Article de méthode

Séquençage d’amplicon à l’aide des technologies de séquençage à lecture longue

DOI :

10.3791/68370

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29 août 2025

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1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole a été optimisé pour le séquençage profond ciblé de 18 régions de résistance aux médicaments chez Mycobacterium tuberculosis à l’aide d’une plateforme de séquençage à lecture longue, suivi d’une analyse avec un pipeline bioinformatique spécifique à la tuberculose conçu pour les données à lecture longue.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’Organisation mondiale de la Santé (OMS) continue d’insister sur le besoin urgent d’une méthode de diagnostic rapide, rentable et conviviale de la tuberculose et de la tuberculose pharmacorésistante. Les technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS), approuvées par l’OMS, ont considérablement amélioré la détection de la tuberculose pharmacorésistante. Parmi ceux-ci, le NGS ciblé (tNGS) permet une détection ciblée des mutations génétiques associées à la résistance aux médicaments, éliminant ainsi le besoin de diagnostics traditionnels basés sur la culture. Un test tNGS largement utilisé fournit des tests de sensibilité aux médicaments rapides et complets, mais a été principalement optimisé pour les plateformes de séquençage avec une grande précision. Cependant, le coût élevé de ces systèmes de séquençage a limité l’accessibilité dans les pays à revenu faible et intermédiaire, en particulier en Afrique. Les technologies de séquençage portables présentent une alternative prometteuse, offrant une flexibilité et des exigences d’infrastructure réduites. Dans cette étude, l’ADN a été extrait d’isolats de tuberculose résistante à la rifampicine (TB-RR), amplifié à l’aide d’un test tNGS et séquencé sur une plateforme de séquençage portable. Les mêmes produits d’amplification ont également été séquencés sur une plate-forme de séquençage à lecture courte de haute précision pour servir de référence. Les données du séquenceur portable ont été traitées à l’aide d’un pipeline bio-informatique conçu pour le séquençage à lecture longue, tandis que les données de séquençage à lecture courte ont été analysées à l’aide d’une application Web établie. L’analyse a montré que l’approche de séquençage à lecture longue a permis d’identifier avec succès les variants associés à la résistance à haute fréquence détectés par le séquençage à lecture courte, mais a montré des limites dans la détection des variants à basse fréquence.

Introduction

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La tuberculose continue d’être l’une des principales causes de mortalité dans le monde et constitue un défi permanent de santé publique, en particulier dans les pays à revenu faible ou intermédiaire 1,2. Malgré les initiatives visant à améliorer les mesures de lutte contre la tuberculose, les progrès ont été lents, en partie en raison des difficultés rencontrées pour mettre au pointdes techniques de diagnostic rapides, précises, rentables et complètes3,4,5. Alors que les méthodes de diagnostic moléculaire telles que les tests par sonde linéaire (LPA) et les tests automatisés d’amplification des acides nucléiques (TAAN) ont accéléré l’identification de la tuberculose et de la tuberculose résistante aux médicaments, leur détection limitée des mutations limite les tests de sensibilité aux médicaments (DST) approfondis. Cette limitation est particulièrement importantedans les pays à forte charge de morbidité 6,7,8,9.

Pour remédier à ces limites, l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) a recommandé l’utilisation des technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS), qui sont devenues des outils puissants pour la surveillance de la tuberculose et la détection de la résistance10,11. Les approches de séquençage du génome entier (WGS) et de NGS ciblé (tNGS) offrent une couverture de mutation plus large, permettant l’identification de variants associés à la résistance dans plusieurs médicaments 8,12,13,14,15. Bien que le séquençage du génome entier (WGS) fournisse un rapport complet sur l’heure d’été, sa dépendance à la culture le rend impropre au diagnostic rapide, car la culture peut prendre jusqu’à six semaines 15,16,17. Le NGS ciblé offre une meilleure alternative puisqu’il ne dépend pas de la culture ; Le séquençage peut être effectué directement à partir d’échantillons cliniques18. En conséquence, l’OMS a recommandé l’utilisation de trois tests tNGS pour l’antibiogramme : Test Deeplex Myc-TB : Ce test détecte la résistance à la rifampicine, à l’isoniazide, aux fluoroquinolones, aux aminoglycosides (amikacine, kanamycine, capréomycine), à l’éthambutol, au pyrazinamide et à l’éthionamide 19,20,21. Test sentinelle de la tuberculose : Il cible la résistance à la rifampicine, à l’isoniazide, aux fluoroquinolones et aux médicaments injectables de deuxième intention18,20. Test AQ-TB : Il identifie la résistance à la rifampicine, à l’isoniazide, aux fluoroquinolones et aux médicaments injectables de deuxième intention. Ces tests ont été optimisés pour une utilisation sur la plate-forme à lecture courte en raison de leur grande précision20. Les plates-formes à lecture longue ONT MinION, quant à elles, fournissent des données en temps réel, la portabilité et le potentiel d’une mise en œuvre rentable22,23. Cependant, l’utilisation généralisée du NGS est limitée par les exigences d’infrastructure et de coût, en particulier avec les systèmes à lecture courte10.

Le test Deeplex est le plus complet des trois tests recommandés. À l’origine, le test était conçu pour effectuer une PCR multiplex sur 18 régions associées à une résistance à 13 médicaments antituberculeux. Cependant, l’OMS l’a recommandé pour 10 médicaments antituberculeux, ce qui indique une sensibilité et une spécificité suffisantes. Cette étude l’a optimisé pour une utilisation avec l’ONT MK1B MinION, une plate-forme de séquençage à lecture longue. Le système de cellules d’écoulement portable et réutilisable de cette plate-forme réduit à la fois l’infrastructure et les coûts potentiels de séquençage par échantillon 4,22,23. Bien que d’autres tests compatibles en lecture longue aient été développés, ils ont tendance à avoir une portée DST limitée, ne ciblant généralement qu’une gamme étroite de gènes de résistance. En revanche, le test offre une large couverture cible, ce qui en fait un outil de diagnostic plus complet pour l’heure d’étédécentralisée DST 24,25. Une liste détaillée des cibles génomiques amplifiées par le test et de leurs associations médicamenteuses correspondantes est fournie dans le tableau 1, mettant en évidence les capacités diagnostiques du test25.

Avant l’extraction de l’ADN, les échantillons doivent être décontaminés et inactivés dans des conditions de niveau de biosécurité 3 (BSL-3), en suivant les précautions de sécurité nécessaires 25,26,27. Une amplification interne et des contrôles externes doivent être intégrés à chaque cycle, et la contamination doit être suivie au moyen de contrôles négatifs et d’évaluations de laboratoire de routine25. Des paramètres de qualité importants, notamment la profondeur de lecture, l’étendue de la couverture et le succès de l’amplification, doivent être évalués après le séquençage. Pour le séquençage ciblé, l’OMS recommande une profondeur de lecture minimale de 100x pour chaque amplicon et une couverture adéquate de toutes les régions de résistance aux médicaments ciblées pour permettre la détection des variants mineurs présents à ≥5 %28. L’Organisation mondiale de la santé approuve ces méthodes de séquençage ciblé pour identifier la résistance aux médicaments de première et de deuxième intention, en supposant que des systèmes d’assurance qualité soient mis en place et que toutes les régions cibles soient suffisamment couvertes28.

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Protocole

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Cette recherche a été menée dans le cadre du projet TS ELiOT, qui a reçu l’approbation éthique du Comité d’éthique de la recherche humaine (HREC) de l’Université de Stellenbosch (N21/09/093) le 20 octobre 2021. De plus, elle a obtenu l’autorisation de Western Cape Health Research pour l’utilisation des installations gouvernementales. Les échantillons ont été prélevés dans le cadre d’un effort de collaboration avec le NHLS Green Point et l’Université de Stellenbosch, sous le numéro d’approbation SU HREC N09/11/296. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation de l’échantillon

  1. Inactivation thermique
    1. Incuber les cultures MGIT à 80 °C pendant 1 h pour obtenir une inactivation thermique complète dans des conditions BSL-3.
    2. Procédez à l’extraction de l’ADN à l’aide de la méthode InstaGene29.
  2. Extraction de l’ADN
    1. Placez 5 ml de culture de MGIT inactivée par la chaleur dans un tube de 15 ml.
    2. Centrifugeuse à 4000 x g pendant 30 min à température ambiante (RT).
    3. Retirer délicatement le surnageant par pipetage, en laissant le sédiment.
    4. Ajouter 200 μL de réactif d’extraction d’ADN basé sur la chélation dans le sédiment et incuber à 56 °C pendant 15 min.
    5. Transférez la solution dans un tube à bouchon à vis de 2 ml et ajoutez trois billes de verre de 2 mm de diamètre à chacune.
    6. Agiter pendant 10 s pour étaler les cellules et placer les tubes dans un incubateur à bain sec à 100 °C pendant 8 min.
    7. Homogénéiser les échantillons à l’aide de l’homogénéisateur à battage de billes avec les réglages suivants : 3 cycles de 20 s à 4,0 m/s.
    8. Centrifugez à 12 000 x g pendant 15 min à RT et transférez soigneusement 130 μL du surnageant (liquide contenant de l’ADN) dans un tube de 1,5 mL, en évitant les sédiments et les débris.
    9. Remettez les billes en suspension par effleurement ou tourbillon et ajoutez 156 μL des billes dans le tube de 1,5 mL contenant l’ADN extrait.
    10. Pipeter lentement de haut en bas 10 fois pour mélanger et incuber à RT pendant 5 min.
    11. Placez les tubes sur une grille magnétique pendant 5 minutes pour séparer les billes liées à l’ADN.
      REMARQUE : Un surnageant clair doit apparaître au-dessus d’une pastille compacte de billes magnétiques sombres sur le côté du tube faisant face à l’aimant, indiquant qu’il est prêt à être éliminé.
    12. Pipeter le surnageant sans déranger les billes.
    13. Ajoutez 100 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à la pastille de bille sur la grille et laissez reposer 30 s, puis retirez l’éthanol. Répétez l’étape de lavage.
    14. Faites sécher la bille à l’air libre à RT pendant 5 min. Assurez-vous que la pastille de bille semble mate et qu’il ne reste aucun liquide visible avant de passer à l’étape suivante.
    15. Retirez le tube du support magnétique.
    16. Ajoutez 25 μL d’eau sans nucléases (NFW) directement aux billes séchées et remettez en suspension en pipetant doucement de haut en bas 10 fois.
    17. Incuber à RT pendant 5 min.
    18. Remettez le tube sur la grille magnétique pendant encore 5 min.
    19. Transférez avec précaution l’ADN élué (surnageant) dans un nouveau tube de 1,5 ml.
    20. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide du réactif de quantification de l’ADNdb basé sur la fluorescence à haute sensibilité.
      REMARQUE : L’ADN peut être stocké dans un congélateur à -20 °C ou procéder à la PCR.
  3. Amplification (PCR)
    1. Nettoyage par PCR multiplex et post-PCR, en suivant les instructions du fabricant25.
    2. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide du réactif de quantification de l’ADNdb basé sur la fluorescence à haute sensibilité.
  4. Électrophorèse
    1. Préparez un gel d’agarose à 2 % en dissolvant la poudre d’agarose dans 1 tampon TAE par chauffage au micro-ondes jusqu’à ce qu’elle soit complètement fondue.
    2. Ajoutez 5 μL de colorant de gel d’ADN fluorescent non toxique à l’agarose fondue et mélangez soigneusement.
    3. Versez le mélange de gel dans un plateau de coulée de gel équipé d’un peigne pour former des puits.
    4. Laissez le gel se solidifier à RT.
    5. Une fois solidifié, retirez le peigne et placez le plateau de gel dans le réservoir d’électrophorèse rempli de 1x tampon TAE.
    6. Chargez 5 μL d’une échelle d’ADN kb mélangée à 5 μL de tampon de charge dans le premier puits.
    7. Pour chaque produit de PCR, mélanger 5 μL du produit avec 5 μL de tampon de chargement et charger dans des puits individuels.
    8. Faites fonctionner le gel à 100 V pendant 1 h.
    9. Visualisez les bandes d’ADN à l’aide du système de documentation sur gel avec transillumination.

2. Préparation de la bibliothèque ONT

  1. Préparation finale
    1. Calculez 100 ng de chaque échantillon d’amplicon en fonction de la concentration et transférez le volume requis dans un tube PCR propre.
    2. Pour calculer la masse totale (en ng) des amplicons dans un échantillon donné, multipliez la concentration de l’échantillon (ng/μL) par son volume restant (μL) après contrôle de la qualité (CQ).
      REMARQUE : Par exemple, si un échantillon a une concentration de 2 ng/μL et un volume restant de 1 μL après QC, la masse totale de l’amplicon est de :
      Masse totale = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng
      Pour préparer 10 ng d’amplicons pour le séquençage, utilisez la formule de dilution :
      C1V1 = C2V2
      Où : C1 = 45 ng, V1 = inconnu, C2 = 10 ng, V2 = 1 μL, V1 = (C2 × V2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      Ainsi, μL de l’échantillon d’amplicon initial doit être utilisé pour obtenir 10 ng d’ADN pour le séquençage.
    3. Ajustez le volume total de chaque échantillon à 12,5 μL à l’aide de NFW.
    4. Mélangez doucement les échantillons en pipetant 10 fois de haut en bas et tournez brièvement.
    5. Ajouter 1,75 μL de tampon de réaction de réparation et de résidu A et 0,75 μL de mélange d’enzymes de réparation et de queue A à chaque échantillon.
    6. Mélangez soigneusement en pipetant 10 fois de haut en bas et tournez brièvement vers le bas.
    7. Incuber les tubes dans un thermocycleur à 25 °C pendant 30 min, puis à 65 °C pendant 30 min.
      REMARQUE : À ce stade, si l’utilisateur décide d’interrompre le processus, il est conseillé d’utiliser des billes pour la purification de l’ADN préparé à l’extrémité. L’ADN purifié peut ensuite être stocké à 4 °C pendant une durée maximale de sept jours.
  2. Ligature native des codes-barres
    1. Décongelez et préparez les billes magnétiques pour la purification de l’ADN et la sélection de la taille, les billes de nettoyage de l’ADN paramagnétique, l’EDTA et les codes à barres natifs (NB01-96) selon les instructions du fabricant, puis placez-les sur de la glace.
    2. Dans les nouveaux tubes PCR, ajoutez les éléments suivants dans l’ordre : 2,75 μL d’eau exempte de nucléases, 1 μL d’ADN préparé en bout, 1,25 μL de codes-barres natifs (NB01-96) et 5 μL de mélange d’enzymes de ligature de l’ADN.
    3. Mélangez chaque réaction en pipetant doucement 10 fois, tournez brièvement à l’aide d’une microcentrifugeuse et incubez pendant 20 min à RT.
    4. Ajouter 1 μL d’EDTA dans chaque puits, bien mélanger par pipetage et tourner brièvement.
    5. Échantillons, étiquetés à code-barres dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
    6. Remettre en suspension les billes de nettoyage de l’ADN par vortex et ajouter 0,7 fois le volume total de l’échantillon mélangé (p. ex., pour 23 échantillons d’un volume total de 253 μL, ajouter 177,1 μL de billes).
    7. Mélangez la solution par pipetage et incubez sur un HulaMixer pendant 10 min à RT.
    8. Préparez 2 ml d’éthanol à 80 % en mélangeant 1600 μL d’éthanol pur avec 400 μL d’ENF.
    9. Placez le tube sur une grille magnétique pendant 5 minutes jusqu’à ce que l’éluat soit clair et incolore.
    10. Retirez et jetez le surnageant sans déranger la pastille.
    11. Lavez les billes avec 700 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé sans déranger la pastille, puis retirez et jetez l’éthanol.
    12. Répétez l’étape de lavage à l’éthanol.
    13. Centrifugez brièvement le tube, retournez-le dans le rack magnétique et retirez l’éthanol résiduel.
    14. Laissez les perles sécher à l’air libre pendant 30 s.
    15. Retirez le tube de la grille magnétique, remettez les billes en suspension dans de l’eau exempte de nucléases de 35 μL en effleurant doucement et incubez à 37 °C pendant 10 min.
    16. Remettez le tube dans le support magnétique jusqu’à ce que l’éluat soit clair et incolore.
    17. Transférez 35 μL de l’éluat dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 mL pour les étapes suivantes.
      REMARQUE : La bibliothèque peut être stockée à 4 °C pendant la nuit à ce stade.
  3. Ligature et nettoyage de l’adaptateur
    1. Préparez le kit de réactif de ligature rapide de l’ADN selon les instructions du fabricant et placez-le sur de la glace.
    2. Mélangez l’adaptateur natif (NA) et la Quick Ligase par pipetage, puis placez-les sur de la glace.
    3. Décongelez le tampon d’élution (EB) à RT, vortex, centrifugeuse et placez-le sur de la glace.
    4. Décongelez le tampon de fragments courts (SFB) à RT, vortex, centrifugeuse et placez-le sur de la glace.
    5. Dans un tube de microcentrifugation à faible liaison de 1,5 mL, mélanger les éléments suivants : 30 μL d’échantillon groupé à code-barres, 5 μL d’adaptateur natif (NA), 10 μL de tampon de réaction de ligature rapide et 5 μL d’ADN ligase T4 à action rapide.
    6. Pipeter doucement pour mélanger, centrifuger brièvement et incuber pendant 20 min à RT.
    7. Remettre en suspension les billes de nettoyage de l’ADN par vortex et ajouter 20 μL (0,4x) de billes à la réaction.
    8. Mélangez doucement par pipetage et incubez sur un HulaMixer pendant 10 min à RT.
    9. Pelletez les billes sur une grille magnétique et aspirez le surnageant sans déranger le granulé.
    10. Lavez les billes en ajoutant 125 μL de tampon à fragments courts (SFB), remettez-les en suspension en effleurant, centrifugez brièvement et remettez-les dans le rack magnétique.
    11. Granulez les billes et aspirez le surnageant ; Répétez l’étape de lavage une fois.
    12. Centrifugez brièvement, remettez le tube dans le support magnétique et aspirez tout surnageant résiduel.
    13. Retirez le tube du support magnétique et remettez les billes en suspension dans 15 μL de tampon d’élution (EB).
    14. Centrifuger brièvement et incuber à 37 °C pendant 10 min pour éluer l’ADN.
    15. Placez le tube sur la grille magnétique, granulez les billes jusqu’à ce que l’éluat soit clair et incolore, et aspirez 15 μL de l’éluat dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml.
    16. Quantifier 1 μL de l’éluat.
    17. Diluer la banque à 20 fmol (calculer à l’aide du calculateur NEB) et utiliser 12 μL de la bibliothèque préparée à 20 fmol pour le séquençage sur la cellule d’écoulement R10.4.1.
      REMARQUE : La bibliothèque peut maintenant être stockée à -20 °C, ce qui permet une utilisation répétée.
  4. Amorçage et chargement de la cellule d’écoulement de séquençage nanoporeux
    1. Décongelez le tampon de séquençage (SB), les billes de bibliothèque (LIB), le Flow Cell Tether (FCT) et le Flow Cell Flush (FCF) à RT, mélangez-les par vortex et faites-les tourner.
    2. Préparez le mélange d’amorçage en combinant 5 μL d’albumine sérique bovine (BSA, 50 mg/mL), 30 μL de Flow Cell Tether (FCT) et 1170 μL de Flow Cell Flush (FCF), en mélangeant la solution par inversion et pipetage.
    3. Ouvrez l’orifice d’amorçage de la cellule d’écoulement, aspirez ~20 μL de tampon pour éliminer les bulles d’air, chargez 800 μL du mélange d’amorçage dans l’orifice d’amorçage sans introduire de bulles d’air et attendez 5 min.
    4. Préparez la banque en mélangeant 37,5 μL de tampon de séquençage (SB), 25,5 μL de billes de bibliothèque (LIB) ou de solution de bibliothèque (LIS) et 12 μL de la banque d’ADN de 20 fmol dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, en mélangeant soigneusement par pipetage.
    5. Amorcez à nouveau la cellule d’écoulement en soulevant doucement le capuchon de l’orifice d’échantillonnage de la cellule d’écoulement, en chargeant 200 μL du mélange d’amorçage dans l’orifice d’amorçage sans introduire de bulles d’air et en préparant la bibliothèque pour le chargement.
    6. Mélangez doucement la bibliothèque préparée par pipetage et chargez 75 μL de la bibliothèque dans le port d’échantillonnage de la cellule de séquençage goutte à goutte, en veillant à ce que chaque goutte s’écoule dans le port avant d’ajouter la suivante.
    7. Fermez le capuchon de l’orifice d’échantillonnage de la cellule d’écoulement, en vous assurant que la bonde pénètre dans l’orifice d’échantillonnage de la cellule d’écoulement, puis fermez l’orifice d’amorçage.
    8. Connectez le dispositif de séquençage portable à un ordinateur (avec une alimentation électrique ininterrompue) et lancez le séquençage à l’aide d’un logiciel de contrôle et d’analyse du dispositif de séquençage.
  5. Paramètres du logiciel
    REMARQUE : Cette application logicielle, développée par ONT, est utilisée pour la gestion complète des exécutions de séquençage et la génération de rapports détaillés.
    1. Pour lancer le processus de séquençage, sélectionnez l’option Démarrer puis Démarrer le séquençage.
      REMARQUE : Vous serez ensuite invité à désigner un dossier pour le stockage des fichiers et à fournir un nom pour votre séquence exécutée, par exemple, « sequencing_run_1 ». Ensuite, cliquez sur Continuer vers les paramètres pour sélectionner le nom de kit approprié, tel que library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96, et personnalisez la durée d’exécution souhaitée, par exemple, 20 h (la durée d’exécution maximale est de 72 h).
    2. Ensuite, choisissez le type de fichier de sortie, en sélectionnant parmi des options telles que POD5 pour les lectures de sortie brute et FASTQ pour les sorties appelées de base. Ensuite, sélectionnez le modèle FAST-Basecalling.
    3. Veuillez noter que certains des paramètres par défaut incluent un balayage fréquent des pores toutes les 1,5 h, une durée de lecture minimale de 200 pb et un score de qualité minimum de 8. Enfin, vérifiez les paramètres et commencez le processus de lecture.

3. Analyse post-séquençage

  1. Configuration requise
    REMARQUE : Guide pour la mise en place de l’environnement et l’analyse des données de séquençage des amplicons de Mycobacterium tuberculosis à l’aide du pipeline ONT-TB-NF. Les instructions s’adressent à la fois aux utilisateurs de Windows (via WSL) et de macOS.
    1. Utilisez les éléments suivants - Système d’exploitation : Windows 10/11 (avec WSL2) ou macOS ; Mémoire : minimum 8 Go de RAM (16 Go recommandés) ; Stockage : Au moins 50 Go d’espace disque disponible ; Internet : Requis pour le téléchargement de packages et de données ; Autorisations : Possibilité d’installer des logiciels et de gérer des environnements.
  2. Assurez-vous que la configuration de l’environnement est la suivante : Utilisateurs Windows (à l’aide de WSL2). Activez WSL2.
    1. Ouvrez PowerShell en tant qu’administrateur et exécutez : wsl - install.
    2. Redémarrez l’ordinateur lorsque vous y êtes invité.
  3. Installer Ubuntu
    1. Après le redémarrage, lancez le Microsoft Store, recherchez Ubuntu et installez la version préférée (par exemple, Ubuntu 22.04 LTS).
    2. Lancez Ubuntu à partir du menu Démarrer .
    3. Créez un nom d’utilisateur et un mot de passe UNIX lorsque vous y êtes invité.
    4. Paquets de mise à jour Listes : sudo apt update & sudo apt upgrade -y.
  4. Utilisateurs macOS
    1. Installez Homebrew (si ce n’est pas déjà fait) : /bin/bash -c « $(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh) ».
    2. Installez les paquets requis : brew install git wget
  5. Installation de Conda ou Mamba
    1. Visitez la page de téléchargement de Miniconda pour télécharger le bon programme d’installation pour le système d’exploitation.
    2. Pour installer Miniconda, exécutez le programme d’installation et suivez les instructions à l’écran. Une fois l’installation terminée, veuillez redémarrer le terminal.
    3. Configurer les canaux Conda :
      conda config --add channels defaults
      conda config --add channels bioconda
      conda config --add channels conda-forge
    4. Installation de Mambaforge (Mamba)
      Pour Linux :
      wget
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      Pour macOS :
      WGET https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. Installez Mambaforge : bash Mambaforge-*.sh
    6. Suivez les instructions pour terminer l’installation et redémarrez votre terminal pour activer Mamba.
  6. Configuration du pipeline ONT-TB-NF
    1. Créez un nouvel environnement Conda : conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. Sinon, utilisez Mamba : mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. Activer l’environnement : conda activate ont_tb_env
    4. Installer Nextflow : curl -s https://get.nextflow.io | bash, sudo mv nextflow /usr/local/bin/
    5. Cloner le dépôt ONT-TB-NF : GIT CLONE https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
    6. Extraire les images Docker requises (si vous utilisez Docker)
      docker pull hkubal/clair3 :v0.1-r12
      Docker Pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
  7. Exécution du pipeline
    1. Concaténez les fichiers FASTQ Basecalled de chaque échantillon indépendamment à l’aide de la commande suivante.
      chat *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      nextflow run run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /chemin/vers/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /chemin/vers/amplicon_regions.lit \
      Fils 16 \
      output_dir /chemin/absolu/vers/output_directory
  8. Fichiers de sortie et interprétation
    1. Une fois l’exécution réussie, assurez-vous que le pipeline génère les sorties suivantes dans le répertoire de sortie spécifié :
      1. Lectures alignées : fichiers *.bam.
      2. Appels de variantes : *.vcf fichiers contenant des SNP et des indels.
      3. Rapports récapitulatifs : fichiers *.csv ou *.tsv résumant les mutations de résistance aux médicaments et d’autres mesures pertinentes.
      4. Rapports de contrôle de la qualité : fichiers *.htmL générés par des outils comme MultiQC.
      5. Logs : journaux détaillés de l’exécution du pipeline.
      6. Fichiers intermédiaires : Stockés dans le répertoire work/ (peuvent être supprimés après une exécution réussie).
        REMARQUE : En cas d’erreurs d’autorisation, il est essentiel de vérifier que l’on possède les autorisations nécessaires pour lire et écrire des fichiers, ainsi que pour exécuter des scripts. En ce qui concerne les questions environnementales, veuillez vous assurer que l’environnement Conda approprié est activé avant d’exécuter le pipeline. Pour ceux qui utilisent des profils Docker, il est impératif de confirmer que Docker est à la fois installé et opérationnel. De plus, il faut surveiller méticuleusement les ressources système pour éviter toute limitation de mémoire ou de stockage pendant l’exécution. La figure 1 donne un aperçu de ces méthodologies.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode d’extraction de l’ADN choisie a été choisie pour son efficacité et son rendement supérieur par rapport aux autres techniques rapides. Il produisait constamment de l’ADN génomique (ADNg) de haute qualité, et l’intégration d’une étape de nettoyage à base de billes a permis de minimiser le temps de traitement tout en réduisant les coûts par échantillon. Cela a été réalisé en éliminant le besoin d’évaluations supplémentaires du contrôle de la qualité telles que les mesures spectro...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La plateforme de séquençage à lecture longue a démontré des avantages notables dans cette étude, en particulier sa capacité à réaliser un séquençage rapide avec une large couverture constamment élevée. Pour tous les isolats séquencés avec succès, une étendue de couverture de 99,9 % a été atteinte, ce qui indique une représentation presque complète des régions génomiques associées à la résistance. La profondeur moyenne de couverture pour tous les gènes ciblés était de 4462X, le gène e...

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Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à exprimer notre sincère gratitude au Centre SAMRC pour la tuberculose de l’Université de Stellenbosch pour avoir fourni les ressources et les installations essentielles. Nous sommes également profondément reconnaissants à l’étude TS ELiOT d’avoir fourni les échantillons qui faisaient partie intégrante de cette étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
15 mL & Tubes à liaison Lo de 1,5 mL ou 2 mLEppendorfEP0030108051-250EA
Échelle 1 kbThermo Fisher ScientificSM0311
Tubes à bouchon à vis de 2 mLSpécialités Scientifiques IncP2TUB056C-0001.5ST
Des perles de verre stériles de 2 mmSigma-AldrichZ273627-1EA
Perle XP AMPureBeckman ColterA63881
Deeplex Myc-TB  ;GenoScreen20090205
Chambre d’électrophorèseThermo Fisher ScientificA25977
Alcool éthylique, purSigma-AldrichE7023-500ML
Homogénéiseur FastPrepMP Biomédicals116005500
Pointes de pipette filtrant (10 & micro ; L)  ;Bio-Smart ScientificFT-10-R
Pointes de pipette filtrantes (1000 & micro ; L)  ;Bio-Smart ScientificFT-1000-R
Pointes de pipette à filtre (20 & micro ; L)  ;Bio-Smart ScientificFT-20-R
Pointes de pipette filtrant (200 & micro ; L)  ;Bio-Smart ScientificFT-200-R
Cellule de flux & nbsp ;Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114
Bloc chauffantEppendorf5382000031
Matrice InstaGeneBio-RadBBRD7326030
Rack magnétique & nbsp ;Thermo Fisher Scientific & nbsp ;12321D
MicrocentrifugeuseEppendorf  ;5406000046
Sous-fifreOxford Nanopore TechnologiesMK1B
Kit de codage à barres natif V14  ;Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase Master MixONÉM0367
Module de ligature rapide NEBNextONÉE6056
NEBNext Ultra II Module de réparation/dA-remontageONÉE7546
Eau sans nucléase (NFW)Thermo Fisher ScientificAM9937
Pipettes (P10, P20, P200 et P1000)EppendorfEP3123000918-1EA
Tubes d’essai à qubitsThermo Fisher ScientificQ32856
Kit d’analyse HS Qubit dsDNAThermo Fisher ScientificQ33231
Fluoromètre à qubitsThermo Fisher ScientificQ33226
SYBR Souche sûre en gel d’ADNThermo Fisher ScientificS33102
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific17852
Transilluminateur Universal Hood III (Système Molecular Imager Gel Doc XR)Bio-Rad170-8170
Mélangeur vortexLasecWMBB0L0E0216

Références

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