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Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes associés au cancer de la prostate

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DOI :

10.3791/68367

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1 août 2025

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1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit une procédure complète pour isoler, étendre et immortaliser les fibroblastes des prostatectomies radicales. De plus, il décrit des tests développés pour évaluer les effets fonctionnels de la diaphonie fibroblaste-cellule tumorale, en tirant parti à la fois du traitement avec un milieu conditionné et de la co-culture.

Résumé

Le stroma tumoral peut être activement façonné par les cellules tumorales pour adopter des propriétés pro-tumorigènes, ce qui en fait un point central de la recherche sur le cancer. Parmi les composants stromaux, les fibroblastes associés au cancer (CAF) - souvent le type de cellule le plus abondant dans le microenvironnement tumoral (TME) - jouent un rôle central dans la promotion de la progression du cancer grâce à leurs interactions avec les cellules tumorales et d’autres composants stromaux. Pour élucider les mécanismes à l’origine de ces interactions, il faut des méthodes robustes pour isoler et caractériser les CAF, ce qui peut également jeter les bases du développement de nouvelles thérapies anticancéreuses ciblant les CAF. Cette étude présente une méthode pour isoler les fibroblastes de la tumeur et des régions normales adjacentes d’échantillons de prostatectomie radicale obtenus chez des patients atteints de cancer de la prostate (PCa). Cette approche permet d’isoler simultanément les FAC et leurs homologues normaux (NF) d’un même individu, ce qui fournit un système expérimental apparié. Des protocoles détaillés sont prévus pour la maintenance des CAF et NF primaires pour les analyses in vitro en aval, ainsi que pour leur immortalisation afin de faciliter les études à long terme. Nous décrivons également des tests fonctionnels conçus pour comparer les effets des CAF et des NF sur les comportements des cellules cancéreuses, y compris la prolifération, la migration et la croissance indépendante de l’ancrage. Deux approches complémentaires sont détaillées : le traitement des cellules cancéreuses avec des milieux conditionnés (CM) dérivés de fibroblastes, et la co-culture directe de fibroblastes avec des cellules tumorales. Ensemble, ces méthodologies représentent une boîte à outils complète pour étudier l’interaction dynamique entre les CAF et les cellules tumorales, non seulement dans la PCa, mais potentiellement dans une gamme de cancers humains. De plus, la caractérisation moléculaire de ces interactions pourrait révéler des médiateurs clés de l’oncogenèse induite par les CAF, offrant des cibles prometteuses pour une intervention thérapeutique.

Introduction

Le cancer de la prostate (PCa) est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes dans près des deux tiers des pays du monde. En 2022, environ 1,5 million de nouveaux cas ont été signalés, entraînant 3 97 000 décès dans le monde. Ces chiffres font de la PCa le deuxième cancer le plus fréquent et la cinquième cause de mortalité liée au cancer chez les hommes1.

La PCa est une maladie multifocale et biologiquement complexe, caractérisée par une hétérogénéité intertumorale substantielle 2,3,4, divers sous-types moléculaires et des résultats cliniques variables 5,6, qui influencent tous de manière significative le pronostic et la réponse thérapeutique7.

Bien que le rôle critique du microenvironnement tumoral (TME) dans l’initiation et la progression de la tumeur de la prostate soit bien établi 8,9, les interactions moléculaires entre les cellules tumorales et le compartiment stromal environnant restent incomplètement comprises. Bien qu’il soit bien établi que le microenvironnement tumoral de la prostate (TME) joue un rôle essentiel dans l’initiation et la progression de la tumeur, les interactions moléculaires entre les cellules tumorales et le stroma environnant restent insuffisamment définies. L’EUT comprend une variété de cellules stromales, y compris celles d’origine mésenchymateuse et immunitaire, qui s’activent en réponse à des signaux dérivés de la tumeur et acquièrent par la suite des fonctions de promotion tumorale10,11. Parmi ceux-ci, les fibroblastes associés au cancer (CAF) représentent souvent la population stromale la plus abondante. Les CAF contribuent au remodelage de la matrice extracellulaire (ECM), favorisent la croissance tumorale et facilitent l’invasion et la migration des cellules cancéreuses 4,11,12,13. Par le biais de facteurs sécrétés et d’interactions directes entre cellules, les CAF influencent également la prolifération, l’invasion et la résistance aux traitements. Notamment, les CAF sont une population hétérogène. Bien qu’ils soient généralement associés à des fonctions pro-tumorigènes, certains sous-types peuvent exercer des rôles suppresseurs de tumeurs14,15. Il est important de noter que l’absence de marqueurs uniques pour les FAC pose des défis pour leur identification précise et la dissection fonctionnelle de leurs divers rôles12,16.

Une approche robuste pour étudier la diaphonie fonctionnelle entre les CAF et les cellules tumorales consiste à isoler les CAF primaires et les fibroblastes normaux (NF) appariés, puis à évaluer leur influence respective sur les comportements des cellules tumorales telles que la prolifération, la migration, la formation de colonies et la croissance indépendante de l’ancrage 17,18,19 . Cet article décrit un protocole raffiné et hautement reproductible pour isoler les CAF et les NF à partir d’échantillons de prostatectomie radicale de patients atteints de PCa à haut risque. Un élément essentiel de ce protocole est l’identification et la dissection précises de la tumeur et des régions exemptes de tumeur par un uropathologiste expert, permettant de dériver les CAF et les NF à partir du même patient. Cette approche d’échantillonnage apparié permet de contrôler l’hétérogénéité intertumorale et les variables spécifiques aux patients qui peuvent influencer les phénotypes 20,21,22 des fibroblastes. Pour s’assurer qu’une quantité suffisante de tissu tumoral est disponible, nous nous concentrons sur les échantillons provenant de patients ayant un score de Gleason de ≥7.

La caractérisation phénotypique fiable des fibroblastes isolés nécessite l’utilisation de plusieurs marqueurs pour les distinguer des autres types de cellules, en particulier des cellules épithéliales, qui peuvent partager l’expression de marqueurs16 qui se chevauchent. Comme les fibroblastes primaires de la PCa subissent généralement une sénescence après 10 à 15 passages, ce qui complique les analyses à long terme, nous présentons également un protocole d’immortalisation cellulaire via l’expression stable de la télomérase humaine (hTERT)23.

Pour explorer les effets fonctionnels des CAF et des NF sur les cellules tumorales, nous avons testé et optimisé plusieurs stratégies expérimentales. Étant donné que les CAF exercent leur influence à la fois par des facteurs sécrétés et par le contact direct cellule-cellule24, deux systèmes de test complémentaires sont développés : (1) le traitement des cellules cancéreuses avec un milieu conditionné aux fibroblastes (CM), et (2) la co-culture directe de fibroblastes et de cellules tumorales. Ces tests évaluent les principales propriétés des cellules cancéreuses, notamment la prolifération, la croissance indépendante de l’ancrage et la migration. Pour standardiser l’influence des facteurs sécrétés, les milieux conditionnés des CAF et des NF ont été concentrés et quantifiés (conCM) sur la base de la teneur totale en protéines.

La mise en évidence d’effets fonctionnels significatifs grâce à ces tests peut soutenir l’identification de médiateurs critiques de la tumorigenèse induite par les CAF, offrant ainsi des cibles potentielles pour une intervention thérapeutique.

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Protocole

Cette étude a été menée dans le plein respect des directives institutionnelles pour l’utilisation d’échantillons cliniques, telles qu’approuvées par le Comité de bioéthique de l’hôpital Città della Salute Molinette de Turin, en Italie. Tous les échantillons ont été obtenus après la signature du consentement éclairé des patients participants. La section suivante fournit un protocole détaillé, étape par étape, pour l’isolement des fibroblastes associés au cancer (CAF) et de leurs homologues fibroblastes normaux (NF) compatibles. Le protocole comprend la dissection de la tumeur et des zones non tumorales adjacentes, le traitement des tissus, la culture cellulaire et la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules isolées. Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité certifiée. Les cellules ont été cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 à l’aide d’un milieu Dulbecco’s Eagle modifié (cDMEM) complet, complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine, sauf indication contraire. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées avec le frein engagé. Reportez-vous à la table des matériaux pour une liste complète des réactifs, des matériaux et de l’équipement utilisés tout au long du protocole. Cette méthodologie a été optimisée pour les échantillons de cancer de la prostate à haut risque, avec un score de Gleason de 4+3 ou plus.

1. Dissection d’échantillon chirurgical

REMARQUE : Cette procédure a été réalisée sur des échantillons chirurgicaux prélevés lors d’interventions de prostatectomie radicale25 effectuées sur des patients atteints d’un cancer de la prostate de haut grade (PCa), et prise en charge selon des protocoles standardisés, basés sur des directives institutionnelles internes et la littérature internationale établie et les meilleures pratiques 26,27,28.

  1. Placez la prostate sous une cagoule de biosécurité sur un champ stérile et orientez-la en fonction de repères anatomiques.
    REMARQUE : Cette procédure doit être effectuée par un uropathologiste expérimenté.
  2. À l’aide d’une lame stérile, des tranches de tissu d’accise provenant de zones identifiées dans le rapport de biopsie préopératoire sont néoplasiques ou exemptes de cellules tumorales.
  3. Effectuer une analyse cryostatique rapide29 sur les deux échantillons de tissus, en préparant des coupes de tissus de 2,5 μm d’épaisseur et en les colorant à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour vérifier la présence ou l’absence de cellules tumorales dans les régions sélectionnées, conformément aux critères de diagnostic de l’adénocarcinome prostatique de la dernière édition de la classification30 de l’OMS (voir Figure 1A).
    REMARQUE : En cas de divergence, répéter le processus d’échantillonnage jusqu’à ce que la confirmation histologique des zones néoplasiques et non néoplasiques soit obtenue.
  4. Excisez environ 10mm2 d’échantillons dans les régions néoplasiques et non néoplasiques, placez-les dans des tubes coniques de 15 mL contenant 7 mL de tampon de stockage de tissus glacé et conservez-les sur de la glace pour les procédures ultérieures.
    REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à 4 °C jusqu’à 48 h dans ce tampon.

2. Isolement des fibroblastes

REMARQUE : Toutes les procédures de traitement suivantes doivent être effectuées sur de la glace à 4 °C, sauf indication contraire. Voir la figure 1 A pour un schéma.

  1. Jour 1 : Pesez les échantillons de tissus.
    REMARQUE : 70-100 mg sont obtenus en moyenne.
  2. Passez à des plats de 6 cm et effectuez quatre lavages séquentiels, deux fois dans 4 mL de PBS glacé et deux fois dans 4 mL de cDMEM glacé, tous deux complétés par 200 U/mL de pénicilline, 200 μg/mL de streptomycine (2x), à l’aide d’une pince stérile pour transférer le tissu d’une boîte à l’autre.
  3. Perturber mécaniquement le tissu en le plaçant dans une plaque de 6 cm sur de la glace, avec 1 mL de DMEM complété par 100 U/mL de pénicilline-G et 100 μg/mL de streptomycine, puis le hacher en petits fragments (<1 mm2) à l’aide de ciseaux ou de lames.
  4. Transférer dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de cDMEM glacé. Centrifugeuse à 754 x g pendant 5 min à 4 °C.
  5. À l’aide d’une pipette de 10 ml, retirer délicatement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de cDMEM glacé. Centrifuger à nouveau à 754 x g pendant 5 min à 4 °C.
  6. Retirer le surnageant comme ci-dessus et remettre en suspension la pastille dans la collagénase II (1 mg/mL dans le DMEM), en utilisant 1 mL/100 mg de tissu. Passez à un microtube de 1,5 ml.
    REMARQUE : En raison de la variabilité des lots de collagénase, testez différents lots et assurez-vous qu’ils en ont suffisamment pour effectuer toutes les isolations prévues.
  7. Couvrir les tubes d’un film de paraffine et faire digérer les échantillons O/N (8-12 h) à 37 °C avec un balancement continu.
    REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes le jour 2.
  8. Transvaser les échantillons dans des tubes coniques de 15 mL et ajouter 5 mL de cDMEM glacé à la suspension cellulaire pour inactiver la collagénase, puis centrifuger à 754 x g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE : La collagénase est éliminée en l’aspirant dans un récipient contenant un détergent.
  9. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de trypsine/EDTA à 0,05 %. Incuber pendant 5 min à 37 °C en secouant de temps en temps.
  10. Ajouter 1 mL de DNase I aux échantillons et bien mélanger. Utilisez une solution fraîchement préparée à 25 mg/mL dans du PBS.
    REMARQUE : Le traitement par DNase I à ce stade permet d’obtenir la solution unicellulaire.
  11. Centrifugeuse à 754 x g pendant 5 min à 4 °C.
  12. À l’aide d’une pipette de 10 ml, aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 5 ml de cDMEM froid. Centrifugeuse à 754 x g pendant 5 min 4 °C.
  13. Remettre en suspension les cellules dans 20 % FBS cDMEM. Dresser et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité pendant au moins 3 jours. Veillez à ne pas déplacer/incliner le plat. Pour 70 à 100 mg de tissu, répartir la suspension cellulaire dans 2 boîtes de 3,5 cm, dans 2 mL de milieu. Réduisez l’échelle en conséquence si nécessaire.
    REMARQUE : Moins de 50 mg de tissu entraînera une dérivation cellulaire inefficace. Le schéma de fractionnement et de congélation est illustré à la figure 1B.
  14. Après 3 jours, vérifiez la morphologie/viabilité des cellules et remplacez les 2/3 du milieu pour maintenir les facteurs de croissance produits par les cellules. Il faudra environ 7 à 10 jours pour que les cellules atteignent la confluence, en remplaçant le milieu tous les deux jours.
  15. Une fois confluentes, passez les cellules dans une boîte de 10 cm dans 20 % de FBS cDMEM.
  16. Remplacez le milieu tous les deux jours, en utilisant un milieu FBS à 15 % deux fois, puis une fois, 12,5 %, puis 10 %. Pour les analyses FACS, l’extraction de l’ARN et des protéines et la congélation des stocks suivent le schéma de la figure 1B.
  17. Cellules divisées lorsqu’elles sont confluentes à environ 100 % (environ 10 jours). Lavez 2-3 fois avec beaucoup de PBS pendant 5 min chacune. Ajouter 1 % de trypsine/EDTA (2x) et placer dans l’incubateur, en vérifiant le détachement cellulaire toutes les quelques minutes.

3. Condition de culture

  1. Ne passez les cellules que lorsque 100 % confluent, pas plus de 1:3.
  2. Congeler les aliquotes correspondant à 50 % d’une parabole confluente de 10 cm dans 0,5 mL de produit de congélation glacé (10 % de DMSO dans le FBS). Décongeler chaque aliquote dans un plat de 10 cm.
    REMARQUE : Le temps moyen de doublage est de 80-90 h.

4. Analyse FACS

REMARQUE : Ce protocole assure une caractérisation fiable de la population de fibroblastes et identifie la contamination potentielle par les cellules épithéliales, endothéliales ou immunitaires. L’analyse FACS est effectuée dans le passage 2, comme illustré à la figure 2A.

  1. Récoltez les cellules et mettez-les en suspension dans un tampon FACS (PBS plus 2 % FBS) à une concentration de 106 cellules/mL.
  2. Étiquetez les tubes de cytométrie en flux et ajoutez 1 x 105 cellules dans un volume de 100 μL dans chacun d’eux. Pour la coloration avec 4 anticorps, préparez 11 tubes pour tenir compte à la fois de la coloration et de la gâche, comme suit (Tableau 1)
    REMARQUE : 1 tube, sans anticorps (témoin non coloré), pour évaluer l’autofluorescence cellulaire, 1 tube avec contrôle isotype d’anticorps, pour évaluer la liaison aspécifique, 4 tubes, chacun avec un seul anticorps, pour la compensation ; des billes de compensation peuvent remplacer les cellules, 4 tubes de fluorescence moins un (FMO) pour le gating, chacun laissant de côté l’un des anticorps, 1 tube avec les 4 anticorps (échantillon réel). Les anticorps marqués par fluorescence suivants sont utilisés (voir le tableau des matériaux) : (1) Anti-EpCAM-PE (marqueur de cellules épithéliales), (2) Anti-CD31-VioBlue (marqueur de cellules endothéliales), (3) Anti-CD45-FITC (marqueur de cellules immunitaires), (4) Anti-CD90-APC (marqueur de cellules de fibroblastes). Des anticorps conjugués à d’autres fluorophores peuvent être utilisés, en fonction des filtres de cytomètre en flux disponibles. Effectuez toutes les étapes sur la glace pour préserver la viabilité cellulaire.
  3. Incuber des cellules avec des bloqueurs des récepteurs cristallisables par fragments (FcR), tels que des anticorps anti-CD16/CD32 purifiés ou un tampon bloquant (PBS 1 % à 2 % BSA). Utiliser 1 à 5 μL de réactif bloquant FcR par 100 μL de suspension cellulaire et incuber à 4 °C pendant 10 à 15 min.
  4. Procédez directement à la coloration sans laver. Ajouter des dilutions d’anticorps appropriées ou les témoins d’isotypes correspondants dans les tubes, comme indiqué dans le tableau 1.
  5. Mélangez délicatement et laissez incuber à 4 °C dans l’obscurité pendant 30 min.
  6. Laver avec 2 ml de tampon FACS.
  7. Centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g, à 4 °C.
  8. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de tampon FACS frais.
  9. Ajouter un colorant de viabilité (iodure de propidium) selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  10. Acquérez les échantillons sur un cytomètre en flux.
  11. Utilisez les commandes de compensation à coloration unique pour configurer la matrice de compensation. Pour l’analyse des données, appliquez la stratégie de contrôle suivante sur les tracés de densité FACS :
  12. Barrière de diffusion avant et latérale : tracer FSC-A en fonction de SSC-A et concevoir une région autour de la population cellulaire principale pour exclure les débris cellulaires.
  13. Pour l’exclusion du doublet : graphique FSC-A vs. FSC-W (ou FSC-H vs. FSC-A) et concevoir une région pour exclure les amas de cellules, qui montreront une largeur accrue par rapport à la surface (ou une surface accrue par rapport à la hauteur). Sélectionnez les cellules individuelles et effectuez la même procédure, en traçant SSC-A vs. SSC-W (ou SSC-H vs. SSC-A) pour augmenter la pureté de la population de la cellule unique.
  14. Tracez le colorant de viabilité (c’est-à-dire l’iodure de propidium) par rapport à SSC-A et sélectionner des cellules vivantes négatives.
  15. Sur des cellules vivantes, tracez CD326 (axe des x) en fonction de CD31 (axe des y) ; utilisez les échantillons FMO correspondants pour régler avec précision les portes. FMO permet de tenir compte de la propagation de la fluorescence dans un canal spécifique causée par les autres fluorophores.
    1. En regardant l’échantillon de CD326 FMO, dessinez une porte de quadrant qui inclut toutes les cellules des quadrants de gauche (c’est-à-dire négative pour CD326). Répétez la même procédure en utilisant l’échantillon FMO CD31 pour ajuster la porte afin d’avoir toutes les cellules FMO dans les quadrants inférieurs (c’est-à-dire négatifs pour CD31). Utilisez ce quadrant pour analyser les échantillons et sélectionnez les cellules dans le quadrant inférieur gauche (CD31- CD326-).
  16. Répétez la même procédure en traçant CD326 (axe des x) vs. CD45 (axe y), en utilisant le FMO CD326 et le FMO CD45 pour régler la porte du quadrant. Utilisez ce quadrant pour analyser tous les échantillons et sélectionner des cellules dans le quadrant inférieur gauche (CD45- CD326-).
  17. Intrigue CD90 vs. SSC-A et utilisez le FMO CD90 pour définir une région qui exclut les cellules négatives et inclut uniquement CD90+. Utilisez cette région pour analyser tous les échantillons, en mesurant le pourcentage de cellules CD90+ . Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 2A.

5. L’immortalisation des fibroblastes

REMARQUE : L’immortalisation des populations de CAF et de NF est réalisée par transduction stable avec un vecteur rétroviral exprimant hTERT. Vous trouverez ci-dessous les protocoles pour préparer les particules pseudovirales infectieuses et transduire les cellules.

  1. Production de particules rétrovirales
    1. Jour 1, enrobage de poly-L-lysine et placage des cellules : Enduire une boîte de 10 cm avec 6 ml de solution de poly-L-lysine (0,1 mg/mL dans H2O), incuber 5 min sous le capot TC, aspirer et laisser sécher le plat ouvert sous le capot avant de plaquer 3 x 106 HEK293T cellules.
    2. Jour 2 : Ajouter 30 μL de réactif de transfection médié par les lipides cationiques à 0,75 mL de milieu optimisé pour la lipofection sans antibiotique.
    3. En parallèle, ajouter 2 μg de vecteur d’emballage de rétrovirus pCL-Ampho et 2 μg de plasmides pBABE-puro-hTERT à 0,75 mL supplémentaire de milieu optimisé pour la lipofection sans antibiotiques.
    4. Incuber pendant 5 min à RT.
    5. Mélangez les deux dilutions dans un tube conique de 15 mL et incubez pendant 20 min à RT.
    6. Pendant ce temps, remplacez le milieu HEK293T par 6 ml de milieu optimisé pour la lipofection complété par 10 % de FBS.
    7. Répartissez doucement les complexes d’ADN sur la surface de la parabole et incubez pendant 6 h à H/N dans un incubateur de CO2 humidifié.
    8. Jour 3 : Remplacer le milieu par 7 mL de cDMEM et incuber pendant 48 h.
      REMARQUE : À partir de cette étape, le travail doit être effectué dans une installation de culture tissulaire de niveau de biosécurité 3 (BSL3), conformément aux règles de l’établissement.
    9. Le jour 5, prélever le milieu contenant le virus et filtrer à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
    10. Aliquote et conserver à -80 °C.
  2. Transduction virale
    1. Jour 1 : Plaque de fibroblastes à faible passage à 60 % de confluence dans 2 puits d’une plaque de 6 puits.
    2. Jour 2 : Remplacer le milieu par 1 mL de la préparation rétrovirale pBABE-puro-hTERT précédemment produite contenant 8 μg/mL de polybrène et incuber pendant 12 à 16 h.
    3. Jour 3 : Remplacer le milieu contenant le virus par 2 ml de cDMEM.
    4. Jour 4 : Après 24 h, commencer deux cycles de sélection de puromycine (2 μg/mL) de 48 h.
      REMARQUE : La concentration doit être déterminée empiriquement pour chaque lot d’antibiotiques et de type cellulaire, et la concentration la plus faible doit être choisie pour tuer toutes les cellules dans les 4 jours suivant la sélection.
    5. Jour 8 : Vérifiez que les cellules témoins non infectées sont toutes mortes. Remplacez le milieu par du cDMEM et laissez les cellules infectées se développer jusqu’à ce qu’elles confluent avant de les faire passer 1:3. Laissez les cellules atteindre la confluence et se divisent à nouveau 1:3. À ce stade, les cellules peuvent quitter l’installation BLS3.
      REMARQUE : Préparez les aliquotes congelées dès que possible. Pour s’assurer que l’immortalisation a eu lieu, passez les cellules 5 à 6 fois et notez leur morphologie et leurs taux de duplication, qui ne devraient pas changer avec les passages. Comparez fonctionnellement les cellules immortalisées à leurs homologues primaires, en utilisant les méthodes décrites ci-dessous.

6. Caractérisation des fibroblastes

  1. Analyser phénotypiquement les cellules isolées pour l’expression de marqueurs CAF/NF, et caractériser fonctionnellement leurs activités pro-oncogéniques potentielles sur les cellules tumorales.
    REMARQUE : Les oligonucléotides et les anticorps qPCR optimisés pour évaluer les niveaux d’expression des marqueurs aux niveaux de l’ARN et des protéines sont rapportés dans le Tableau 2 et le Tableau des matériaux, respectivement. Attention, les anticorps contre la protéine d’activation des fibroblastes (FAP) sont souvent non spécifiques. Assurez-vous d’inclure les commandes positives et négatives appropriées31,32. Différentes méthodes peuvent être utilisées pour évaluer l’interaction entre les fibroblastes et les cellules tumorales. Ici, deux approches alternatives sont décrites, consistant soit à traiter les cellules tumorales avec un milieu conditionné (CM) dérivé des CAF ou des NF, soit à co-cultiver des fibroblastes et des cellules tumorales. L’efficacité de l’une ou l’autre approche pour améliorer la prolifération des cellules tumorales est décrite.

7. Préparation et concentration du milieu conditionné

REMARQUE : Le milieu conditionné est concentré et dosé avec précision après la collecte pour faciliter la comparaison entre différentes cellules.

  1. Plaquez les cellules à 70 % de confluence dans une boîte de 15 cm dans cDMEM.
  2. Le lendemain, passer à 15 mL de milieu de famine (DMEM sans FBS) et incuber pendant 48 h pour produire le CM.
  3. Recueillir le CM, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à RT et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les débris cellulaires et stériliser.
  4. Transfert dans des tubes à concentration (MWCO 10 000 Da), et centrifugeuse 20 min à 2000 x g et 4 °C, ou selon les instructions du fabricant, pour obtenir environ 1 mL de CM concentré (conCM), soit 15 x concentration.
  5. Aliquote le conCM et rangez-le à -80 °C.
  6. Quantifier la teneur en protéines du conCM collecté à l’aide d’un dosage colorimétrique des protéines.
    REMARQUE : La concentration moyenne obtenue est de 0,5 et 2 μg/μL. Des concentrations inférieures peuvent toujours être utilisées.

8. Essai de prolifération

REMARQUE : La prolifération cellulaire (à l’aide de lignées cellulaires humaines PCa DU145 ou LNCaP) a été évaluée à l’aide d’un instrument d’analyse de cellules vivantes dans deux contextes différents, soit en traitant les cellules tumorales avec des conCM, soit en les co-cultivant avec des CAF ou des NF. Dans ce cas, des cellules tumorales fluorescentes doivent être utilisées. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 3.

  1. Dosage de la prolifération lors du traitement par conCM
    REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour les cellules DU145 ; Différentes cellules peuvent nécessiter des ajustements.
    1. Cellules tumorales en plaque dans cDMEM dans une plaque de 96 puits (750 cellules/puits), en considérant au moins 3 réplicats par condition, et incuber O/N.
    2. Remplacer le cDMEM par un milieu de famine, complété ou non, par 50 μg/mL de conCM.
    3. Transférez la plaque dans la chambre de l’instrument d’analyse de cellules vivantes à l’intérieur de l’incubateur.
    4. Laisser chauffer à 37 °C pendant 30 min, puis commencer le premier balayage.
    5. Utilisez le canal de contraste de phase, en choisissant un objectif approprié et le nombre de champs/puits souhaités (objectif 10x et 5 champs/puits sont recommandés) et le type de balayage standard. Balayage toutes les 6 h pendant 4 à 5 jours (la durée doit être déterminée empiriquement pour les affections et les types de cellules).
    6. Effectuez l’analyse selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    7. Calculez pour chaque puits (répliquatifs techniques pour chaque condition) la variation du pli par rapport à sa valeur au temps zéro. Générez les graphiques correspondants et évaluez la signification statistique à l’aide d’un logiciel approprié.
  2. Essai de prolifération lors de la co-culture
    1. Co-plaque 750 cellules DU145 exprimant RFP et CAFs ou NF à un rapport de 1:3 dans cDMEM dans une plaque à 96 puits.
    2. Le lendemain, passez à 2 % FBS DMEM. Transférez la plaque dans la chambre de l’instrument d’analyse de cellules vivantes dans l’incubateur et commencez le balayage standard toutes les 6 heures pendant 4 jours, en utilisant à la fois le contraste de phase et le canal orange.
    3. Effectuer l’analyse de la prolifération selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    4. Calculez pour chaque puits (répliquatifs techniques pour chaque condition) la variation du pli par rapport à sa valeur au temps zéro. Générez les graphiques correspondants et évaluez la signification statistique à l’aide d’un logiciel approprié.

9. Essai de migration de cicatrisation des plaies

REMARQUE : Ici, une version automatisée du test scratchclassique 33 est présentée pour mesurer la migration cellulaire, à l’aide d’un instrument d’analyse de cellules vivantes.

  1. Cellules tumorales en plaque dans une plaque de 96 puits adaptée à l’instrument d’analyse de cellules vivantes pour obtenir une monocouche confluente.
  2. Le lendemain, traitez les cellules avec 10 μg/mL de mitomycine C pendant 2 h.
    REMARQUE : Cette étape est essentielle pour éviter la prolifération cellulaire pendant le test, ce qui fausserait les résultats.
  3. Appliquez l’égratignure sur les puits en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  4. Laver avec 100 μL de PBS pour éliminer les cellules détachées.
  5. Ajouter un milieu de famine, avec 50 mg/mL ou sans (témoin).
  6. Placez la plaque dans la chambre d’analyse des cellules vivantes de l’incubateur.
  7. Après 30 min, programmez le protocole de balayage de cicatrisation recommandé, toutes les 4 h pendant 1 jour ou plus, selon les cellules et les conditions.
  8. Analysez les résultats selon les instructions du fabricant (voir Tableau des matériaux).

10. Croissance indépendante de l’ancrage par dosage de gélose molle

  1. Plaquez des CAF ou des NF à 70 % de confluence dans des plaques à 12 puits, en laissant trois puits vides comme contrôle.
  2. Le lendemain, préparer une solution mère de gélose molle 4x (3,6 %) en ajoutant 0,45 g de gélose à bas point de fusion à 12,5 mL de PBS dans un tube conique de 50 mL dans des conditions stériles.
  3. Dissoudre dans un four à micro-ondes. Attention à l’ébullition excessive qui entraînerait la concentration de la solution.
  4. Refroidir à 37 °C, puis préparer une solution de travail 1x en diluant 1:4 avec du cDMEM préchauffé.
  5. Aspirer le milieu de la plaque à 12 puits et ajouter 500 μL de solution de gélose 1x dans chaque puits.
  6. Laisser solidifier pendant 20 min à 4 °C, tout en conservant le reste de la solution de gélose à 37 °C.
  7. Pendant ce temps, trypsinisez les cellules tumorales et préparez une suspension cellulaire de 2 x 104 cellules/mL.
  8. Mélangez des volumes égaux de suspension cellulaire et de solution de gélose 1x en pipetant plusieurs fois, et distribuez 500 μL (c’est-à-dire 5000 cellules) sur la première couche de gélose dans chaque puits. Assurez-vous de préparer un excès d’au moins 10 % de suspension cellulaire.
  9. Laisser la gélose se solidifier en l’incubant pendant 20 min à 4 °C.
  10. Ajoutez 1 ml de cDMEM dans chaque puits et renouvelez-le tous les deux jours en aspirant doucement le milieu à partir du bord du puits et en ajoutant le milieu frais au centre, presque dans le sens de la goutte pour éviter de déplacer la couche de gélose molle.
  11. Incuber jusqu’à ce que des colonies facilement visibles apparaissent. Les cellules DU145 prennent généralement environ 12 jours, avec de légères variations.
  12. Jeter le milieu et colorer les colonies en ajoutant 200 μL de solution de chlorure de tétrazolium nitrobleu (1 mg/mL dans du PBS). Incuber une nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié.
  13. Une fois les colonies colorées, jetez la solution de colorant et obtenez des images à l’aide d’un stéréomicroscope. Placez la plaque sur la platine du microscope et réglez le grossissement sur sa valeur la plus basse (0,8x) pour vous assurer que tout le puits est visible. Utilisez le bouton de mise au point grossière pour mettre les colonies au point, puis ajustez les paramètres d’éclairage et de mode avant de capturer les images.
  14. À l’aide d’un logiciel approprié34 , quantifier le nombre de colonies et la superficie occupée en suivant les étapes indiquées dans le fichier supplémentaire 1.
  15. Noter la distribution du nombre et de la taille des colonies (voir la figure 4).

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Résultats

Des paires CAF et NF de 7 patients atteints de PCa de haut grade ont été isolées avec succès avec ce protocole. L’âge des patients au moment de la chirurgie et les scores de Gleason sont résumés dans le tableau 3. Pour évaluer la pureté des populations de fibroblastes dérivées, deux CAF et NF primaires ont été détachés et colorés avec les anticorps fluorescents indiqués ou avec de l’iodure de propidium pour évaluer l’apoptose. Les résultats représentatifs de l’analyse FA...

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Discussion

La dérivation et l’analyse de cellules à partir de tissus PCa fournissent un modèle expérimental pertinent, d’autant plus que les modèles animaux disponibles ne reproduisent pas entièrement l’anatomie de la prostate humaine et la progression de la maladie37. Les glandes prostatiques des chimpanzés sont anatomiquement similaires à celles des humains, mais présentent une progression lente et stochastique de la maladie, en plus d’impliquer des limites éthiques. La st...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Association italienne de recherche sur le cancer (AIRC), IG16930 et IG24851 à V.P ; le ministère italien de l’Université et de la Recherche (MIUR PRIN 2017 et 2022 à V.P.) ; la Fondation Truus et Gerrit van Riemsdijk, Liechtenstein, don à V.P. ; Région du Piémont (Deflect). A.S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de la Fondation italienne pour la recherche sur le cancer (FIRC), et L.A. a été soutenu par la Fondazione Umberto Veronesi. Graphique 2 a été créé avec BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque à 12 puitsSarstedt833921
Plaque à 24 puitsSarstedt833922
Plaque à 6 puitsSarstedt833920
Plaque à 96 puitsSarstedt833924
Anticorps anti-GAPDH souris (6C5)Sigma AldrichRéf. CB1001Source : Souris ; Dilution pour WB : 1:1000
aSMASigma AldrichA5228  ;Source : Souris ; Dilution pour WB : 1:3000
CavéolineTechnologie de signalisation cellulaireCST3267Source : Lapin ; Dilution pour WB : 1:1000
CD31-VioBlueMilteny Biotec130-119-980Cytométrie en flux Ab, Marqueur de cellules endothéliales
CD326-PE (EpCAM)Milteny Biotec130113-826Cytométrie en flux Ab, Marqueur de cellules épithéliales
CD45-FITCMilteny Biotec130-110769Cytométrie en flux Ab, marqueur panleucocytaire
CD90-APCMilteny Biotec130-114-903Cytométrie en flux Ab, marqueur de fibroblaste
Collagène VI (COL6A1)AbcamAB182744Source : Lapin ; Dilution pour WB : 1:1000
Tube conique 15 mLSarstedt62554502
Tube conique 50 mLSarstedt62547254
Microtubes Cryopure 2 mLSarstedt72380992
Plaque de culture 100 mm de diamètre  ;Corning353003
Plaque de culture 100 mm de diamètre  ;Corning353025
Plaque de culture 60 mm de diamètre  ;Corning353002
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma AldirchD8418Utilisation dans une hotte biologique
Dulbecco' s Aigle modifié' s Moyen (DMEM)Gibco11965092Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
FAPAbcamAB53066Source : Lapin ; Dilution pour la balance bal : 1:500
Réactif de blocage FcR, humainMilteny Biotec130-059-901Bloqueur Fc
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco16000044Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Pointes filtrées 10 & micro ; LSarstedt703010255
Pointes filtrées 100 & micro ; LSarstedt703030255
Pointes filtrées 1000 & micro ; LSarstedt703060255
Pointes filtrées 20 & micro ; LSarstedt703030265
Embouts filtrés 200 & micro ; LSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 & micro ; m  ;Sarstedt831826102
Pince2Biol1102412
FSP1/S100A4Technologie de signalisation cellulaireD9F9D (13018)Source : Lapin ; Dilution pour WB : 1:2000
IL6Technologie abclonaleA0286Source : Lapin ; Dilution pour WB : 1:1000
ImageJInstitut national de la santéVersion 1.53cLogiciel d’analyse d’images
Plaque Incucyte ImageLock 96 puitsSartoriqueBA-04857
Incucyte® ; SX5SartoriqueSX5Instrument d’analyse de cellules vivantes  ;
Réactif de transfection Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific11668019réactif de transfection cationique à médiation lipidique
MACS® ; Solution de stockage de tissusMilteny Biotec130-100-008
Lecteur de microplaques (absorbance de 600 nm)PromegaRéf. GM3500
Microtubes 1,5 mL  ;Sarstedt7269001
NcadAbcamAB18203Source : Lapin ; Dilution pour WB : 1:1000
Bleu nitro tétrazolium  ;Sigma AldirchN5514
Parafilm  ;Sigma AldirchHS234526B
pBABE-puro-hTERTAddgene1771Conserver à -20 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
pCL-AmphoNovus Biological  ;NBP2-29541Conserver à -20 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Le PDGFRBSanta CruzSC-432Source : Lapin ; Dilution pour WB : 1:1000
Pénicilline-Streptomycine (PS, 10 000 &mu ; g/mL)  ;Gibco15140122Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Microscope à contraste de phase  ;Olympe  ;BX42
Saline tamponnée au phosphate  ; (Crédit : PBS)Fait maisonNaCl, 137 mM ; KCl, 2,7 mM ; Na2HPO4, 10 mM ;KH2PO4, 1,8 mM. Autoclave et Magasin chez RT
Solution de poly-L-lysineSigma AldirchRéf. P8920Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans une hotte biologique
Chlorhydrate de puromycineSigma AldirchRéf. P8833
Secura Semi Micro BalanceSartoriusSECURA125-1S
Pipette sérologique 10 mL  ;Sarstedt861254001
Pipette sérologique 2 mL  ;Sarstedt861252001
Pipette sérologique 25 mL  ;Sarstedt861256001
Pipette sérologique 5 mL  ;Sarstedt861253001
STAT3CST9139Source : Souris ; Dilution pour WB : 1:1000
STAT3 Y705CST9131Source : Lapin ; Dilution pour WB : 1:1000
StéréomicroscopeLeicaMZ125
Seringue 10 mLPentaferteRéférence 00202260D12
TermoMixerEppendorph22331
Trypsine-EDTA (0,5 %), sans rouge de phénolGibco15400054
EntrainSanta CruzSC-6260Source : Souris ; Dilution pour WB : 1:2000
Concentrateur centrifuge Vivaspin 20Sigma AldirchZ614602MWCO 10 000 Da  ;
Ciseaux Wagner2Biol14070-12

Références

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Mots-clés

Fibroblastes du cancer de la prostateIsolement de fibroblastesMicroenvironnement tumoralMilieux conditionn sCroissance ind pendante de l ancrageEssai au g lose molleCo culture de fibroblastesStroma tumoralCaract risation des fibroblastes

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