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Article de méthode

Fibroblastes associés au cancer provenant de tumeurs mammaires de souris comme outils pour les études moléculaires et computationnelles

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DOI :

10.3791/68364

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3 juillet 2025

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1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit les méthodes de culture, de manipulation et d’analyse des CAF murins, y compris les essais fonctionnels in vitro/in vivo , la transcriptomique et l’analyse informatique. De plus, il décrit une plate-forme Web développée pour analyser les transcriptomes accessibles au public de composants stromaux et épithéliales micro-disséqués par capture laser à partir d’une collection de tumeurs cancéreuses du sein humain.

Résumé

Un ensemble de recherches convaincantes a confirmé le rôle essentiel du microenvironnement tumoral (TME) dans la croissance et l’agressivité du cancer du sein (BC). Les fibroblastes associés au cancer (CAF), le composant cellulaire prédominant du TME, influencent considérablement son comportement par une diaphonie complexe avec le cancer et d’autres cellules stromales en réponse à des signaux d’activation dérivés de la tumeur. Les modèles murins sont largement utilisés pour étudier les mécanismes sous-jacents au rôle du CAF dans la progression de la BC, car ils permettent l’évaluation de l’EUT endogène et l’évaluation de l’implication du système immunitaire à l’aide d’études de xénogreffes syngéniques. Ici, nous présentons un ensemble de méthodes pour cultiver des CAF dérivés de BC, manipuler l’expression génique et évaluer leurs fonctions pro-tumorigènes en utilisant des approches in vitro et in vivo . Nous décrivons également des protocoles pour le profilage de l’expression génique CAF et l’analyse transcriptomique, ainsi qu’une procédure informatique pour inférer des signatures transcriptionnelles dans les tumeurs primaires à l’aide de données de séquençage d’ARN en vrac accessibles au public. De plus, nous introduisons un outil Web convivial pour l’analyse des transcriptomes des composants stromaux et épithéliaux à partir de tumeurs BC micro-disséquées par capture laser. En fin de compte, ces méthodes peuvent fournir des informations précieuses sur les mécanismes moléculaires à l’origine des interactions CAF-tumeur et ont le potentiel d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Introduction

Le cancer du sein est la tumeur maligne la plus fréquente chez les femmes et se caractérise par une hétérogénéité moléculaire importante, avec des profils moléculaires distincts guidant le diagnostic, les décisions de traitement et le pronostic. Le microenvironnement tumoral (TME) est également très hétérogène et joue un rôle essentiel dans la progression tumorale, l’immunité et les résultats du traitement.

Les fibroblastes associés au cancer (CAF) sont le type de cellule le plus abondant dans le TME et les principaux régulateurs du développement tumoral. Ils contribuent au dépôt et au remodelage de la matrice extracellulaire, à l’angiogenèse, à l’évasion immunitaire et à la résistance aux médicaments 1,2,3,4,5,6. Les CAF influencent les cellules tumorales par le contact direct entre les cellules, la libération de vésicules extracellulaires7 et la sécrétion de divers facteurs solubles 2,5 pour favoriser la croissance tumorale, l’invasion et la résistance au traitement 8,9,10. En effet, les signatures génétiques liées au stroma ont une valeur prédictive pour la progression de la cathétérité du cancer du sein et la réponse au traitement et sont associées à la résistance à la chimiothérapie 11,12,13,14. Cependant, malgré des preuves substantielles suggérant que les CAF sont une cible thérapeutique attrayante, les essais cliniques ciblant ces cellules ont largement échoué15. L’un des principaux défis est la compréhension limitée des mécanismes moléculaires par lesquels les CAF modulent le comportement tumoral. Les progrès récents dans les analyses transcriptomiques unicellulaires et spatiales ont fourni des informations plus approfondies sur la complexité des CAF en Colombie-Britannique 16,17,18,19,20,21, permettant d’identifier des sous-types distincts de CAF avec des programmes fonctionnels spécifiques 16,22 et de mettre en évidence leur complexité et leur plasticité 23.

Les modèles murins génétiquement modifiés (GEMM), dans lesquels les oncogènes ou les gènes suppresseurs de tumeurs sont surexprimés ou inactivés, sont des modèles bien établis pour l’étude du cancer humain 24,25,26,27. Par rapport aux modèles syngéniques, qui impliquent la greffe de cellules tumorales chez des souris de type sauvage23,28, les GEMM imitent plus précisément la progression en plusieurs étapes de la BC et les interactions entre les cellules cancéreuses et le TME. La manipulation des activités des CAF dans les GEMM a toutefois été difficile en raison de leur hétérogénéité, ce qui rend difficile le ciblage de tous les sous-types de CAF sans effets hors cible sur d’autres composants stromaux ou épithéliaux5. La combinaison des GEMM avec des approches complémentaires, telles que la manipulation CAF in vitro, peut aider à générer des modèles cellulaires pour des expériences de perte de fonction dans des contextes in vitro et in vivo. Cependant, le développement de modèles cellulaires stables pour explorer les rôles fonctionnels de gènes spécifiques reste difficile en raison de l’apparition rapide de la sénescence.

Ici, nous décrivons une plate-forme robuste pour des expériences de perte de fonction stables dans des CAF, suivies d’une analyse fonctionnelle in vitro et in vivo et d’un profilage transcriptionnel des cellules modifiées ; cette approche offre une stratégie globale pour disséquer la pertinence fonctionnelle des gènes exprimés par CAF dans le cancer du sein, avec des avantages en termes de spécificité, de reproductibilité et d’adaptabilité par rapport aux méthodes existantes. Cette approche est également complétée par un nouvel outil en ligne permettant d’explorer les transcriptomes des compartiments stromaux et épithéliales microdisséqués par capture laser de tumeurs mammaires humaines, permettant des comparaisons inter-espèces et facilitant la génération d’hypothèses à partir de données humaines.

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Protocole

Cette étude est conforme à toutes les directives institutionnelles concernant la manipulation des souris et l’échantillonnage des tissus. Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux lois et politiques nationales et internationales. Les souris ont été logées dans une unité transgénique exempte d’agents pathogènes spécifiques sous un cycle lumière/obscurité de 12 h à 22 °C avec 50 % d’humidité et ont reçu de la nourriture et de l’eau à volonté. Les interventions chirurgicales doivent suivre les instructions vétérinaires de l’établissement pour assurer une anesthésie et une analgésie appropriées, tant pendant l’intervention que dans la période postopératoire. La table des matériaux fournit des détails sur les matériaux, les réactifs et les instruments utilisés dans ce protocole.

1. Culture cellulaire

  1. Cellules de culture à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 avec une humidité relative de 95 %, dans du DMEM (HEK293T, des CAFs et des CAFs immortalisés (iCAF)) ou dans un milieu RPMI (4T1), complété par 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine (1 % Pen/Strepto).
    REMARQUE : Composition du milieu complet (cDMEM, cRPMI) : 10 % FBS inactivé par la chaleur, milieu de famine (sDMEM, sRPMI) composition : pas de FBS. Les temps moyens de doublement des cellules : HEK293T et iCAFs sont de 24 h ; Les cellules 4T1 sont de 12h.
  2. Cellules de passage lorsqu’elles atteignent 80 % de confluence, à un rapport ne dépassant pas 1:5, jamais plus de 10 fois après la décongélation pour éviter la dérive phénotypique, comme décrit ci-dessous.
    1. Aspirez le milieu et ajoutez délicatement 7 ml de PBS sur le côté d’un plat de 100 mm. Aspirez le PBS, ajoutez 1 mL de trypsine-EDTA. Incuber pendant 2-3 min à 37 °C.
      ATTENTION : L’EDTA est répertorié comme un composé dangereux de catégorie 2 pour l’irritation oculaire. Manipuler dans une hotte biologique ou une hotte en portant l’EPI approprié.
    2. Inactivez la trypsine-EDTA avec 5 mL de cDMEM, détachez les cellules en les pipetant de haut en bas et collectez-les dans un tube conique de 15 mL. Centrifugeuse à 290 x g pendant 5 min.
    3. Retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de cDMEM. Pour une division 1:5, semez 1 mL de cellules remises en suspension dans une boîte de 100 mm contenant 9 mL de cDMEM.
  3. Comptage des cellules : Chargez 10 μL de la suspension cellulaire de l’étape 1.2.3 sur le côté d’une chambre de comptage Neubauer, comptez les cellules dans les grands carrés et multipliez le nombre obtenu par 1 x 104 pour calculer le nombre de cellules contenues dans 1 mL de suspension cellulaire.
  4. Cryoconservation : Congelez 50 % d’une parabole de 100 mm (environ 3 x 106 cellules) dans 0,5 mL de produit de congélation glacé (10 % de DMSO dans un FBS inactivé par la chaleur) comme décrit ci-dessous.
    1. À partir d’une boîte de 100 mm, trypsiniser les cellules comme décrit aux étapes 1.2.1 et 1.2.2, sauf que les cellules sont remises en suspension dans 1 mL de produit de congélation glacé.
    2. Verser 0,5 mL dans chaque flacon cryogénique et placer à -80 °C dans un récipient assurant une vitesse de refroidissement d’environ 1 °C/min. Chaque aliquote peut être décongelée dans un plat de 100 mm.
  5. Test de contamination par les mycoplasmes : Prélever 1 mL de milieu de culture de cellules confluentes cultivées pendant au moins 3 jours. Faire bouillir à 95 °C pendant 20 min. Essorage à 16200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Ajouter 5 μL de surnageant à 45 μL de mélange réactionnel de PCR (0,15 mM de dNTP, 1,5 mM de MgCl2, 1x tampon de réaction, 1 U de Taq polymérase, 0,5 μM d’amorces A et B, voir le tableau 1). Effectuez une PCR, y compris des contrôles positifs et négatifs, et séparez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1 % avec une échelle d’ADN. Les échantillons contaminés par des mycoplasmes présenteront une bande de 600 pb.

2. L’isolement des CAF à partir de tumeurs mammaires

REMARQUE : Cette étape est optimisée pour les tumeurs de stade avancé de 5 à 10 mm de diamètre (voir référence29 ).

  1. Sacrifiez la souris par luxation cervicale. Isoler les tumeurs mammaires d’au moins 125 mm3. Excise la tumeur avec soin, en enlevant la peau environnante, le tissu mammaire et les zones nécrotiques visibles. À l’aide d’une pince à épiler, prélever dans un microtube de 1,5 mL placé sur de la glace.
  2. Pesez la tumeur avec une balance de précision, excisez un morceau cubique de 0,1 à 0,3 g avec un scalpel, transférez-le dans un nouveau microtube de 1,5 ml rempli de PBS glacé et conservez-le sur de la glace. Assurez-vous que le tissu est immergé pour éviter la déshydratation.
  3. Transférer dans un plat de 60 mm de diamètre, sur de la glace. Hacher finement 1 mL de PBS à l’aide d’un scalpel jusqu’à l’obtention de morceaux d’environ 1 à 2 mm.
  4. Transférer dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL pour 0,1 g de tumeur dans cDMEM plus 10 μg/mL de collagénase. Rincez le plat avec 1 mL du même milieu, à l’aide d’une pipette P1000 avec une pointe coupée pour éviter d’endommager les cellules. Fixez le capuchon avec un film d’étanchéité pour éviter les fuites.
  5. Incuber horizontalement pendant 1 h à 37 °C sur un agitateur orbital. Placez une passoire cellulaire de 70 μm sur un tube conique de 50 mL et transférez l’homogénat à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. À l’aide de l’arrière d’un piston de seringue de 5 ml, broyez et poussez l’échantillon à travers le filtre.
  6. Utilisez du cDMEM (ne dépassant pas 30 ml de volume final) pour récupérer tout ce qui se trouve dans la passoire. Faire tourner les cellules à 129 x g à 4 °C pendant 10 min et jeter le surnageant.
  7. Ajouter 3 ml de tampon de lyse ammoniaque-chlorure-potassium (ACK) pour éliminer les globules rouges (GR). Fermez bien les tubes et mélangez par inversion. Incuber pendant 5 min à RT sur un agitateur orbital.
  8. Arrêtez la lyse des globules rouges en ajoutant du PBS à un volume final de 30 ml. Faire tourner les cellules à 129 x g à 4 °C pendant 10 min et jeter le surnageant.
  9. Remettez la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de cDMEM et comptez les cellules viables comme à l’étape 1.3 en utilisant 10 μL de bleu de méthylène : les cellules vivantes réduisent le colorant en un produit incolore et ne sont plus colorées, tandis que les cellules mortes sont colorées en bleu.
  10. Semez 5 x 10 boîtesde 5 cellules/60 mm dans 5 mL de cDMEM, incubez 20 min à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 , récupérez les cellules non adhérentes et replaquez-les pendant la nuit.
  11. Après 48 h ou 72 h, effectuer une trypsinisation différentielle. Étant donné que les fibroblastes se détachent plus rapidement que les cellules épithéliales et myoépithéliales30, procédez comme décrit à l’étape 1.2. mais surveiller de près le décollement des cellules au microscope. Les cellules en forme de fibroblaste deviendront rondes et se détacheront tandis que les cellules épithéliales resteront attachées.
  12. Ajoutez du cDMEM pour inactiver la trypsine et recueillir les CAF détachés, en les transférant dans une nouvelle parabole de 60 mm dans 5 mL de cDMEM. Passage primaire CAF 1:3 (voir étape 1.2) pour trois passages, puis préparer les aliquotes congelées de passage précoce comme décrit à l’étape 1.4.

3. L’immortalisation par transduction virale

REMARQUE : Certaines des étapes suivantes doivent être effectuées dans un environnement adapté à la manipulation des vecteurs rétroviraux (p. ex., BSL2+) ; Vérifiez les règles de votre établissement.

  1. Préparation du virus recombinant
    1. Cultivez HEK293T cellules et vérifiez la contamination par les mycoplasmes (voir étape 1).
    2. Enduire une boîte de 100 mm de diamètre en pipetant 6 mL d’une solution de poly-L-lysine à 0,1 mg/mL dans de la jdH2O pendant 5 min à RT, aspirer et laisser sécher sous le capot (environ 10 min).
    3. Implanter 3 x 10cellules de 6 HEK293T (passage faible, mycoplasme négatif) dans 10 mL de cDMEM dans la boîte enrobée de poly-L-lysine de l’étape 3.1.2 (voir l’étape 1.3).
    4. Le lendemain, préparez deux tubes contenant 0,75 mL de milieu optimisé pour la transfection sans antibiotiques. À l’un d’eux, ajoutez 30 μL de réactif de transfection cationique médié par les lipides (T1). Au second, ajoutez 2 μg de pCL-Ampho (vecteur d’emballage rétroviral) et 2 μg de vecteur d’ADNc rétroviral pBABE-neo largeT (T2). Ajouter T2 à T1, mélanger doucement et incuber pendant 10 min.
    5. Répartissez uniformément le milieu sur les cellules après l’avoir remplacé par un milieu optimisé pour la transfection sans antibiotiques + 10 % de FBS inactivé par la chaleur. Déplacez la plaque vers une installation de culture tissulaire de niveau de biosécurité 2+ (BSL-2+). Remplacez le milieu par du cDMEM après 6 à 12 h et incubez les cellules pendant 24 à 48 h.
    6. Filtrer le milieu contenant les particules pseudovirales à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm et conserver à 4 °C pendant quelques jours ou à -80 °C pour un stockage à long terme.
  2. La transduction virale de la CAF
    1. Semez 7,5 x 105 CAF dans chacune des deux boîtes de 60 mm dans 4 mL de cDMEM (voir l’étape 1.3) et cultivez-les comme à l’étape 1.1.
    2. Le lendemain, remplacer le milieu d’une boîte par 2 ml du milieu contenant le pseudovirus de l’étape 3.1.6 (CAFs transduits), ajouter 2 ml de cDMEM et incuber pendant 24 h. Laissez l’autre plat intact (CAF non transduits).
    3. Le lendemain, répétez l’étape 3.2.2 sur les CAF traduits. Après 24 h, remplacez le milieu des deux plats par 4 mL de cDMEM.
    4. Après encore 24 heures, commencez la sélection en remplaçant le milieu des deux plats par du cDMEM complété par 400 μg/mL de G418. Remplacez le milieu contenant le G418 tous les 2 à 3 jours jusqu’à ce qu’il ne reste plus de cellules vivantes dans la parabole de contrôle des CAF non transduits.
      REMARQUE : Les cellules non transduites sont sensibles à G418 et mourront dans les 7 à 10 jours, ce qui indique que seules les cellules transduites résistantes à G418 auront survécu dans l’état des CAFs transduits. La concentration optimale d’antibiotiques doit être déterminée pour chaque type de cellule, en effectuant des courbes de destruction (tester une plage de 50 à 1000 μg/mL de concentration de G418 pendant 7 à 10 jours et sélectionner la dose tuant toutes les cellules dans les 10 jours).
    5. Passez les cellules transduites sélectionnées 2x selon un rapport de 1:3 (voir étape 1.2) avant de quitter l’installation BSL. Préparez des aliquotes cryoconservées des premiers passages comme à l’étape 1.4.
    6. Vérifier que les cellules continuent de proliférer sans présenter de phénotype sénescent sur plusieurs passages et procéder à la caractérisation phénotypique et fonctionnelle (voir étapes 4 et 6-9).

4. Caractérisation phénotypique

REMARQUE : Les marqueurs CAFs tels que l’actine alpha du muscle lisse (α-SMA), la cavéoline, la protéine activatrice des fibroblastes (FAP), la N-cadhérine, le facteur de croissance bêta dérivé des plaquettes (PDGFR-β), S100A4 et la vimentine29 peuvent être évalués par RT-qPCR et Western Blot.

  1. RT-qPCR : Extraire l’ARN total avec une solution monophasique d’isothiocyanate de phénol et de guanidine comme décrit dans la référence15. Transcrire inversement 2 μg d’ARN total dans un volume de 20 μL, en suivant les instructions du fabricant pour les conditions de réaction. Diluez l’ADNc 1:20 et utilisez 3 μL pour effectuer les réactions RT-qPCR, en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau 1 pour les amorces).
    REMARQUE : Nous vous recommandons de préparer l’ARN à partir d’un plat à 12 puits.
  2. Transfert Western
    1. Lavez 2 fois avec du PBS comme décrit à l’étape 1.2.1, ajoutez 0,2 ml de tampon de lyse glacé, détachez les cellules à l’aide d’un grattoir et recueillez-les dans un microtube de 1,5 ml comme décrit aupoint 29. Laisser poser 20 min sur glace.
    2. Faites tourner les échantillons à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C et prélevez le surnageant. Quantifier les protéines par dosage colorimétrique selon les instructions du fabricant. Utiliser au moins 20 μg de protéines pour le Western blot (voir le tableau 2 pour les anticorps).
      REMARQUE : Nous recommandons de préparer des protéines à partir d’au moins 6 puits dans un plat.
  3. Analyse des protéines sécrétées
    1. Semez 2 x 106 iCAFs (voir l’étape 1.3) dans une boîte de 100 mm de diamètre dans 10 mL de cDMEM et cultivez-les comme décrit à l’étape 1.1.
    2. Après 24 h, retirez le milieu, lavez-le 2 fois avec 10 ml de PBS et incubez pendant 48 h avec 10 ml de sDMEM (voir étape 1.1) pour générer un milieu conditionné (CM).
    3. Après 48 heures supplémentaires, filtrez le CM à travers un filtre de seringue de 0,2 μm dans un tube conique de 15 mL. Tenez fermement la seringue et le tube et préparez-vous à une certaine résistance. CM peut être conservé à -80 °C jusqu’à 6 mois.
    4. Concentrez CM environ 10x à l’aide de concentrateurs de protéines selon les instructions du fabricant, pour générer un CM concentré (conCM). Quantifiez le conCM, faites bouillir et effectuez le Western Blot (voir le tableau 2 pour les anticorps).

5. Analyse de l’inactivation génétique

REMARQUE : Pour interférer de manière stable avec l’expression des gènes, nous transduisons les iCAFs avec des particules lentivirales exprimant des shRNA spécifiquement conçus. Celles-ci peuvent être obtenues en clonant les séquences cibles dans un vecteur lentiviral approprié tel que pLKO.1-Puro, en suivant les protocoles disponibles chez https://www.addgene.org/protocols/plko/#C. Les séquences de ciblage spécifiques peuvent être sélectionnées à l’aide d’outils de conception de shRNA accessibles au public (c’est-à-dire GPP-Genetic Perturbation Portal du Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/). Des ensembles de vecteurs de ciblage prédéfinis sont également disponibles dans le commerce (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started, https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). Nous vous recommandons de concevoir 4 à 5 shRNA différents pour chaque gène et de sélectionner les 2 meilleurs pour les expériences. Générez également des vecteurs non ciblés en tant que contrôles négatifs. Certaines des étapes suivantes doivent être prises dans un environnement propice à la manipulation des virus dérivés du VIH (p. ex., BSL2+). Vérifiez les règles de votre établissement.

  1. Génération de particules lentivirales
    1. Amorcez 3 x 106 cellules HEK293T comme aux étapes 3.1.1 à 3.1.3. Le lendemain, préparer les complexes cationiques réactif de transfection lipidique-ADN comme à l’étape 3.1.4, en utilisant 9 μg et 3 μg, respectivement, des vecteurs d’emballage pCMV-R8.74 et pCMV-VSVG, et 7 μg de la construction pLKO.1 contenant des shRNA dans 0,75 mL de milieu optimisé pour la transfection sans antibiotique, et procéder comme décrit aux étapes 3.1.5 et 3.1.6.
  2. Transduction des CAF
    1. Infectez les cellules comme décrit aux étapes 3.2.1, 3.2.2 et 3.2.4. Après 24 h, retirer le milieu infectieux et commencer la sélection avec 2 μg/mL de puromycine dans cDMEM. Voir la remarque à l’étape 3.2.5 pour déterminer la concentration optimale.
    2. Remplacez la puromycine/cDMEM après 48 h. La sélection est généralement complète en 3 jours. Développez et figez les cellules comme à l’étape 3.2.6. Évaluez l’efficacité de l’inactivation par RT-PCR et Western blot, comme décrit aux étapes 4.1. et 4.2.

6. Super-activation des iCAFs avec CM à partir de cellules tumorales

REMARQUE : Les étapes suivantes illustrent les méthodes de caractérisation in vitro des activités pro-tumorales des iCAF. Les activités pro-tumorales des CAF peuvent être améliorées en les incubant avec des CM à partir de cellules tumorales BC de souris (super-activation, s.a.), comme décrit ci-dessous.

  1. Compter 4T1 cellules murines de Cb comme décrit à l’étape 1.3 et ensemencer 2 x 106 cellules dans une boîte de 100 mm de diamètre dans 10 mL de cRPMI (voir l’étape 1.1).
  2. Après 24 h, retirer le milieu, laver 2 fois avec 10 mL de PBS et incuber pendant 48 h avec 10 mL de sRPMI (voir l’étape 1.1) pour générer de la CM.
  3. Le lendemain, semez 2 x 106 iCAF dans une boîte de 100 mm de diamètre, dans 10 mL de cDMEM (voir l’étape 1.3) et cultivez-les comme décrit à l’étape 1.1. Filtrez le CM à travers un filtre à seringue de 0,2 μm dans un tube conique de 15 ml comme à l’étape 4.3.3.
  4. Super-activation (s.a.) : retirer le milieu de la parabole des iCAF, laver 2 fois avec 10 mL de PBS, et ajouter le 4T1 CM filtré (8-10 mL). Incubation pendant 48 h pour obtenir des iCAFs s.a.

7. Prolifération des cellules tumorales

  1. Prétraiter les cellules 4T1 pendant 48 h avec iCAFs CM, préparé comme aux étapes 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3.
  2. Trypsinisez et comptez-les, puis ensemencez 4 x 103 cellules/puits d’une plaque de 96 puits dans 100 μL de cRPMI comme décrit à l’étape 1.3 et cultivez comme à l’étape 1.1. Plaque technique en triple.
    1. Préparez une assiette de 96 puits par jour du cours de temps. Le nombre de cellules suggéré ici est optimisé pour un protocole de 4 jours ; Réduisez-le pour plus longtemps.
  3. Au bout de 4 h, ou dès que les cellules sont fixées, prélever le milieu, laver au PBS en ajoutant délicatement 100 μL, en prenant soin de ne pas détacher les cellules en posant l’embout contre le bord du puits, à l’aide d’une pipette multicanaux et à l’aide d’un réservoir stérile. Retirez le PBS, puis ajoutez de la même manière 100 μL de sDMEM (contrôle) ou d’iCAF CM, tous deux complétés par un FBS inactivé à la chaleur à 2 % (voir les étapes 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3).
  4. Après 4 h, arrêter la plaque du jour 0 comme décrit au point 7.5. Pour les autres points de temps, remplacez le milieu tous les deux jours jusqu’à la fin de l’expérience.
  5. Pour évaluer la densité cellulaire, retirez la plaque à 96 puits de l’incubateur et lavez les puits 2 fois avec 100 μL de PBS, comme décrit à l’étape 7.3.
  6. Sous une hotte, ajoutez 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans chaque puits et fixez les cellules pendant 10 min à RT.
    ATTENTION : Le PFA peut causer de graves lésions oculaires et une irritation de la peau ; Il est nocif s’il est avalé et inhalé et est suspecté de provoquer des anomalies génétiques et le cancer. Manipuler dans une hotte en portant l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié.
  7. Laver 3 fois avec 100 μL de PBS comme à l’étape 7.3 et laisser sécher sous la hotte (environ 10 min).
  8. Incuber avec 50 μL de violet cristallin à 0,1 % dans du méthanol à 20 % pendant 10 min à RT.
    ATTENTION : Le violet cristallin peut causer de graves lésions oculaires et est signalé comme un danger de catégorie 4 pour la toxicité aiguë orale et un danger de catégorie 2 comme cancérogène. Manipulez-le dans une hotte en portant l’EPI approprié.
  9. Lavez 3 fois avec 100 μL de ddH2O, videz les puits et tapotez la plaque sur un tampon absorbant ou une serviette en papier pour éliminer complètement le liquide.
  10. Dissoudre le violet cristallin dans 100 μL d’acide acétique à 10 % pendant 15 min à RT et mesurer la densité optique (OD) à une longueur d’onde de 600 nm dans un lecteur de microplaques, en utilisant 100 μL d’acide acétique à 10 % comme blanc. Normalisez le D.O. pour ce jour-là à 0 par condition.

8. Migration et invasion

  1. Pipette 700 μL de DMEM complété par 1 % de FBS inactivé à la chaleur, 1 % Pen/Strepto, dans les puits d’une plaque à 24 puits. Placer dans chaque puits un insert de transpuits de pores de 8 μm, enduit (invasion) ou non (migration) d’une matrice biologiquement active. Laissez la plaque dans l’incubateur pour qu’elle s’équilibre à 37 °C tout en recueillant et en comptant 4T1 cellules comme à l’étape 1.3.
  2. Détachez les cellules 4T1 prétraitées pendant 48 h avec des iCAFs CM d’une parabole de 100 mm de diamètre, comme aux étapes 4.3.1, 4.3.2 et 4.3.3, en utilisant 1 mL de 5 mM d’EDTA au lieu de trypsine-EDTA.
  3. Ajoutez 5 ml de cDMEM, récoltez les cellules dans un tube conique de 15 ml et granulez par centrifugation comme à l’étape 1.2. Réintroduire les cellules en suspension dans le sDMEM, compter comme à l’étape 1.3 et diluer à 1 x 105 cellules/100 μL.
  4. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire dans la chambre supérieure du puits de transfaction. Comme témoin de placage, ensemencez 100 μL de cellules dans une plaque de 24 puits, dans 500 μL de cDMEM. Incuber pendant 16 h (migration) ou 24 h (invasion), et arrêter l’expérience comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Les temps d’incubation doivent être déterminés empiriquement si l’on utilise des cellules différentes.
  5. Étiquetez les inserts sur leur face supérieure à l’aide d’un marqueur mince et immergez-les dans un tube conique de 50 ml rempli de PBS pour le lavage à l’aide d’une pince à épiler. Nettoyez soigneusement la partie interne du transwell à l’aide d’un coton-tige.
  6. Sous une hotte, incuber des échantillons dans 700 μL de PFA à 4 % pendant 10 minutes à RT (voir l’étape 7.6).
  7. Laver 3 fois avec 700 μL de PBS et laisser sécher sous le capot (environ 10 min). Incuber des inserts avec 700 μL de violet cristallin à 0,1 % dans du méthanol à 20 % pendant 10 min à RT (voir étape 6.10).
  8. Lavez les inserts 3 fois en les immergeant dans un tube conique de 50 mL rempli de ddH2O à l’aide d’une pince à épiler. Nettoyez soigneusement la partie interne du transwell à l’aide d’un coton-tige. Conservez les échantillons chez RT et prenez des photos jusqu’à 3 jours plus tard.
  9. À l’aide d’un microscope à contraste de phase, prenez une photo avec un objectif 10x en imageant la majeure partie de la surface du puits, puis acquérez des images de 5 zones indépendantes avec un objectif 20x.
  10. Dissoudre le violet cristallin dans de l’acide acétique à 10 % comme suit : pour les puits, ajouter 100 μL d’acide acétique et mélanger sur un agitateur orbital pendant 10 min à RT ; pour les transwells, les poser, surface inférieure vers le haut, sur un banc, déposer 50 μL d’acide acétique sur la surface et mélanger par pipetage jusqu’à ce que le violet cristallin soit complètement dissous.
  11. Lire l’absorbance à 600 nm dans une plaque à 96 puits en utilisant 50 μL de matériau dissous à l’étape ci-dessus. Utilisez de l’acide acétique à 10 % comme blanc.
  12. Normaliser la densité optique (D.E.) de la commande de placage à partir de l’étape 8.5 et exprimer la migration ou l’invasion par rapport à la condition de contrôle.

9. Croissance tumorale primaire et formation de métastases pulmonaires

REMARQUE : L’étape suivante illustre les méthodes de caractérisation in vivo des activités pro-tumorales des CAF. Cette étape est optimisée pour l’évaluation des caractéristiques pro-tumorigènes in vivo des CAF par co-injection dans des modèles murins syngéniques. Comme les cellules CAFs et 4T1 proviennent toutes deux de souris BALB/c, des souris BALB/c sont utilisées.

  1. À 2 jours avant l’injection, les souris femelles BALB/c âgées de 6 semaines avec des étiquettes d’oreille d’identification en métal et rasez la 4ème région de la glande mammaire avec un rasoir.
  2. Collecter et compter les cellules 4T1 et les iCAFs, préparés comme décrit à l’étape 6. Dans un tube conique de 15 mL, mélanger 1 x 105 cellules 4T1 et 3 x 105 s.a. iCAF/souris, en considérant un excédent d’au moins 20 %. Utilisez 4T1 uniquement comme contrôle.
  3. Centrifuger à 290 x g pendant 5 min, remettre en suspension dans un volume de PBS calculé pour obtenir le nombre ci-dessus de cellules/souris dans 50 μL, transférer dans un microtube de 1,5 mL et maintenir sur glace.
    REMARQUE : Par exemple, pour injecter 10 souris, mélangez 1,2 x 10cellules 6 4T1 avec 3,6 x 106 s.a. iCAFs, des cellules à granulés, et remettez en suspension dans 600 μL de PBS. Injecter 50 μL de suspension cellulaire par souris.
  4. Préparez la zone de travail en nettoyant et en désinfectant la surface d’une hotte à flux laminaire. Couvrez une planche de chirurgie de la mousse avec une feuille de protection de banc.
  5. Anesthésier les souris une à la fois, selon les procédures institutionnelles (on utilise l’injection intrapéritonéale de tilétamine/zolazépam base + xylazine 70 mg/kg + 5 mg/kg). Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse. À l’aide d’un coton-tige, désinfectez la peau avec une solution de povidone iodée.
  6. Utilisez le test de pincement des orteils pour vous assurer que les souris sont sous anesthésie appropriée. À l’aide d’une aiguille hypodermique, injecter 50 μL de la suspension cellulaire dans le 4e coussinet adipeux mammaire. Utilisez le mamelon comme référence et injectez environ 3 mm vers la jambe ipsilatérale.
  7. Inspectez les souris pendant quelques heures après l’injection et dans les jours suivants. Les tumeurs deviennent palpables au bout de 4 jours.
  8. Mesurez la taille de la tumeur toutes les 48 heures avec un pied à coulisse, en déterminant les diamètres maximum et minimum. Calculez le volume tumoral à l’aide de la formule : (longueur x largeur2)/2.
  9. Après 10 jours d’injection, retirez chirurgicalement les tumeurs primaires comme décrit ci-dessous.
    1. Préparez la zone chirurgicale comme à l’étape 9.5. Stérilisez les outils par autoclave et placez-les sur une surface stérile pendant que vous travaillez. Stérilisez les outils entre les animaux à l’aide d’un stérilisateur à billes chaudes.
    2. Anesthésie les souris comme aux étapes 9.6 et 9.7. À l’aide d’une lame de scalpel, faites une incision de 5 à 8 mm près de la tumeur et retirez doucement la peau, créant une petite poche pour accéder à la tumeur. Cautériser tout vaisseau sanguin visible à l’aide d’un stylo cautérisant à basse température pour éviter les hémorragies lors de la dissection.
    3. Utilisez le scalpel pour enlever la tumeur, en essayant de ne pas enlever de peau. Remettez les lambeaux cutanés dans leur position d’origine, suturez-les ensemble à l’aide d’un fil chirurgical 5-0 avec une aiguille 1/2c de 17 mm et ajoutez de la colle chirurgicale pour sceller complètement la plaie.
    4. Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris une conscience suffisante pour maintenir la décubitus sternal. Les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale ne sont pas renvoyés en compagnie d’autres animaux tant qu’ils ne sont pas complètement rétablis.
  10. Surveiller de près les animaux après l’intervention chirurgicale et dans les jours qui suivent, administrer un traitement analgésique si nécessaire, selon les protocoles de l’établissement. Nous utilisons des injections sous-cutanées de Carprofène (3-5 mg/kg).
  11. Pesez la tumeur à l’aide d’une balance de précision comme à l’étape 2.2. Sectionnez la tumeur en deux à l’aide du scalpel. Placez la moitié dans un microtube de 1,5 mL, congelez-la dans de l’azote liquide et conservez-la à -80 °C pour des analyses moléculaires. Fixer l’autre moitié dans 5 mL de PFA à 4 % dans un tube conique de 15 mL pendant 24 h à 4 °C pour l’analyse histologique.
  12. Au 21e jour après l’injection, sacrifier les souris exposées au CO2 et prélever les poumons lors d’une perfusion intratrachéale avec 4 % de PFA, comme décrit ci-dessous. Travaillez sous une hotte.
    1. Ouvrez la cavité thoracique à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Retirez la peau de la région sous-maxillaire et des glandes salivaires pour exposer clairement la trachée.
    2. Préparez une seringue à aiguille de 22 G contenant une solution de PFA à 4 %. Insérez l’aiguille dans la trachée de la souris, en la dirigeant vers les poumons tout en serrant la trachée vers la tête. Injectez la solution jusqu’à ce que les poumons gonflent (environ 2 ml).
    3. Disséquez les poumons et placez-les dans un tube de 15 mL contenant une solution de PFA à 4 %. Retournez doucement le tube plusieurs fois et laissez-le fixer pendant 24 h à 4 °C.
  13. Effectuer des coupes semi-sérielles des poumons et colorer à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E), une tranche tous les 50/100 μm jusqu’à épuisement de l’échantillon, comme décrit dans la référence31.
  14. Marquez les métastases sur l’analyse guidée par logiciel des microphotographies des sections colorées par H&E.

10. Signatures d’expression génique

  1. Définissez une signature génétique comme décrit ci-dessous.
    1. En fonction du cadre expérimental et de la question biologique spécifique étudiée, obtenir une signature génétique de plusieurs manières. Le plus souvent, évaluez l’expression différentielle entre deux affections (p. ex., CAFs vs homologues normaux, ou traitées de plusieurs façons (p. ex., super-activées ou réduites au silence) vs non traitées.
    2. Vous pouvez également identifier les gènes les plus exprimés ou informatifs de manière variable dans les échantillons analysés (p. ex., les gènes à variance élevée ou à charges élevées sur les premiers composants d’une analyse en composantes principales). Ici, nous utiliserons une signature régulée par STAT3 à titre d’exemple. Cette signature a été définie comme les gènes régulés à la baisse lors du silençage de STAT3 dans les CAF29 de la Colombie-Britannique, comme décrit ci-dessous. Pour une description détaillée du séquençage de l’ARN, voir les références32,33.
  2. Extraire l’ARN total en trois exemplaires techniques de chaque échantillon comme à l’étape 4.1.1 et évaluer la qualité de l’ARN pour vérifier l’intégrité de l’ARN (RIN ≥ 9).
  3. Préparez des banques à partir de 2 μg d’ARN poly(A) sélectionné et séquencez-les. Nous avons utilisé la plateforme NextSeq 500.
  4. La carte se lit sur l’ensemble de référence Mus musculus mm9 à l’aide de TopHat v2.0. 1034.
  5. Calculez le nombre de gènes à l’aide de l’outil htseq-count du package HTSeq (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html).
  6. Effectuez une analyse d’expression différentielle à l’aide de R et du package DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html). Filtrez les gènes régulés à la baisse avec FDR < 0,05 pour définir la signature STAT3.

11. Estimation de l’expression de la signature dans les tumeurs primaires

REMARQUE : Les étapes suivantes décrivent une procédure permettant d’estimer par calcul l’expression de la signature29 régulée par STAT3 dans les données transcriptomiques accessibles au public des tumeurs primaires BC, en testant sa relation avec la proportion stromale estimée dans le même ensemble d’échantillons.

  1. Installez R (https://cran.r-project.org/) et RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/). Démarrez-le et installez les librairies requises : GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. Téléchargez les données primaires d’expression génique de la tumeur, telles que les données TCGA de https://portal.gdc.cancer.gov/, les données METABRIC de http://synapse.org/ (syn1757063) ou d’autres données transcriptomiques du Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) en tant que matrices d’expression pré-normalisées. Les données doivent être formatées sous la forme d’une matrice numérique avec des lignes en tant que gènes et des colonnes en tant qu’échantillons, et normalisées en fonction de la plate-forme et mises à l’échelle logarithmique à l’aide d’un décalage de 1.
    1. Téléchargez la liste des orthologues de gènes souris-humains de Biomart à l’https://www.ensembl.org/biomart/martview/, sélectionnez la base de données : ensembl genes, choisissez le jeu de données de gènes humains et cliquez sur la sélection d’attributs dans l’onglet de gauche.
    2. À partir des fonctionnalités présélectionnées, ouvrez l’onglet EXTERNE et marquez le symbole HGNC, sélectionnez Homologues dans la case en haut de la page, et marquez Orthologues de souris / Nom du gène de la souris.
    3. Cliquez sur le bouton Résultats dans le coin supérieur gauche, sélectionnez le format CSV, puis cliquez sur le bouton GO pour télécharger le fichier.
  3. Chargez la signature d’expression génique (un ensemble de gènes) dans R. Dans ce cas, nous utilisons la liste des gènes régulés à la baisse lors du silençage de STAT3 dans les CAF murins.
  4. Chargez la liste des orthologues du gène souris-humain dans R et mappez la signature STAT3 aux orthologues humains correspondants via la table Biomart.
  5. Chargez les données d’expression génique de la tumeur primaire dans R et appelez la fonction GSVA avec des paramètres en tant qu’objet ssgseaParam, y compris les données tumorales primaires et une liste comprenant la signature STAT3.

12. Tester la relation entre l’expression de la signature génétique et les caractéristiques cliniques

  1. Identifiez les variables d’intérêt. Le pourcentage stromal représente la proportion de cellules dans l’échantillon de tumeur séquencé appartenant au stroma tumoral. Utilisez les caractéristiques cliniques suivantes souvent associées aux données omiques : taille de la tumeur, stade, âge du patient au moment du diagnostic, statut des ganglions lymphatiques, statut des métastases, etc. Des estimations précalculées du pourcentage stromal sont disponibles pour le TCGA.
    REMARQUE : Plus précisément, les estimations stromales disponibles sont les suivantes : EDec Immune/Stromal = Déconvolution épigénomique du pourcentage stromal/immunitaire37 ; Score immunitaire = ssGSEA basé sur les profils d’expression génique de 141 gènes immunitaires38 ; LUMP = Leucocytes Unmethylation for Purity, qui compte en moyenne 44 sites CpG immunospécifiques non méthylés39 ; Score stromal = ssGSEA basé sur les profils d’expression génique de 141 gènes stromaux38 ; IHC = estimé par l’analyse d’images de lames colorées à l’hématoxyline et à l’éosine produites par le Nationwide Children’s Hospital Biospecimen Core Resource40 ; ABSOLU = basé sur les données somatiques de nombre de copies41.
  2. Téléchargez les données EDEc de http://genboree.org/theCommons/documents/569, les scores stromaux et immunitaires de https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2) et les données de pureté tumorale (LUMP, IHC, ABSOLUTE) de TCGAbiolinks. Pour les autres ensembles de données, calculez le pourcentage de stroma en utilisant le package GSVA, en calculant le ssGSEA pour le stroma et les signatures immunitaires obtenues de Yoshihara et al.38.
  3. Calculez la corrélation entre le vecteur numérique de la proportion stromale estimée et le vecteur numérique de l’expression de la signature STAT3 dans les échantillons de tumeurs primaires. Cela peut être réalisé avec la fonction cor.test dans R.
  4. Téléchargez les données cliniques associées à l’ensemble de données transcriptomiques des tumeurs primaires sous forme de tableau avec des échantillons en lignes et des caractéristiques cliniques en colonnes.
  5. Chargez les données cliniques dans R et vérifiez que les échantillons de la matrice transcriptomique et de la table de métadonnées sont dans le même ordre que la fonction de correspondance.
  6. Pour les variables numériques (par exemple, la taille de la tumeur), calculez la corrélation entre le vecteur numérique de l’expression de la signature STAT3 dans les échantillons de tumeurs primaires et le vecteur des valeurs des caractéristiques cliniques avec la fonction cor.test.
  7. Pour les variables catégorielles (par exemple, l’état des métastases), testez la différence d’expression de la signature STAT3 entre deux groupes d’échantillons (par exemple, tumeurs métastatiques ou non métastatiques) avec le test non paramétrique de la somme des rangs de Wilcoxon (en supposant que les deux groupes d’échantillons sont indépendants). Cela peut être réalisé avec la fonction wilcox.test dans R.

13. Tester la régulation de la signature dans le stroma tumoral

REMARQUE : L’expression d’une signature stromale dans des tumeurs primaires analysées par séquençage d’ARN en vrac présente l’avantage de s’appuyer sur de grandes cohortes de patients avec des annotations cliniques détaillées. D’autre part, seule la séparation du stroma et de l’épithélium permet de définir les changements d’expression génique dans l’un ou l’autre des deux compartiments cellulaires de la tumeur par rapport au tissu normal42. MetaLCM est une ShinyApp qui facilite l’analyse des ensembles de données transcriptomiques de tumeurs mammaires microdisséquées par capture laser. Grâce à cet outil, l’utilisateur peut rechercher des gènes robustes exprimés de manière différentielle entre deux affections à travers des ensembles de données transcriptomiques de tumeurs mammaires microdisséquées par capture laser et tester la régulation de signatures génétiques précédemment définies dans le stroma tumoral. Les étapes suivantes décrivent comment utiliser MetaLCM.

  1. Accédez à l’application à l’https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/ de lien. Pour lancer l’analyse, sélectionnez les caractéristiques des conditions comparées.
  2. Choisissez la direction de la comparaison. En choisissant des gènes régulés à la hausse, les gènes ayant une expression plus élevée dans la condition 1 sont montrés.
  3. Choisissez le seuil de valeur p pour l’expression différentielle et appuyez sur Exécuter pour exécuter l’analyse, et chaque fois que les paramètres sont modifiés.
  4. Pour limiter l’analyse à une liste de gènes prédéfinie, tapez des symboles de gènes séparés par des virgules ou importez un fichier CSV contenant des symboles de gènes dans une seule colonne.
  5. Appuyez sur Soumettre la liste de gènes pour importer les symboles de gènes. Appuyez sur Réinitialiser pour restaurer l’analyse en utilisant tous les gènes. Enregistrer la liste des gènes exprimés de manière différentielle : lorsqu’une liste de gènes est fournie, plusieurs corrections de tests sont effectuées sur ces gènes uniquement. Le tableau comprend le logFC moyen, la valeur p réduite et les valeurs logFC et p individuelles pour l’expression différentielle dans chaque ensemble de données disponible.
  6. Tracez une carte thermique avec les changements de pliage des gènes exprimés de manière différentielle. La carte thermique ne montre que les gènes exprimés de manière différentielle avec le signe complètement cohérent d’expression différentielle dans les ensembles de données.

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Résultats

Évaluation in vitro des activités des CAF
La contribution des fibroblastes associés au cancer (CAF) dérivés de tumeurs mammaires aux caractéristiques agressives du cancer du sein (CA) a été étudiée à l’aide de CAFs immortalisés (CAFs) générés selon l’étape 3. Les iCAFs ont été super-activés comme décrit à l’étape 6, puis affamés dans le sDMEM pour collecter leur CM, qui a été utilisé pour traiter les cellules 4T1 pendant 48 h (voir étape 7.1). Ce traitement a été suivi d’essa...

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Discussion

Dans cette étude, nous présentons des protocoles optimisés pour l’immortalisation des CAFs murins et la caractérisation de leurs activités pro-tumorigènes à la fois in vitro et in vivo. Plutôt que d’isoler sélectivement des sous-types spécifiques de CAF en fonction de l’expression des marqueurs, nous avons choisi de conserver l’ensemble de la population cellulaire pour préserver l’hétérogénéité. Les cellules ont été caractérisées fonctionnellement dans leur ensemble, et...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Association italienne de recherche sur le cancer (AIRC, IG16930 et IG24851 à V.P.) ; le ministère italien de l’Université et de la Recherche (MIUR PRIN 2017 et 2022 à V.P.) ; la Fondation Truus et Gerrit van Riemsdijk, Liechtenstein, don à V.P. ; Région du Piémont (Deflect). A.S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de la Fondation italienne pour la recherche sur le cancer (FIRC), et L.A. a été soutenu par la Fondazione Umberto Veronesi.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Échelle d’ADN de 1 Ko plusThermoFisher Scientific10787018
Plaque à 24 puitsSarstedt833922
Plaque à 96 puitsSarstedt833924
Acide acétiqueSigma Aldirch695092
AgeI-HFBiolabs de la Nouvelle-AngleterreR3552Conserver à -20 ° ; C
BétadineMeda Pharma23907076
Bü ; rker Chambre de comptage  ;VWR40443703
Cautérisation Basse Température FineTip DispKeelerAX10339KL
CentrifugeuseEppendorf5810R
Tube conique 15 mLSarstedt62554502
Tube conique 50 mLSarstedt62547254
Microtubes Cryopure 2 mLSarstedt72380992
Violet cristalSigma AldirchC0775Stocker chez RT, utiliser dans une hotte  ;
Plaque de culture 100 mm de diamètre  ;Sarstedt833902
Plaque de culture 60 mm de diamètre  ;Sarstedt833920
jjH20Fait maisonStocker chez RT, utilisation dans une hotte biologique
Pied à coulisse numériquePreciva02-301-2
Microscope numériqueLeicaDM6B
DiméthylsulfoxydeSigma AldirchD8418Utilisation dans une hotte biologique
Dulbecco' s Aigle modifié' s Moyen (DMEM)Gibco11965092Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
EcoRI-HFBiolabs de la Nouvelle-AngleterreRéf. R3101Conserver à -20 ° ; C
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma AldirchE6758Stocker chez RT, utilisation dans une hotte biologique
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco16000044Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Pointes filtrées 10 & micro ; LSarstedt703010255
Pointes filtrées 100 & micro ; LSarstedt703030255
Pointes filtrées 1000 & micro ; LSarstedt703060255
Pointes filtrées 20 & micro ; LSarstedt703030265
Embouts filtrés 200 & micro ; LSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 & micro ; m  ;Sarstedt831826102
Filtropur S Plus 0,45 & micro ; m  ;Sarstedt831826
Ciseaux fins2Biol1406009
Pince2Biol1102412
GénétiqueGibco10131035Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Réactif de transfection Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific11668019Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Chambres d’invasion Matrigel avec 8 &mu ; m membrane PET  ;Corning354480
Lecteur de microplaques (absorbance de 600 nm)PromegaRéf. GM3500
Microtubes 1,5 mL  ;Sarstedt7269001
OptimemGibco31985047Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Paraformaldéhyde (PFA)Sigma Aldirch158127Stocker chez RT, utiliser dans une hotte
pBABE-neo grandTcDNA  ;Addgene1780Conserver à -20 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
pCL-AmphoNovus Biological  ;18746853Conserver à -20 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
pCMV-R8.74Addgene22036Conserver à -20 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
pCMV-VSVG  ;Addgene8454Conserver à -20 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Pénicilline-Streptomycine (Pen Strepto, 10 000 &mu ; g/mL)  ;Gibco15140122Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Microscope à contraste de phase  ;Olympe  ;BX42
Saline tamponnée au phosphate  ; (Crédit : PBS)Fait maisonStocker chez RT, utilisation dans une hotte biologique
pLKO.1-Puro  ;Addgene10878Conserver à -20 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Solution de poly-L-lysineSigma AldirchRéf. P8920Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Dichlorhydrate de puromycine à partir de  ; Streptomyces albonigerSigma AldirchRéf. P8833
Tampon rCutSmart  ;Biolabs de la Nouvelle-AngleterreRéf. B6004Conserver à -20 ° ; C
Rasoir pour rongeursAesculapGT416
Institut commémoratif de Roswell Park (RPMI)Gibco61870010Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Écouvillons assoiffés à bout rondSigma AldirchZ744127
ScalpelGima27041
Secura Semi Micro BalanceSartoriusSECURA125-1S
Pipette sérologique 10 mL  ;Sarstedt861254001
Pipette sérologique 2 mL  ;Sarstedt861252001
Pipette sérologique 25 mL  ;Sarstedt861256001
Pipette sérologique 5 mL  ;Sarstedt861253001
Points de suture 5-0Éthicon1866G
Seringue 10 mLPentaferteRéférence 00202250E14
Seringue 5 mLPentaferteRéférence 00202250E12
Seringue Omnican Insuline 1 mLBraunRéférence 9151125S
Adhésif tissulaire3M Vetbond1469SB
Inserts Transwell 8 & micro ; m pore  ;Faucon353097
Inserts Transwell Matrigel 8 & micro ; m pore  ;Corning354480
Trypsine-EDTA (0,5 %), sans rouge de phénolGibco15400054
Concentrateur centrifuge Vivaspin 20 MWCO 10 000 Da  ;Sigma AldirchZ614602

Références

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