des tumeurs avec des moteurs génétiques spécifiques, il est agnostique aux mutations prédéfinies, ce qui permet une modélisation plus large des voies de signalisation du cancer et des mécanismes d’éducation immunitaire. Enfin, le modèle AOM/DSS peut être facilement adapté à de nombreuses souches différentes de souris, éliminant ainsi le besoin de longs schémas de reproduction, ce qui le rend à la fois rapide et rentable. Cependant, des facteurs tels que le sexe de l’animal, la posologie du DSS et les différences dans le microbiote intestinal peuvent introduire de la variabilité, affectant la reproductibilité et compliquant son application dans la recherche translationnelle.

Nous avons cherché à affiner ce protocole afin d’atténuer l’impact de ces facteurs qui sous-tendent les incohérences dans l’étendue de l’inflammation du côlon et de la tumorigenèse du CAC. Il existe une variabilité significative dans les concentrations de DSS utilisées pour induire une inflammation aiguë, une colite ou une inflammation chronique, et CAC ^9,10. Le DSS est un polymère, et le poids moléculaire moyen peut varier entre les lots et les fabricants, ce qui entraîne une variabilité des résultats expérimentaux. Par conséquent, il est essentiel de tester chaque lot de SSD pour assurer la cohérence entre les études. De plus, l’étendue de l’inflammation induite par le DSS est fortement influencée par le microbiome intestinal, qui peut différer considérablement entre les installations pour souris dans le monde, et même entre différents lieux de détention et colonies au sein d’une même institution^11,12. Cette variabilité de la composition microbienne peut affecter les résultats du modèle et contribuer à des résultats incohérents¹³. Le co-housing d’animaux des différents groupes expérimentaux, dans la mesure du possible, est essentiel pour réduire la variabilité, mais peut ne pas être suffisant pour résoudre ce facteur de confusion, car les communautés microbiennes subissent une dérive stochastique au fil du temps et conduisent à des effets de cage dans les modèles d’inflammation chronique¹⁴. Comme le protocole AOM/DSS implique un traitement à long terme pour maintenir l’inflammation chronique, nous avons mis en œuvre l’homogénéisation du microbiote en mélangeant périodiquement la litière de toutes les cages abritant des animaux traités AOM/DSS. Cette pratique permet d’homogénéiser l’environnement du microbiote, ce qui réduit la variabilité expérimentale. En outre, les observations indiquent que les effets du DSS peuvent varier en fonction du sexe de l’animal^15,16, ce qui peut entraîner des réponses différentielles dans l’inflammation et le développement du cancer. Nous avons affiné le protocole existant en titrant séparément le DSS chez les souris femelles et mâles afin de choisir une dose appropriée de DSS pour les deux sexes, garantissant ainsi des résultats plus uniformes et fournissant des données essentielles pour les calculs de puissance statistique afin de déterminer la taille optimale des échantillons chez les souris mâles et femelles.

Dans l’ensemble, afin d’améliorer la reproductibilité du modèle AOM/DSS, nous décrivons un ensemble normalisé de lignes directrices de protocole qui tiennent compte de ces facteurs de confusion et les atténuent. Nous utilisons des techniques d’homogénéisation du microbiome et décrivons un ajustement précis du dosage du DSS pour obtenir des résultats plus cohérents et reproductibles, améliorant ainsi l’utilité du modèle AOM/DSS et l’harmonisation entre les différentes études. Notre protocole se distingue par la démonstration d’une variabilité réduite à partir de cages homogénéisées par le microbiote et fournit des instructions claires, étape par étape, pour la mise en œuvre de ces pratiques de reproductibilité. Par conséquent, la plus faible variabilité au sein du groupe provoquée par ces améliorations du protocole entraîne une réduction de la taille des échantillons nécessaire pour atteindre la puissance statistique souhaitée dans la détection des différences entre les groupes expérimentaux. Ce protocole optimisé est conçu pour les chercheurs qui souhaitent adapter le modèle AOM/DSS à leurs propres modèles de souris et conceptions expérimentales, indépendamment de la souche ou du sexe, pour étudier les mécanismes de tumorigenèse, les cibles thérapeutiques ou explorer la dynamique des cellules immunitaires.

Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux doivent être effectuées conformément à un protocole approuvé par l’établissement afin d’assurer une manipulation sans cruauté et le respect des normes éthiques. Les études décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride (IACUC).

1. Optimisation du dosage du DSS

1. Obtenez des souris de l’âge, de la souche et de la source à utiliser dans l’expérience principale, avec une répartition égale de mâles et de femelles. Étiquetez chaque souris à l’aide d’un poinçon d’oreille, d’une marque de queue ou d’une autre méthode approuvée pour un suivi individuel. Mesurer et consigner le poids corporel initial de chaque animal.
   REMARQUE : Les souris mâles doivent être relogées avant le sevrage et ne doivent pas être redistribuées entre les cages pour minimiser les combats.
2. Si vous utilisez l’abreuvement automatique, une semaine avant le début de l’expérience, mettez les animaux dans des bouteilles d’eau et bloquez simultanément les buses de la cage (tubes d’aspiration en métal dans la cage) avec des bouchons stériles.
   REMARQUE : Assurez-vous que toute modification de l’alimentation en eau, telle que le blocage des buses d’eau potable automatisées, est approuvée par l’IACUC ou l’organisme de réglementation approprié supervisant l’utilisation sans cruauté des animaux. Les cages pour animaux peuvent nécessiter des contrôles quotidiens pour assurer un accès ininterrompu à l’eau potable.
3. Préparez la solution de DSS en dissolvant le DSS dans de l’eau potable stérile autoclavée à des concentrations variables de 1,5 % à 5 % (p/v), à l’aide d’une barre d’agitation magnétique et d’une plaque d’agitation. Attendez 30 min à température ambiante pour que la poudre DSS se dissolve complètement dans l’eau. Préparez l’eau DSS fraîchement chaque semaine et conservez-la à 4 °C pendant une semaine maximum.
4. Remplissez deux tubes coniques de 50 mL avec de l’eau DSS à chaque concentration (un pour les mâles, un pour les femelles) et fixez solidement une buse stérile autoclavée pour éviter les fuites.
5. Administrer de l’eau DSS à chaque concentration à des souris femelles et mâles, avec 3 souris dans chaque cage recevant la même concentration. Utilisez de l’eau potable stérile sans DSS comme témoin négatif. Remplacez l’eau DSS tous les deux jours.
6. Administrer l’eau DSS pendant 7 jours. Notez quotidiennement le poids corporel de chaque souris.
7. Le jour 8, remettez tous les animaux à boire normalement.
8. Le jour 8, évaluer la gravité de la diarrhée en fonction de la consistance des selles à l’aide d’un système de notation normalisé tel que décrit¹⁷ et enregistrer les scores. Évaluez « 1 » comme une boule de selle molle mais encore formée, « 2 » comme une boule de selle très molle et « 3 » comme une diarrhée.
9. Le jour 8, prélevez 2 ou 3 granules de selles fraîches et évaluez la présence de sang occulte (voir le tableau des matériaux). Noter la présence ou l’absence de sang dans l’échantillon.
10. Évaluer la présence d’un saignement intestinal sur la base d’une combinaison de deux critères de score, la consistance des selles (0-3) et la présence de sang dans les selles (0-3), pour un score total allant de 0 à 6.
11. Du jour 9 au jour 12, notez quotidiennement le poids corporel de chaque souris et surveillez de près les animaux traités par le DSS pour détecter une perte de poids corporelle significative et une diarrhée sévère. Euthanasier rapidement les animaux atteignant ou dépassant les paramètres cruciaux par asphyxie au dioxyde de carbone (CO₂) ou par toute autre méthode appropriée, conformément au protocole d’utilisation des animaux approuvé et aux lignes directrices éthiques établies.
12. Du jour 13 au jour 18, continuez à surveiller les animaux et notez quotidiennement le poids corporel de chaque souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie aux niveaux d’avant l’expérience.
13. Déterminez la concentration optimale de DSS, c’est-à-dire celle qui entraîne une perte de poids corporel d’environ 20 % accompagnée de selles molles mais encore formées. La dose optimale de DSS peut varier entre les mâles et les femelles, les souches de souris, les âges, les lots de DSS et les installations pour animaux.

2. Intégration au CAC

1. Jour 0-6 : Traitement de l’OMA Jour 7-28 : 1er cycle de traitement DSS
   1. Préparation de la pâte d’AOM : Dissoudre la poudre d’AOM dans une solution saline stérile pour obtenir une concentration de base de 10 mg/mL. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,45 μm, répartir 1 mL d’aliquotes dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et conserver à -80 °C jusqu’à un an.
      REMARQUE : L’AOM est un cancérogène volatil et doit être manipulé avec prudence sous une cagoule de biosécurité avec un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, conformément aux recommandations de sécurité du fabricant. Les MAA et toutes les matières contaminées par des MOA doivent être éliminés conformément aux protocoles d’élimination des déchets chimiques dangereux de l’établissement. Il incombe à l’enquêteur d’obtenir à l’avance les approbations nécessaires en matière d’environnement, de santé et de sécurité.
   2. Si vous utilisez l’abreuvement automatisé en cage, 1 semaine avant le début de l’expérience, bloquez la buse d’eau potable automatisée et mettez les animaux dans des bouteilles d’eau pour l’acclimatation, comme à l’étape 1.2.
   3. Le jour 0, pesez et enregistrez le poids corporel de chaque souris pour calculer la quantité totale requise d’AOM. Calculez ensuite le volume total d’AOM (concentration finale de travail de 1 mg/mL) en fonction du poids de chaque animal pour obtenir une dose de 10 mg/kg, par exemple 200 μL pour une souris de 20 g.
   4. Décongeler le nombre requis de nouvelles aliquotes de 10 mg/mL d’AOM sur de la glace avant chaque utilisation. Diluer chaque aliquote de 1 mL d’OMA avec 9 mL de solution saline stérile pour obtenir une concentration de travail de 1 mg/mL.
   5. Administrer de l’OMA à des souris par injection intrapéritonéale. Effectuez cette procédure à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité tout en portant un EPI approprié tel que des gants doubles et un masque N95 pour une protection optimale.
      ATTENTION : Jetez toute solution AOM restante conformément aux exigences d’élimination des déchets chimiques dangereux.
   6. Le jour 3, transférez les animaux traités avec des MOA dans des cages propres. Portez l’EPI approprié lorsque vous manipulez des cages contaminées par des MOA et d’autres matériaux de protection.
      ATTENTION : Jetez la litière de cage souillée et tout reste de nourriture conformément aux procédures d’élimination des déchets chimiques dangereux approuvées par l’établissement.
      REMARQUE : L’AOM et ses métabolites sont complètement excrétés 72 h après l’administration¹⁸, après quoi la litière de cage souillée peut être éliminée.
   7. Le jour 7, effectuez une homogénéisation du microbiote intestinal pour minimiser la variabilité de la cage à la cage. Pour ce faire, prélevez 25 % de la litière de chaque cage, mélangez soigneusement et redistribuez-la dans chaque cage.
      REMARQUE : Évitez de changer de cage pendant la semaine de traitement DSS et pendant les cinq jours suivants. Coordonner avec le service de changement de cage d’élevage de l’établissement, au besoin.
   8. Amorcer l’induction de la colite en fournissant du DSS dans l’eau potable à l’aide de tubes coniques de 50 mL équipés de buses appropriées. Vérifiez quotidiennement les souris pour confirmer que les animaux ont un accès illimité à l’eau du DSS. Remplacez l’eau DSS tous les deux jours. Notez quotidiennement le poids corporel de chaque souris.
   9. Le jour 14, remplacez l’eau DSS par des bouteilles d’eau potable normales. Continuez de surveiller de près la douleur et la détresse chez les animaux.
   10. Les jours 14 à 19, pesez chaque souris quotidiennement. Euthanasier les animaux qui perdent plus de 25 % de leur poids corporel ou si un animal atteint l’un des critères d’évaluation sans cruauté décrits dans le protocole approuvé de soins et d’utilisation des animaux. De plus, surveillez et enregistrez tout cas de saignement rectal.
2. Jour 7-28 : 1 er cycle de traitement DSS
   1. Le jour 7, effectuez une homogénéisation du microbiote intestinal pour minimiser la variabilité de la cage à la cage. Pour ce faire, prélevez 25 % de la litière de chaque cage, mélangez soigneusement et redistribuez-la dans chaque cage.
      REMARQUE : Évitez de changer de cage pendant la semaine de traitement DSS et pendant les cinq jours suivants. Coordonner avec le service de changement de cage d’élevage de l’établissement, au besoin.
   2. Amorcer l’induction de la colite en fournissant du DSS dans l’eau potable à l’aide de tubes coniques de 50 mL équipés de buses appropriées. Vérifiez quotidiennement les souris pour confirmer que les animaux ont un accès illimité à l’eau du DSS. Remplacez l’eau DSS tous les deux jours. Notez quotidiennement le poids corporel de chaque souris.
   3. Le jour 14, remplacez l’eau DSS par des bouteilles d’eau potable normales. Continuez de surveiller de près la douleur et la détresse chez les animaux.
   4. Les jours 14 à 19, pesez chaque souris quotidiennement. Euthanasier les animaux qui perdent plus de 25 % de leur poids corporel ou si un animal atteint l’un des critères d’évaluation sans cruauté décrits dans le protocole approuvé de soins et d’utilisation des animaux. De plus, surveillez et enregistrez tout cas de saignement rectal.
3. Jour 29-49 : 2 ^ème cycle de traitement par SSD
   1. Répéter l’homogénéisation du microbiote en même temps que l’administration du DSS, en suivant les mêmes procédures qu’aux étapes 2.2.1 à 2.2.4. Facultatif : Après le deuxième et/ou le troisième cycle DSS, effectuez une coloscopie comme décrit précédemment¹⁹.
4. Jour 50-70 : 3^ème cycle de traitement DSS
   1. Répéter l’homogénéisation du microbiote en même temps que l’administration du DSS, en suivant les mêmes procédures qu’aux étapes 2.2.1 à 2.2.4. Comme les souris ont tendance à perdre le plus de poids trois jours après le troisième cycle de DSS, surveillez de près tous les animaux pour détecter une perte de poids corporelle excessive ou des signes de saignement rectal pendant cette période et fournissez de la nourriture humide pour des soins de soutien si nécessaire.

3. Évaluation de la gravité de la colite et de la pathologie macroscopique de la CAC

1. Le jour 70, prélevez 2 à 3 boulettes fécales fraîches de chaque souris pour détecter la présence de sang occulte et/ou de marqueurs inflammatoires tels que la lipocaline-2²⁰ afin d’évaluer la gravité de la colite. Utilisez les réactifs et les trousses appropriés (voir la liste des matériaux et de l’équipement) et suivez les instructions du fabricant pour effectuer les essais, brièvement décrites ci-dessous.
2. Pour préparer des échantillons fécaux en vue de l’évaluation des taux de lipocaline-2, marqueur de l’inflammation, placez des pastilles de selles fraîches dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Dissoudre les pastilles dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile à l’aide d’un mélangeur vortex jusqu’à l’obtention d’une solution uniforme. Centrifuger la solution à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant peut être utilisé immédiatement pour la lipocaline-2 ELISA ou stocké à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
3. Effectuez l’ELISA lipocaline-2 de souris selon les instructions du fabricant du kit. Effectuer des expériences pilotes de dilution en série pour déterminer la dilution optimale des échantillons fécaux par rapport aux normes.
   REMARQUE : On s’attend à ce que les taux de lipocaline-2 augmentent d’au moins 1000 fois chez les souris traitées au DSS par rapport aux animaux témoins traités à l’eau²⁰.
4. Évaluer la gravité de la colite à l’aide d’un système de notation de la diarrhée¹⁷ comme décrit aux étapes 1.8 à 1.10.
5. Au 70e jour, euthanasier les animaux par asphyxie au CO₂ ou en utilisant toute autre méthode sans cruauté approuvée.
6. Vaporisez la région abdominale de chaque animal avec de l’éthanol à 70 % pour minimiser la contamination lors des étapes suivantes.
7. Utilisez une pince chirurgicale fine pour soulever la peau et la couche péritonéale. Faites une incision horizontale avec des ciseaux pour exposer la cavité abdominale.
8. Tirez l’intestin grêle vers l’extérieur et identifiez le caecum grêle. Soulevez doucement le cæcum et le côlon à l’aide d’une pince. Disséquez soigneusement le côlon en coupant le mésentère et le système vasculaire associé à l’aide de ciseaux, en évitant de percer ou de couper à travers le côlon.
9. Coupez l’os pelvien et la peau entourant la région rectale-anale pour exposer tout le côlon distal. Il est important de disséquer tout le côlon avec la partie distale intacte, car la plupart des tumeurs se produisent généralement dans cette région.
10. Placez le côlon disséqué sur une bande propre de papier filtre, en le redressant doucement.
11. Mesurez la longueur des deux-points à l’aide d’une règle et documentez-la avec une photo. Incluez la règle dans la photo pour l’échelle.
12. Nettoyez les plaques de Peyer à l’extérieur du côlon, en prenant soin de ne pas perforer le tissu.
13. Rincer le côlon dans du PBS stérile et froid.
14. Fixez une pointe de micropipette de 200 μL (sans filtre) sur une seringue de 3 mL à l’aide d’un film de paraffine. Utilisez cette configuration pour remplir la seringue de PBS stérile, insérez la pointe de la pipette dans la lumière du côlon et rincez doucement le contenu du côlon 2 à 3 fois, assurant ainsi l’élimination complète des granules de selles.
15. Étirez doucement le côlon sur une bande de papier filtre propre et pré-humidifiée. Ouvrez le côlon longitudinalement et posez-le à plat sur le papier filtre.
16. Identifiez les tumeurs plus grandes, qui se présentent généralement sous la forme de bulles proéminentes dépassant de la paroi du côlon avec un aspect rouge enflammé.
17. Pour les tumeurs plus petites, faites preuve d’une prudence supplémentaire lors de l’identification. Utilisez une boucle d’ensemencement bactérien stérile pour sonder doucement la surface du côlon à la recherche d’irrégularités ou de bosses. Confirmez que les bosses détectées ne sont pas des restes de ganglions lymphatiques ou de vaisseaux sanguins situés à l’extérieur de la paroi du côlon.
18. Utilisez des pieds à coulisse numériques pour mesurer la largeur et la longueur de chaque tumeur.
19. Enregistrez le nombre de tumeurs ainsi que la taille et l’emplacement de chaque tumeur sur une carte du côlon pré-imprimée.

4. Évaluation histologique

1. Utilisez deux paires de pinces à pointe fine pour saisir les deux extrémités latérales du côlon distal. Roulez le côlon de l’extrémité distale à l’extrémité proximale en forme de rouleau suisse comme décrit ailleurs²¹. Assurez-vous que l’extrémité distale est au centre du rouleau et que l’extrémité proximale forme la couche la plus externe.
2. Fixez chaque côlon roulé à l’aide d’une aiguille 271/2-G.
3. Placez chaque côlon enveloppé dans une cassette de tissu étiquetée de manière appropriée.
4. Immergez les cassettes de tissus contenant des côlons roulés en Suisse dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS stérile. Laissez les tissus rester dans le fixateur pendant 24 h.
5. Après 24 h, transférez les tissus dans de l’éthanol à 70 %. Les tissus peuvent être conservés dans de l’éthanol à 70 % à 4 °C jusqu’à trois mois.
6. Le Swiss-roll peut être utilisé pour de multiples examens histopathologiques, y compris la coloration conventionnelle à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E), l’immunohistochimie et l’immunofluorescence.

5. Récolte de tissus pour l’isolement des protéines et de l’ARN des tumeurs et du côlon environnant

1. Travailler sur de la glace et utiliser des tubes et des réactifs pré-refroidis pour préserver l’intégrité du matériel biologique.
2. Après l’évaluation de la tumeur, disséquez les tumeurs et collectez-les dans des tubes pré-réfrigérés et pré-étiquetés avec un tampon approprié (voir ci-dessous) sur de la glace. Selon la conception de l’expérience, regroupez toutes les tumeurs du même animal ou traitez-les individuellement. Si vous le souhaitez, prélevez de la même manière des morceaux de ~1 cm de tissu du côlon non tumoral environnant.
3. Isolement des protéines
   1. Ajouter 0,5 mL de billes de verre de broyage de 800 μm et 400 μL de tampon de lyse (1 % de NP-40 dans 150 mM de NaCl avec 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) et 1 % de cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase dans chaque tube d’homogénéisation tissulaire et transférer le tissu du côlon/tumeur dans chaque tube.
   2. Homogénéiser le tissu du côlon/tumeur à l’aide d’un homogénéisateur de tissu à base de billes à 6 M/S pendant 30 s, répéter deux fois pour une homogénéisation complète.
      REMARQUE : Placez les tubes sur de la glace entre les cycles pour éviter la surchauffe de l’échantillon due à l’homogénéisation mécanique.
   3. Après homogénéisation, aspirer 150 μL de lysat (surnageant) et transférer dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 mL.
   4. Essorez le lysat à 10 000 g à 4 °C pour granuler toute matière insoluble. Transférez le surnageant dans un tube propre si vous le souhaitez.
   5. Quantifier la concentration totale en protéines à l’aide d’un dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) ou d’une autre méthode appropriée.
   6. Si vous le souhaitez, ajustez la concentration totale en protéines à 4 mg/mL pour chaque échantillon avec le même tampon de lyse.
   7. Utilisez immédiatement les lysats de protéines pour des tests en aval tels que l’immunoblot ou l’analyse de cytokines, ou stockez-les à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
4. Purification de l’ARN :
   1. Après la dissection, placez le côlon/les tumeurs dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et immergez-les dans 200 μL de réactif de préservation de l’ARN approprié.
      REMARQUE : Point de pause : le tissu frais du côlon/tumeur peut être congelé dans de l’azote liquide et stocké à -80°C pour un traitement ultérieur
   2. Décongeler le côlon/tissu tumoral sur de la glace.
   3. Transférez le côlon/la tumeur dans un tube d’homogénéisation tissulaire contenant 500 μL de tampon de lyse approprié pour l’isolement de l’ARN et 200 μL de billes de verre broyées.
   4. Homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur de tissus à base de billes à 6 M/s pendant 30 s trois fois, avec une pause de deux minutes entre chaque cycle.
      REMARQUE : Transférez le tube sur de la glace entre les cycles pour éviter la dégradation de l’ARN due à la surchauffe lors de l’homogénéisation mécanique.
   5. Transférez 300 μL de lysat dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
   6. Isolez l’ARN total en utilisant la procédure de purification de l’ARN appropriée, au besoin. Mesurer la concentration, la pureté et la qualité/intégrité de l’ARN, selon ce qui convient à l’utilisation en aval.

Résultats

Nous avons effectué une optimisation de dose DSS pour nos conditions expérimentales. Le dosage du DSS doit être recalibré pour chaque animalerie, souche de souris, conception d’étude et lot DSS. Pour cette étude, des souris C57BL/6J ont été logées dans un vivarium spécifique exempt d’agents pathogènes dans des cages ventilées avec un régime alimentaire standard à volonté irradié à 18 % de protéines pour rongeurs. Les souris mâles et femelles commencent à perdre du poids à partir du jour 5 après avoir été placées sur l’eau du DSS, atteignant leur poids le plus bas trois jours après le retrait du DSS (Figure 1A,C). Le jour de la perte de poids la plus importante, les souris mâles ont montré une perte de poids d’environ 15 %, tandis que les souris femelles ont montré une perte de poids d’environ 20 % (figures 1B et D). Sur la base de ces résultats, nous avons déterminé que la dose optimale pour nos conditions expérimentales spécifiques était de 3,0 % pour les femelles et de 3,25 % pour les mâles. Le calendrier de traitement de l’AOM/DSS est décrit à la figure 2A, l’homogénéisation du microbiome se produisant au début de chaque cycle de traitement DSS jusqu’à la fin de l’expérience afin d’atténuer les effets de cage et la variabilité. La dynamique typique de la perte de poids et de la récupération chez l’animal pendant toute la durée de l’expérience est illustrée à la figure 2B. Les animaux retrouvent complètement leur poids corporel d’origine dans les deux semaines suivant l’arrêt de l’administration de DSS. Un modèle de colite DSS bien calibré donne des granules de selles molles mais toujours formées au lieu de la diarrhée (score de consistance des selles 1-2), avec une détection occasionnelle de sang occulte dans les selles indiquant une hémorragie subclinique et quelques cas de sang visible dans les selles (score de présence de sang 1-2)¹⁷. Pour évaluer davantage la gravité de la colite, des échantillons fécaux ont été prélevés pour analyser les taux de lipocaline-2, un marqueur inflammatoire. La présence de sang occulte n’a pas été détectée chez les souris recevant régulièrement de l’eau potable tout au long de l’expérience, contrairement aux animaux traités au DSS (Figure 2C). De manière constante, les taux de lipocaline-2 étaient environ 1 000 fois plus élevés chez les souris traitées par l’AOM/DSS que chez les souris ayant reçu de l’AOM/de l’eau seulement (figure 2D).

À la fin, nous avons disséqué les côlons et compté les tumeurs à l’aide d’une carte d’enregistrement tumoral (Figure 3A). La colite DSS se traduit par une longueur de côlon nettement plus courte, contrairement aux témoins AOM/eau uniquement (Figure 3B). De plus, les animaux traités avec l’AOM/DSS développent des tumeurs visibles du côlon, dont la plupart se forment à l’extrémité distale (Figure 3C). L’examen histologique des coupes du côlon marquées par H&E a révélé une érosion significative des cellules épithéliales, une infiltration immunitaire et une ulcération chez les souris AOM/DSS (Figure 4A). La sévérité de l’histopathologie du côlon peut être quantifiée à l’aide de systèmes de notation établis pour les CAC murins induits par le DSS, sur la base de quatre paramètres (Figure 4B) : l’infiltration immunitaire et l’œdème (0-3), l’ulcération (0-3), la morphologie épithéliale du côlon (0-4) et les néoplasmes (0-4)22,23,24. Les résultats de ces évaluations, appliqués aux exemples d’histologie de la figure 4A, sont présentés à la figure 4C. La prolifération épithéliale du côlon a été évaluée par analyse immunohistochimique à l’aide de la coloration Ki67, démontrant que le traitement par DSS favorise la prolifération des cellules épithéliales du côlon. De plus, les coupes du côlon peuvent être utilisées pour la coloration immunofluorescente de divers marqueurs, tels que le marqueur d’angiogenèse CD31 (Figure 4D,E).

Nous avons ensuite évalué les effets de l’homogénéisation du microbiote sur des critères expérimentaux tels que l’ampleur de l’inflammation colique, la perte de poids corporel et la charge tumorale cumulative chez chaque animal. Un groupe de souris a été logé dans des cages qui ont été soumises à un mélange et à une redistribution de litière souillée le jour 0 pour obtenir une homogénéisation du microbiote, aux côtés d’animaux témoins dans des cages où cette manipulation a été omise. Les animaux des deux groupes ont reçu 2,5 % d’eau DSS pendant 7 jours. Bien que les niveaux moyens du marqueur inflammatoire lipocaline-2 dans les matières fécales par cage au jour 8 ne différaient pas significativement entre les groupes (test t de Welch), nous avons observé une variabilité significativement plus faible entre les points de données dans les cages qui ont subi une homogénéisation du microbiote (Figure 5A, test F de Welch pour comparer les variances, p<0,0001). De manière constante, au jour 8, tous les animaux présentaient une perte de poids corporelle similaire par rapport au jour de référence. Cependant, les souris du groupe d’homogénéisation du microbiote ont montré moins de variabilité dans la perte de poids corporel par rapport au groupe témoin (Figure 5B). De plus, dans un protocole d’induction CAC de 10 semaines (Figure 2A) avec (homogénéisation du microbiote) et sans mélange (témoin) de litière de cage avant chaque cycle de DSS, la charge tumorale cumulée par souris était plus cohérente dans le groupe homogénéisé du microbiote par rapport aux témoins qui étaient significativement plus variables (Figure 5C). Dans l’ensemble, ces données fournissent des preuves solides que l’homogénéisation du microbiote améliore fortement la robustesse et la reproductibilité du modèle AOM/DSS.

Graphique 1. Titrage de la dose DSS chez les souris mâles et femelles. (A-D) Pourcentage de variation du poids corporel par rapport au jour 0 chez les souris de type sauvage mâles (A, B) et femelles (C, D) C57BL/6J âgées de 14 semaines maintenues dans de l’eau avec des concentrations de DSS indiquées (1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 % pour les mâles et 2 %, 3 %, 4 % pour les femelles). (A, C) Les animaux ont reçu du DSS pendant 7 jours et ont été surveillés pour une perte de poids corporel jusqu’à 12 jours. B et D montrent une perte de poids corporel chez les souris mâles au jour 8 (B) et les souris femelles au jour 9 (D) dès le début du traitement par DSS. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM ; n=3 dans A & B, n=4 dans C & D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 2. Calendrier et surveillance des CAC induits par l’AOM/DSS. (A) Chronologie expérimentale des CAC induits par l’AOM/DSS. (B) Poids corporel par rapport au jour 0 chez des souris sauvages C57BL/6J femelles expérimentales traitées à l’AOM/DSS (rouge) ou témoins (AOM seulement, pas de DSS, noires). Tous les animaux ont reçu une dose d’OMA (10 mg/kg) et ont été répartis aléatoirement pour recevoir soit trois cycles de DSS à 3 % (rouge) ou d’eau de boisson normale (témoin, noir) pour un total de 70 jours. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM, n=2 et 11. (C) Test d’hémoccultisme fécal sur des souris femelles témoins (AOM uniquement) ou traitées par DSS (AOM et 1,5 % DSS). (D) Taux de lipocaline-2 fécale chez 6 souris femelles témoins (OMA uniquement, noires) ou 35 souris femelles traitées (OMA et 1,5 % de DSS, rouge) au jour 70. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 3. Évaluation macroscopique des côlons. (A) Exemple d’une carte d’enregistrement tumoral. (B) Images représentatives du côlon de souris femelles témoins (AOM uniquement) ou traitées par DSS (AOM et 1,5 % DSS) au jour 70. Le raccourcissement de la longueur du côlon indique une inflammation plus importante chez les animaux traités au DSS. Barre - 5 mm ; , p = 0,002, test de somme des rangs de Mann-Whitney ; n=12 et 30. (C) Des images représentatives de pathologie macroscopique de côlons atteints de tumeurs au jour 70 de souris femelles traitées avec de l’OMA et 3 % de DSS (les tumeurs sont encerclées et marquées de triangles noirs). Barre - 5 mm. Appel - vue agrandie des régions distales du côlon avec des tumeurs ; barre - 1 mm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 4. Évaluation histologique CAC. (A) Des sections représentatives de côlons roulés en Suisse de souris traitées à l’AOM/DSS et de souris témoins (AOM uniquement) au jour 70 avec des régions distales élargies de 3 animaux affichés à droite. Les deux-points de contrôle montrent une organisation intacte de la crypte du côlon. Les côlons des souris traitées à l’AOM/DSS sont caractérisés par un épaississement sous-muqueux (pointes de flèches), une infiltration immunitaire (flèches), une perturbation ou une perte de l’architecture de la crypte (étoile), une érosion de la couche épithéliale, une hyperplasie épithéliale ou un épithélium dysplasique (cercles) avec formation d’adénomes et d’adénocarcinomes (délimités par une ligne pointillée). Bar - 500 μm. (B) Système de notation histopathologique utilisé pour évaluer la sévérité du phénotype CAC. (C) Exemple de scores histologiques du côlon de souris traitées par l’OMA uniquement ou par l’OMA/DSS illustré en A. (D) Coloration immunohistochimique représentative du marqueur de prolifération Ki67 dans les côlons roulés en Suisse d’animaux traités à l’AOM après 1 ou 3 cycles de DSS. Les cellules proliférantes Ki67-positives (en marron) se localisent au fond des cryptes du côlon mais se propagent vers le haut et envahissent l’intérieur des cryptes avec l’initiation du CAC et une pathologie plus avancée. Bar - 100 μm. (E). Coloration immunofluorescente représentative évaluant la vascularisation sur la base du marqueur endothélial CD31 (rouge) et contre-colorée avec du DAPI pour visualiser les noyaux (bleu) dans les coupes du côlon de souris traitées par AOM/DSS. Barre - 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 5. L’homogénéisation du microbiote réduit la variabilité de l’inflammation du côlon et de la charge tumorale CAC. (A) Taux moyens de lipocaline-2 fécale chez les souris traitées avec un DSS à 2,5 % le jour 8. Une analyse statistique a été effectuée à l’aide du test t de Welch pour comparer les taux moyens de lipocaline-2 fécale entre les deux groupes (p = 0,137, n = 6 et 12 cages). De plus, un test F sur les variances a été effectué, donnant une valeur p de 0,0001, indiquant des différences significatives de variance entre les deux groupes. (B) Perte de poids corporel moyenne chez les animaux traités avec l’AOM/DSS recevant de l’eau DSS le jour 8. Alors que la perte moyenne de poids corporel entre les deux groupes n’est pas significativement différente (test t de Welch, p = 0,194, n = 6 et 12), la variance au sein des groupes est significativement différente (test F, p = 0,027). (C) Charge tumorale par souris après 10 semaines de traitement AOM/DSS. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide du test t de Welch pour évaluer les différences de charge tumorale moyenne entre les groupes (p = 0,211, n = 8 et 18) et d’un test F pour évaluer la différence entre les variances (p = 0,013). (A-C) Les graphiques en violon bleu représentent le groupe qui a subi l’homogénéisation du microbiote, tandis que les graphiques en violon vert représentent le groupe témoin (sans homogénéisation du microbiote), ns - non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole AOM/DSS a été introduit pour la première fois en 1996 par Okayasu et ^al.25 et a depuis été reconnu comme un excellent modèle pour imiter fidèlement l’initiation et la progression du cancer du côlon des tissus normaux aux modifications adénomateuses et finalement au carcinome, comme l’ont démontré Suzuki et al. en 2006²⁶, en particulier dans le contexte de l’inflammation du côlon. Des études ultérieures ont évalué les effets de l’AOM et de l’AOM/DSS sur différentes souches de souris, ainsi que l’impact de différentes durées de traitement sur le phénotype tumoral et la pénétrance 26,27,28. En 2018, Christopher Williams et son groupe ont publié une mise à jour du protocole²⁹ qui a jeté les bases cruciales pour le développement de cette méthodologie. Des avancées récentes ont démontré l’utilité du modèle AOM/DSS pour l’étude de l’immunité muqueuse en intégrant des méthodes d’isolement des infiltrats immunitaires intestinaux et d’immunophénotypage par cytométrie en flux³⁰.

L’une des principales forces du protocole AOM/DSS réside dans sa facilité d’adaptation à pratiquement toutes les souches de souris, ce qui permet d’étudier les effets de différents antécédents génétiques. Ainsi, Suzuki et al. ont comparé la susceptibilité à la carcinogenèse du côlon induite par l’AOM/DSS chez quatre souches de souris différentes en utilisant la pénétrance de l’adénome du côlon comme lecture, avec les résultats suivants : BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN²⁶. Des études supplémentaires ont révélé que les souris FVB/N développent plus facilement des tumeurs du côlon après un traitement AOM répété par rapport aux souches C57BL/6J et 129/SvJ²⁷. Notamment, le développement d’un adénocarcinome du côlon bien différencié avec une pénétrance de près de 100 % a été signalé chez des souris FVB/N dans le cadre d’un protocole d’induction de 10 semaines de CAC AOM/DSS³¹. Ces résultats suggèrent collectivement que différentes souches de souris peuvent ne pas être également sensibles au traitement par AOM/DSS, ce qui contribue aux variations de la tumorigenèse et souligne la nécessité d’un ensemble cohérent de lignes directrices pour l’harmonisation et la reproductibilité du protocole AOM/DSS entre les souches de souris, les installations d’hébergement et d’autres variables. Parmi ceux-ci, une variabilité significative du microbiome intestinal entrave la reproductibilité des études axées sur l’inflammation et la pénétrance tumorale ^9,10. Plus précisément, la composition du microbiome intestinal, y compris les espèces Duncaniella muricolitica et Alistipes okayasuensis, peut avoir un impact démesuré sur la gravité de la colite DSS¹³. Une autre étude a mis en évidence l’importance de la composition du microbiote dans l’induction des CAC en démontrant que les souris déficientes en NLRP3 présentaient un phénotype de colite exacerbé caractérisé par une présence accrue des embranchements bactériens Bacteroidetes (en particulier Prevotellaceae) et TM7¹⁰.

Malgré la popularité de la méthode, les protocoles AOM/DSS existants n’ont pas abordé le problème important de la grande variabilité observée entre les animaux au sein des groupes expérimentaux³². Pour relever ce défi, nous avons formulé un ensemble de recommandations pour l’optimisation et l’harmonisation des protocoles par la mise en œuvre du titrage DSS (en tenant compte du sexe animal) et de l’homogénéisation du microbiote. Notre approche vise à réduire la variabilité et à améliorer la reproductibilité du modèle AOM/DSS à travers les souches animales, les conceptions expérimentales et les critères d’évaluation. Bien que nous ne puissions pas fournir de recommandations précises concernant la taille des échantillons, le nombre de répétitions expérimentales sera guidé par la conception de l’étude et les tailles d’effet prévues pour chaque expérience. La variabilité plus faible au sein du groupe obtenue par ces raffinements nécessite moins d’animaux dans chaque condition pour obtenir la même puissance statistique dans la détection de ces différences. Nous prévoyons que ces améliorations favoriseront davantage l’utilisation éthique des animaux, la gestion responsable des fonds de recherche et la réduction de la main-d’œuvre, ce qui entraînera une efficacité accrue.

Le modèle AOM/DSS a une valeur translationnelle significative dans l’étude du cancer colorectal associé à la colite humaine. Étant donné les défis que pose la modélisation du CCR humain en raison de son étiologie complexe, il est important de souligner que, bien que le modèle AOM/DSS puisse fournir des informations sur la pathogenèse du CCR sporadique, il est le plus approprié pour les études sur la malignité associée à l’inflammation. De plus, le cancer induit par l’AOM/DSS a une faible incidence de métastases^33,34 et est donc inapproprié pour l’étude de la propagation métastatique. Malgré ces limites, le modèle AOM/DSS est hautement pénétrant, fiable, démontre une histopathologie pertinente pour l’homme et imite avec précision la progression de la maladie, de l’inflammation à la dysplasie et à l’adénocarcinome, tout en restant rentable. Dans ce protocole, nous fournissons des recommandations pour générer des résultats reproductibles et minimiser les facteurs de confusion basés sur les flux de travail existants ^8,35.

L’identification de la dose optimale de DSS par le biais d’expériences pilotes dose-réponse, en tenant compte du sexe animal en tant que variable biologique 16,36,37, est la première étape critique vers l’établissement d’un protocole AOM/DSS robuste (Figure 1). Nous avons constaté qu’un traitement avec 3 % de DSS pendant 7 jours a entraîné une diminution plus significative du poids corporel chez les femelles (~20 %) que chez les mâles (~15 %) (Figure 1B,D). Cependant, les souris mâles peuvent être plus, moins ou aussi sensibles au DSS que les femelles. Cela peut être attribuable à des souches de souris différentes et à des variations dans la composition du microbiome intestinal d’une animalerie à l’autre, ce qui nécessite un réajustement de la concentration de SSD adapté à chaque série spécifique d’expériences. La concentration optimale de DSS est un compromis entre la maximisation de l’inflammation colique et l’induction tumorale sans dépasser la toxicité tolérable. D’après notre expérience, cet équilibre est très probablement atteint à des doses de DSS, ce qui entraîne une perte de poids corporel d’environ 20 % après le premier cycle. Les animaux ont tendance à perdre moins de poids dans le deuxième cycle de traitement, mais une réduction plus importante du poids corporel est généralement observée dans le troisième cycle de DSS, potentiellement en raison de la formation de tumeurs dans le côlon. Par conséquent, une perte de poids corporel de 25 % peut être adoptée comme critère d’évaluation sans cruauté pour les protocoles institutionnels d’utilisation des animaux. De plus, une colite du DSS bien calibrée se traduit par des granules de selles molles mais toujours formées plutôt que par de la diarrhée et un test hémassologique parfois positif, mais peu de cas de traces de sang visibles dans les selles, les animaux devant se rétablir complètement dans les deux semaines suivant l’arrêt de l’administration du DSS.

Le DSS est un polymère dont la masse moléculaire varie de 36 000 à 50 000 Da. En raison de la variabilité d’un lot à l’autre dans la fabrication du DSS, il est essentiel d’effectuer des expériences de réétalonnage de la dose du DSS pour chaque nouveau lot du produit. Par souci d’uniformité, il est pratique d’estimer la quantité totale de SSD nécessaire pour que l’ensemble de l’étude soit achetée à partir du même lot. De plus, ce protocole décrit également les étapes à suivre pour normaliser la composition du microbiote dans l’ensemble de la cohorte expérimentale de souris pendant l’induction du CAC, atténuant ainsi les effets potentiels de la cage pour réduire la variabilité. Par mesure de précaution supplémentaire pour minimiser les effets de cage, il est recommandé que les animaux de différents groupes expérimentaux soient cologés dans la mesure du possible. En fonction des objectifs expérimentaux spécifiques et des politiques d’utilisation éthique des animaux, ces considérations devraient être prises en compte dans les expériences pilotes. La dérive du microbiote peut également être précipitée par des changements de litière dans une cage humide avec des bouteilles d’eau qui fuient. Il est préférable de s’abstenir de changer de cage pendant l’accouchement DSS et pendant les cinq jours suivants. L’utilisation de tubes de 50 mL pour l’administration de l’eau DSS réduit le risque de fuite et minimise les déchets DSS. Ces considérations logistiques peuvent nécessiter une collaboration étroite entre le personnel de recherche et les techniciens en soins aux animaux qui effectuent des services de changement de cage et d’élevage.

Dans ce protocole, nous fournissons également un flux de travail de base pour la récolte de tissus et de cellules, ainsi que pour la collecte de données. Cela comprend le dépistage de la présence de sang occulte (Figure 2C) et la cartographie des tumeurs (Figure 3A). Le modèle AOM/DSS convient aux souris immunocompétentes, ce qui en fait un système idéal pour explorer le microenvironnement immunitaire tumoral en raison du système immunitaire entièrement intact ^38,39, contrairement aux approches de xénogreffe. Notamment, il se prête à une perturbation expérimentale du système immunitaire ou des composants stromaux, que ce soit par le biais d’un système génétique Cre-Lox pour les knock-ins/outs de gènes spécifiques au type de cellule ou les cassettes rapporteures, ou la greffe ou l’épuisement de populations cellulaires spécifiques. À titre d’exemple, en combinant le modèle AOM/DSS avec une greffe de moelle osseuse, nous avons précédemment étudié comment les mutations du système hématopoïétique modulent la gravité et le fardeau des CAC⁴⁰. Pour aider à de telles études, il existe d’excellentes méthodes publiées pour isoler des leucocytes viables infiltrant la tumeur qui conviennent à des analyses plus approfondies, telles que l’immunophénotypage, les tests fonctionnels et la multi-omique unicellulaire⁴¹. Enfin, en raison de la pénétrance élevée et de la latence constante, le modèle AOM/DSS convient aux études thérapeutiques précliniques utilisant la charge tumorale totale comme lecture principale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poudre d’azoxyméthane	Sigma-Aldrich	CAS 25843-45-2, Cat# A4586	Cancérogène pour induire des tumeurs du côlon
Microcentrifugeuse de paillasse	NA	; NA	Pour la préparation des échantillons  ;
souris C57BL/6J	Laboratory	000664	Souche et âge appropriés pour chaque étude spécifique
Tubes coniques, 50 mL		Fisher 14955239	Pour administrer de l’eau DSS
Sulfate de dextran sel de sodium, MW environ 40 000	Cayman Chemical  ;	23250	Pour induire l’inflation du côlon  ;
Éthanol, 70 %	Fisher  ;	43655223	Pour assainir les surfaces de travail et les outils de dissection
Meulage des billes de verre, 800 & micro ; m  ;	VWR	12621-148	Pour faciliter l’homogénéisation du côlon/tissu tumoral
HemoCue America  ; Beckman Coulter Hemoccult ICT Immunochemical Fecal Occult Blood Test Kit	HemoCue America 395065A	N° de catalogue 23280010	Pour la détection du sang occulte dans les selles
Seringue à insuline 27GX5/8 1CC  ;	BD  ;	3294-12	Pour les injections d’OMA
Bloqueur de lixit	NA	NA	Pour bloquer l’administration automatisée d’eau dans les cages de souris, le cas échéant (fournie par l’animalerie, sterille)  ;
Barre d’agitation et plaque d’agitation magnétiques  ;	NA	NA Pour	dissoudre DSS  ;
Homogénéisateur de billes de microtubes, BeadBlaster 24  ;	Benchmark	D2400	Pour homogénéiser le côlon/tumeur
Souris Lipocalin-2/NGAL DuoSet ELISA	R& D	Systems N° de catalogue DY1857	Pour détecter la lipocaline-2 à partir d’échantillons fécaux
Solution NP-40, 10 %	Thermo Fisher Scientific	85124	Pour la lyse du tissu tumoral/du côlon
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	A65453	Pour quantifier la concentration en protéines dans les lysats tissulaires totaux, ou toute autre méthode appropriée
Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphate  ;	Fisher	PI78440	Préparer des échantillons pour l’analyse des cytokines/protéines.
Tampon RLTplus	Qiagen 1053393		Pour isoler l’ARN, ou toute autre méthode d’isolement d’ARN appropriée
RNAlater	Thermo Fisher Scientific	AM7021	Pour préserver les échantillons de tissus avant l’isolement de l’ARN
RNeasy Microprep kit  ;	QIAGEN	74004	Pour isoler l’ARN, ou toute autre méthode d’isolement et de purification de l’ARN, le cas échéant
Buse pour bouteille d’eau pour rongeurs (30 mm)	Vision	Type E	Pour administrer l’eau ou la solution DSS
Ciseaux et pinces stériles	NA	NA Pour	dissection tissulaire
Aiguilles de seringue, 27G x 1/2in de longueur (courte)	BD  ;	305109	Pour la fixation du tissu du côlon en rouleau suisse.
Seringues, Luer lock, 3 mL	BD  ;	309657	Pour rincer les côlons avant la dissection et la stadification
TapeStation	Agilent		Pour l’évaluation de la concentration et de la qualité/intégrité de l’ARN
Teklad 2918	Evigo Bioproducts	T.2918M.15	Régime alimentaire standard pour rongeurs, 18 % de protéines, irradié
Cassette tissulaire	VWR	#87002-472	Pour conserver l’échantillon en vue de son enrobage
Balance de laboratoire à chargement par le haut, 0-220 g	NA	NA Pour	peser les animaux
Whatman Blotting Paper	VWR International	Cat# 28298-020	Pour la stadification des côlons disséqués pour la pathologie macroscopique et le comptage des tumeurs