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Article de méthode

Échantillonnage environnemental des microbes photosynthétiques et de leurs virus : du champ au laboratoire

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DOI :

10.3791/68379

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3 juillet 2025

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici des méthodes d’échantillonnage dans les zones euphotiques des écosystèmes marins et d’eau douce pour isoler les cyanophages (et leurs hôtes) et des processus de post-échantillonnage qui enrichissent les génotypes uniques et caractérisent la dynamique d’interaction virus-hôte.

Résumé

L’échantillonnage environnemental des microorganismes photosynthétiques et de leurs virus joue un rôle essentiel dans la compréhension de la biodiversité et de la dynamique des écosystèmes marins et d’eau douce contemporains, ainsi que des impacts des facteurs liés au changement climatique (p. ex., la hausse des températures et l’acidification) sur les trajectoires évolutives des espèces et la composition des communautés. Malheureusement, la diversité de la virosphère ne permet pas d’établir un échantillonnage universel unique et un flux de travail expérimental. En effet, chaque système viral a des caractéristiques uniques, qui nécessitent des modifications des protocoles standard en virologie pour atteindre les objectifs de recherche. Bien que la découverte et la caractérisation des virus nécessitent des approches spécifiques au système cible, pour tous les virus, les objectifs de recherche sont similaires : isoler le virus ; déterminer la plage d’hôtes ; confirmer l’infection productive ; et caractériser le virus, l’hôte et la dynamique virus-hôte. Les descriptions robustes des systèmes virus-hôte consistent essentiellement à élucider la morphologie, la physiologie, la biochimie et les profils omiques. Des informations supplémentaires peuvent être obtenues en manipulant le système en modifiant des facteurs tels que la multiplicité de l’infection, la température, le pH, le changement d’hôte, l’évolution dirigée ou l’application de médicaments pour observer la réponse du système virus-hôte. Notre laboratoire étudie les virus dans tous les domaines de la vie (archées, bactéries et eukaryas). Dans ce rapport, nous détaillons les méthodes d’échantillonnage des microbes photosynthétiques de la zone euphotique des environnements d’eau douce et marins, en mettant l’accent sur l’isolement des bactériophages (c’est-à-dire des cyanophages) des cyanobactéries. Les cyanobactéries sont des espèces clés essentielles à la production primaire et au cycle des nutriments dans ces écosystèmes aquatiques. Le flux de travail décrit s’étend de l’échantillonnage d’eaux à différentes profondeurs à la caractérisation des caractéristiques du système virus-hôte à l’aide de cultures de milieux liquides et solides, de méthodes moléculaires/génétiques avancées et d’approches analytiques. Les méthodes décrites sont adaptables à la découverte de bactériophages et de virus dans les systèmes virus-hôte dans tous les domaines de la vie.

Introduction

La caractérisation de la dynamique des infections et des relations évolutives des cyanophages et de leurs hôtes est essentielle pour comprendre les états actuels et futurs des écosystèmes marins et d’eau douce. Des techniques avancées de séquençage à haut débit et des méthodes analytiques modernes permettent un séquençage rapide des génomes des cyanophages (et de l’hôte) pour étudier les relations virus-hôte 1,2. Cependant, les flux de travail commencent par un échantillonnage de l’environnement pour isoler et identifier les virus et leurs hôtes 3,4,5. En raison de la diversité de la virosphère, il n’existe pas de protocole unique pour l’échantillonnage et la caractérisation de tous les virus et bactériophages. En effet, chaque système virus-hôte a ses caractéristiques uniques. Néanmoins, les objectifs de base sont similaires quel que soit le système viral exploré : isoler le virus ; déterminer la plage d’hôtes ; présenter une infection productive chez un ou plusieurs hôtes ; Caractériser le virus, l’hôte et la dynamique d’infection virus-hôte à l’aide d’approches qualitatives et quantitatives. Une compréhension avancée du système viral peut être examinée en perturbant le système. La modification de paramètres tels que la multiplicité de l’infection (MOI)6, la température, le pH, la souche hôte ou l’application de médicaments pour déterminer la réponse du système fournit des informations supplémentaires sur la nature de la dynamique virus-hôte. Des manipulations plus avancées, telles que l’évolution dirigée, peuvent fournir des informations supplémentaires sur la trajectoire évolutive potentielle du système et sur la façon dont les paramètres co-évolutifs peuvent avoir un impact sur la communauté microbienne et l’écosystème plus larges.

Dans cette étude, nous présentons un modèle (mais facilement adaptable) de protocole pour l’échantillonnage environnemental de microbes photosynthétiquestels que les cyanobactéries et les microalgues, qui jouent un rôle essentiel dans le cycle des nutriments et la production primaire dans les écosystèmes marins, d’eau douce et autres écosystèmes aquatiques.. Le flux de travail se concentre sur l’isolement des hôtes des zones euphotiques des environnements marins et d’eau douce, ainsi que de leurs virus et bactériophages, qui sont les principaux moteurs de ces écosystèmes12. Les virus et les bactériophages ont un impact sur les structures des populations eucaryotes et procaryotes et influencent fortement la diversité et la productivité des écosystèmes13. Ainsi, l’objectif ici est de fournir un protocole d’échantillonnage et un flux de travail de post-échantillonnage qui facilitent l’enrichissement des hôtes et des virus pour l’investigation : dynamique monovirus/mono-hôte, multi-virus/mono-hôte, mono-virus/multi-hôte et multi-virus/multi-hôtes ; -substrats omiques sous-jacents à la dynamique d’infection virus-hôte ; et les trajectoires coévolutives potentielles et les paramètres évolutifs qui ont un impact sur le système virus-hôte à l’étude et sur l’écosystème plus large à partir duquel les virus et l’hôte ont été extraits.

Plus précisément, nous décrivons un flux de travail pour l’échantillonnage environnemental, le prétraitement sur le terrain des échantillons (c’est-à-dire avant d’atteindre le laboratoire), le post-traitement pour l’isolement des bactériophages (et des virus), l’enrichissement de cultures d’espèces mixtes de micro-organismes en vue d’identifier les hôtes permissifs, le développement d’isolats uniques d’hôtes présumés, la confirmation d’une la relation virus-hôte (c.-à-d. l’infection productive) et la caractérisation des propriétés fondamentales de l’infection (p. ex., la virulence). Les tests d’infection permettent non seulement de calculer la virulence relative (V,R)14 et la résilience de l’hôte (R,R)15, mais comprennent également des étapes pour extraire des échantillons de culture à des moments clés pour étudier les substrats omiques qui sous-tendent la physiologie observée (c’est-à-dire la dynamique d’interaction virus-hôte). Enfin, nous abordons les pièges potentiels, le dépannage et les solutions, ainsi que les moyens de modifier certaines étapes pour cibler des taxons spécifiques. Le flux de travail est applicable aux systèmes cyanophages-cyanobactéries, phycodnavirus-microalgues et fusellovirus-archées thermophiles16,17, démontrant son utilité dans la caractérisation des virus dans les trois domaines de la vie : bactéries, eucarya et archées.

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Protocole

1. Échantillonnage environnemental

REMARQUE : Ce protocole décrit l’échantillonnage en mer des microbes photosynthétiques de la zone euphotique à moins de 5 milles du rivage au large de la côte sud de la Californie. Cependant, le protocole a été adapté pour prélever des échantillons dans des lacs, des lacs gelés ou des sources thermales géothermiques (figure 1).

  1. Échantillonnage environnemental en mer le long de la côte sud de la Californie
    REMARQUE : Un navire de 6 m de profondeur, à console centrale (c.-à-d. un bateau) équipé de deux moteurs hors-bord de 150 hp, était chargé d’équipement de recherche (table des matériaux). Trois sites ont été sélectionnés pour l’échantillonnage de la zone euphotique : a) Site 1 : N 30° 15.436, W 117° 31.551 ; b) Site 2 : N 33° 12.521, W 117° 25.275 ; et c) Site 3 : 32° 59,914 ° N et 117° 17,058 ° O. À chaque site, 20 L d’échantillons d’eau ont été prélevés à midi à trois profondeurs différentes : < 3 m (échantillon de surface), 6 m et 14 m.
    1. Ensemble de pompe de transfert : Une fois arrivé à chaque site d’échantillonnage, déployez l’ancre du bateau et enregistrez les coordonnées GPS du système de navigation. Assemblez le système d’échantillonnage.
      1. En bref, installez une extrémité d’un tube en PVC flex-plus bleu de 2,54 cm de diamètre intérieur (50 pi) sur une crépine d’aspiration de 2,54 cm pour empêcher les gros débris de pénétrer dans le système de pompe. Fixez la jonction crépine-tube avec du ruban adhésif. Montez l’extrémité opposée du tube sur le collecteur d’admission de la pompe de transfert en acier inoxydable de 1 hp.
      2. Fixez une section de 10 pieds de tuyau flexible en caoutchouc résistant à l’effondrement de 2,54 cm de diamètre intérieur à la sortie de la pompe. Branchez le cordon électrique de la pompe de transfert dans le générateur à onduleur à gaz de 3800 W. Une fois assemblée, amorcez la pompe de transfert et testez-la pour vous assurer qu’elle fonctionne (figure 1, rangée du haut).
    2. Lestage du tube de transfert : Fixez l’une des extrémités d’une corde marine en nylon de 25 m de long et de 1,25 cm de diamètre à l’œillet d’une ancre champignon de 14 kg. Utilisez du ruban adhésif pour fixer la corde au tube en PVC bleu tous les 3 m avec la crépine d’aspiration placée à environ 1 m au-dessus de l’ancrage pour éviter que la crépine ne se loge dans le sable ou ne heurte des rochers sous l’eau. Utilisez l’ancre pour immerger le tube de transfert (tube en PVC bleu) et pour éviter que de forts courants sous-jacents ne créent un grand angle entre le bateau et le tube, ce qui donnerait des profondeurs d’échantillon imprécises. Abaissez l’ensemble ancrage/corde et tube à la profondeur.
    3. Extraction d’échantillons d’eau de mer : Une fois que l’extrémité du tube avec la crépine se trouve à la profondeur souhaitée, mettez le générateur et la pompe sous tension. Réamorcez la pompe ou secouez le tube de transfert pour que l’eau commence à pomper en profondeur. Une fois qu’un débit constant d’eau a été transféré de la profondeur, déchargez 1 à 2 volumes de tubes dans l’océan pour vous assurer que l’eau de la profondeur souhaitée s’écoule à travers la pompe. Prélever des échantillons d’eau dans des bidons d’eau de 20 L (figure 1, rangée du haut, à l’extrême droite).
    4. Transport de l’échantillon à la station de terrain : Remplir des bidons d’eau de 20 L à environ 18 L pour permettre l’échange de gaz (p. ex., O2/CO2) entre les échantillons d’eau et l’espace libre pendant le transport. Avant de boucher les cruches d’eau, notez la température, le pH et la salinité des échantillons d’eau brute. Ensuite, bouchez et placez les cruches d’eau sur un lit de glace dans un entrepôt sous le pont et couvrez d’un drap léger pour éviter une surexposition au soleil et aux températures élevées.
  2. Prétraitement sur le terrain d’échantillons d’eau
    REMARQUE : À l’arrivée dans une installation à terre (p. ex. chambre d’hôtel, salle de conférence, station de terrain), une série d’étapes de prétraitement a été entreprise pour protéger le contenu microbien des échantillons d’eau et pour séparer les différentes fractions des échantillons d’eau de mer en fonction de la taille des particules.
    1. Assemblage du système de filtration : Fixez une extrémité d’un morceau de 1 m de long de tube en vinyle transparent de 9,525 mm de diamètre intérieur à l’entrée de l’ardillon du tuyau sur l’orifice de vide d’une pompe à vide à membrane d’air portable. Fixez l’extrémité opposée du même tuyau à un ensemble de ventouses de filtre de 1,0 L, 0,45 μm. Utilisez des godets filtrants de 0,45 μm et de 0,22 μm dans l’ordre pour séparer les différentes fractions de l’échantillon d’eau de mer, comme décrit ci-dessous.
    2. Pour tester le système à la recherche de fuites ou de filtres défectueux/déchirés, filtrez 0,25 L d’eau de mer à travers la coupelle filtrante à membrane en polyéthersulfone (PES) de 0,45 μm. Un système non étanche montrera une aspiration entre le filtre et la grille une fois que l’échantillon d’eau de mer est complètement filtré.
    3. Filtration à travers une coupelle filtrante à membrane PES de 0,45 μm : Pour isoler les micro-organismes photosynthétiques (par exemple, les microalgues et les cyanobactéries), l’objectif est de filtrer 2 L d’échantillon d’eau de mer à travers la coupelle filtrante à membrane PES de 0,45 μm à l’aide de deux coupelles filtrantes de 1 L (ou quatre coupelles filtrantes de 500 mL). Étiquetez correctement toutes les bouteilles de filtrat avec la taille du filtre, la profondeur à partir de laquelle l’échantillon a été prélevé, la date et l’indicatif du site d’échantillonnage. Enfin, visser et couvrir les bouteilles contenant 0,45 μm de filtrat avec un chiffon ou un manchon semi-transparent pour éviter un ensoleillement excessif.
      REMARQUE : Ne laissez pas le filtre dans la coupelle du filtre fonctionner à sec. Gardez toujours une fine couche de liquide sur le filtre. Le filtre accumulera des débris biologiques (par exemple, des cellules). Si le filtre est obstrué par des débris, dévissez soigneusement l’ensemble de la coupelle et mettez la coupelle filtrante usagée de côté, mais ne jetez pas la coupelle bouchée. Fixez un nouveau filtre de 0,45 μm et continuez.
    4. Filtration à travers une coupelle filtrante à membrane PES de 0,22 μm : Pour isoler les grands virus eucaryotes, utilisez 1 L du filtrat de 0,45 μm de l’étape précédente (étape 1.2.3) et filtrez à travers une coupelle de filtre de 0,22 μm. Étiquetez correctement la bouteille d’ultrafiltrat avec la taille du filtre, la profondeur à partir de laquelle l’échantillon a été prélevé, la date et l’indicatif du site d’échantillonnage. Enfin, vissez le bouchon et couvrez la bouteille contenant l’ultrafiltrat de 0,22 μm (provenant de la filtration du filtrat de 0,45 μm).
      REMARQUE : Ne laissez pas le filtre dans la coupelle du filtre fonctionner à sec. Gardez toujours une fine couche de liquide sur le filtre. Le filtre accumulera des débris biologiques, qui contiennent des échantillons biologiques. Si le filtre est bouché, dévissez l’ensemble de la coupelle et mettez de côté la coupelle filtrante usagée. Ne jetez pas le gobelet bouché. Fixez un nouveau filtre de 0,22 μm et continuez.
    5. Concentré de biomasse à partir d’un filtre de 0,45 μm : Verser 48 mL de filtrat (à partir d’une filtration de 0,22 μm) dans chacun des deux tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 50 mL. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez uniformément le long du bord extérieur du filtre de 0,45 μm à l’intérieur de la cupule. À l’aide d’une pince stérile, retirez le filtre humide et chargé de biomasse. Coupez-le en deux. Enroulez la moitié du papier filtre dans un tube conique de 50 ml. Répétez l’opération avec la seconde moitié de la membrane filtrante et le deuxième tube. Vissez les capuchons de tube et fixez-les avec un film transparent. Étiquetez le tube.
    6. Concentrer la biomasse virale de grande taille à partir d’un filtre de 0,22 μm : Verser 14 mL d’ultrafiltrat dans chacun des deux tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 15 mL. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez le long du bord extérieur du filtre utilisé de 0,22 μm à l’intérieur de la cupule. À l’aide d’une pince stérile, retirez le filtre humide et chargé de biomasse. Coupez-le en deux. Enroulez et insérez la moitié du papier filtre dans l’un des tubes coniques de 15 ml. Répétez l’opération pour la seconde moitié de la membrane filtrante et le deuxième tube conique de 15 ml. Vissez les bouchons de tube et fixez-les avec un film transparent (par exemple, Parafilm). Étiquetez chaque tube avec la taille du filtre (c.-à-d. 0,22 μm), l’emplacement, la profondeur et la date.
    7. Conservez le filtrat de 0,45 μm restant ainsi que le filtrat de 0,22 μm restant pour le retour au laboratoire. Répétez tout ce processus de filtration (étapes 1.2.2 à 1.2.6) pour chaque profondeur et chaque site d’échantillonnage.
      REMARQUE : L’ultrafiltrat est utilisé en laboratoire comme base de média (avec des minéraux natifs et d’autres nutriments).
      Microscopie d’échantillon brut (facultatif) : Prenez un tube conique de 50 ml avec un filtre de 0,45 μm et secouez-le doucement. À l’aide d’un compte-gouttes en plastique (ou d’une pipette), prélever 30 à 50 ml d’eau de mer dans le tube conique de 50 ml et préparer une lame de microscope en verre avec l’échantillon et une lamelle. À l’aide d’un microscope de terrain et d’un ordinateur, visualisez le contenu des lames de microscope pour détecter et consigner les caractéristiques des microorganismes observés (figure 2D).

2. Traitement des échantillons pour concentrer les virus/bactériophages et enrichir les hôtes

REMARQUE : Ce protocole décrit les premières étapes de traitement requises une fois que les échantillons arrivent au laboratoire à partir du site sur le terrain. Le transport par avion par rapport à un véhicule routier peut nécessiter des considérations différentes. La viabilité environnementale des échantillons diminuera avec les changements brusques de température, de pH, de salinité, d’exposition ou d’absence d’exposition à la lumière, la concentration de gaz dissous (p. ex., CO2 et O2) et le temps écoulé entre l’extraction dans l’environnement et le traitement en laboratoire.

  1. Concentration et stockage des virus et des bactériophages
    REMARQUE : Une fois que les échantillons arrivent au laboratoire, le traitement dans les 8 heures suivant leur arrivée peut minimiser la perte de microbes viables en raison du laps de temps entre l’extraction au site de l’échantillon et son arrivée au laboratoire. Les étapes ci-dessous fourniront des aliquotes de suspension concentrée de bactériophages (ou de virus) (c.-à-d. des stocks de travail) pour l’entreposage et l’utilisation à long terme.
    1. Concentration de l’ultrafiltrat : Pour chaque profondeur d’échantillonnage par site, expédiez les ~800 mL restants d’ultrafiltrat au laboratoire. Utilisez un filtre centrifuge à centrifugation 3K NMWL de 15 mL et centrifugez à 6000 x g pendant 10 à 20 minutes pour concentrer 50 à 100 ml d’ultrafiltrat à 1,0 à 1,5 ml. Préparez des grilles pour l’imagerie TEM comme décrit précédemment16 afin d’évaluer s’il y a des particules pseudo-virales (VLP) dans l’ultrafiltrat concentré résultant. Si des VLP sont détectées, diviser le concentré en aliquotes de 100 ml. Conserver à 4 °C (ou -20 °C pour un stockage à plus long terme).
    2. Concentration des particules du filtre de 0,22 μm : À l’aide d’un scalpel stérile, grattez doucement les débris des filtres de 0,22 μm dans l’ultrafiltrat à l’intérieur des tubes de 50 mL dans lesquels les filtres ont été transportés. Utilisez une coupelle de centrifugation NMWL 10K pour concentrer 50 à 200 ml de suspension jusqu’à un volume de ~3 ml de rétentat d’échantillon. Préparez des grilles pour l’imagerie MET comme décrit précédemment16 afin de déterminer s’il y a des VLP du filtrat de 0,45 μm qui ont pu être capturées à la surface du filtre de 0,22 μm. Si des VLP sont détectées, diviser le concentré en aliquotes de 100 mL et le conserver à 4 °C (ou -20 °C pour un stockage à long terme).
  2. Concentration de spin et enrichissement du rétentat à partir de filtres de 0,45 μm.
    REMARQUE : Les cultures mixtes de microorganismes peuvent contenir des hôtes pour les virus et les bactériophages isolés ci-dessus (étapes 2.1.1 et 2.1.2). La concentration du spin et l’enrichissement des cultures mixtes fournissent des stocks de travail à partir desquels développer des cultures pures d’hôtes présumés (voir l’étape 3).
    1. Concentration des suspensions mixtes : Pour chaque profondeur d’échantillonnage par site, renvoyer au laboratoire ~100 mL d’ultrafiltrat avec un filtre de 0,45 μm chargé de débris cellulaires. À l’aide d’un scalpel stérile, grattez les débris du filtre de 0,45 μm dans l’ultrafiltrat dans les tubes de 50 mL dans lesquels ils ont été transportés. Centrifuger l’échantillon à 2000 x g pendant 10 min, 4 °C pour granuler la biomasse. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu BG-11 dilué 1:818 par trituration douce à l’aide d’une pipette.
    2. Enrichissement du rétentat à partir d’un filtre de 0,45 μm : Préparez six cultures parallèles dans des flacons Erlenmeyer à chicanes de 250 mL contenant : 50 mL de milieu BG-11 (3 flacons) et un mélange d’ultrafiltrat du site d’échantillonnage (40 mL) et de BG-11 (10 mL). Inoculer chaque fiole avec 0,5 mL de concentré cellulaire (à l’étape 2.2.1). Incuber en secouant légèrement dans un photobioréacteur pendant au moins 7 à 10 jours à 25 °C avec une intensité lumineuse réglée à 20-40 mmol photons/m2/s.19 Une fois que la croissance est robuste (par exemple,OD 730nm = 0,8), centrifuger à 2000 x g, 10 min, 4 °C à granuler. Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu BG-11 dilué 1:8 par trituration douce à l’aide d’une pipette. Préparez 10 à 20 aliquotes de 0,5 mL de suspension cellulaire dans des cryotubes à bouchon à vis pour un stockage à -80 °C.

3. Développement de cultures pures d’hôtes microbiens à génotype unique

REMARQUE : Le présent protocole décrit les procédures d’isolement et de purification des hôtes microbiens présumés des virus et des bactériophages à partir de cultures mixtes traitées à partir d’échantillons environnementaux prélevés. Plusieurs phénotypes d’hôtes peuvent être isolés et purifiés, ce qui augmente la probabilité de détecter des hôtes permissifs pour les virus et les bactériophages présents dans les échantillons d’eau entreposés (étapes 2.1.1 et 2.1.2).

  1. Striage des plaques et sélection des isolats d’une seule colonie
    REMARQUE : Plusieurs cultures pures à génotype unique sont mises au point à partir de cultures mixtes afin d’augmenter la probabilité d’isoler un hôte sensible et permissif de virus ou de bactériophages capturés lors de l’échantillonnage environnemental et d’étudier la gamme d’hôtes des virus et des bactériophages.
    1. Élaborer des isolats de colonie unique (LME) comme décrit ci-dessous.
      1. Préparez les plaques de gélose BG-1120. Décongeler sur de la glace une aliquote de la suspension mixte qui a été stockée à -80 °C (à partir de l’étape 2.2.2). À l’aide d’une boucle stérile, strier les concentrés cellulaires sur les plaques de gélose BG-11 en utilisant des techniques standard20. Incuber des plaques striées dans un photobioréacteur pendant ~10 jours à 25 °C avec une intensité lumineuse de 20 à 40 mmol photon/m2/s ou jusqu’à ce que des colonies apparaissent sur les plaques.
      2. Préparez ~10 cultures de graines dans des tubes de culture de 20 mL avec 5 mL de milieu BG-11 et/ou 5 mL d’un mélange d’ultrafiltrat du site d’échantillonnage et de BG-11. Prélevez une LME dans la plaque à l’aide d’un cure-dent stérile et inoculez chaque tube individuellement en déposant un cure-dent dans chaque tube. Incuber en secouant légèrement dans un photobioréacteur pendant au moins 10 à 15 jours à 25 °C avec une intensité lumineuse réglée à 20-40 mmol photon/m2/s ou jusqu’à ce qu’une croissance soit détectée (p. ex., DO730 nm = 0,4-0,8).
        REMARQUE : S’il y a plusieurs phénotypes de colonie (p. ex., morphologie, transparence, couleur) sur la première plaque de strie, sélectionnez les colonies individuelles à inoculer à partir d’une gamme de phénotypes de colonie.
    2. Mise au point de cultures pures de souches de travail : Une fois qu’une croissance positive de la culture de graines est détectée, répéter les procédures de stries jusqu’à ce qu’un seul phénotype de colonie apparaisse sur les plaques (figures 3B et 4B). Augmenter les cultures de semences à 50 mL dans des flacons chicanés de 250 mL (figures 3C et 4C) comme décrit ci-dessus (étape 2.2.2). Préparez ~20 aliquotes de 0,5 mL de suspension de cellules SCI et pipetez dans des cryotubes à bouchon à vis de 1,0 mL pour un stockage à -80 °C.
      REMARQUE : Pour le développement de cultures pures de cyanobactéries, des antibiotiques ou des antifongiques peuvent être nécessaires (p. ex., imipénème, cycloheximide) pour réduire la contamination des cultures21. La procédure de placage est un point pivot où l’isolement des cyanobactéries ou des microalgues peut être ciblé. Les paramètres d’éclairage pendant l’incubation peuvent varier en termes d’intensité lumineuse ou de cycles marche-arrêt.
  2. Caractérisation du génotype unique et stockage des stocks de travail
    REMARQUE : Pour confirmer l’isolement et l’enrichissement des génotypes individuels de l’hôte présumé, les cultures pures sont caractérisées morphologiquement et génétiquement.
    1. Caractérisation morphologique : Une fois que les cycles de culture liquide et de travail sur plaque solide aboutissent à un phénotype unicellulaire, caractériser les morphotypes microbiens à l’aide de la microscopie optique (figure 2A-C) et, si disponible, de la microscopie électronique à transmission (MET) et/ou de la microscopie électronique à balayage (MEB ; Figure 3A et Figure 4A). En microscopie optique (par exemple, grossissement de 60x à 100x), une organisation cellulaire unicellulaire, coloniale, filamenteuse, spirale, ramifiée ou trichomes verte, brun clair ou transparente peut être observée. Cela indiquera une éventuelle attribution taxonomique.
    2. Caractérisation génétique : Valider l’isolement d’un seul génotype de micro-organisme par extraction d’ADN à partir des cultures pures présumées, suivie d’un séquençage partiel du génome. Chez les cyanobactéries, le gène de l’ARNr 16S est souvent une cible (Figure 5A)22. Une analyse phylogénétique 16S permet d’identifier le groupe taxonomique22. Chez les microalgues, l’ARNr 18S est souvent ciblé23. Pour les isolats d’intérêt ou les nouveaux isolats, le séquençage du génome entier peut être poursuivi.

4. Mise au point de suspensions de virus/bactériophages à génotype unique

REMARQUE : Ce protocole décrit les procédures d’isolement et de purification de plusieurs suspensions virales et bactériophages d’un seul génotype à partir d’échantillons environnementaux.

  1. Dilution et MET des concentrés VLP
    REMARQUE : À l’aide de la MET et des tests sur plaque24, on permet de confirmer que les VLP sont de véritables bactériophages (ou virus) qui infectent les cellules hôtes.
    1. Microscopie électronique à transmission des filtrats (0,45 μm et 0,22 μm) : Utiliser des concentrés de filtration de 0,45 μm et 0,22 μm d’échantillons d’eau brute (voir l’étape 2.1) pour préparer les grilles TEM16 et l’image afin d’examiner l’hétérogénéité des particules virales (c’est-à-dire la diversité des morphotypes). Diluez les échantillons qui donnent des grilles avec une confluence élevée (p. ex., 90 %) avant de terminer les étapes suivantes pour obtenir une confluence de 30 % à 50 %. Le comptage manuel des particules ou l’utilisation d’un logiciel d’imagerie peuvent être utilisés pour estimer la confluence des cellules sur les grilles.
      REMARQUE : Une forte confluence sur les grilles peut entraîner le dégagement des pelouses hôtes sur des plaques de support solide plutôt que l’émergence de plaques individuelles qui peuvent être sélectionnées. Ainsi, la dilution des échantillons avant les tests sur plaque peut faire gagner du temps. Alternativement, plusieurs plaques de pelouse hôte peuvent être testées pour les interactions hôte-virus en utilisant des dilutions en série de concentrés VLP.
    2. Détection de l’activité bactériophage (ou virale) sur les pelouses hôtes : Sur des plaques de gélose BG-11, cultiver des pelouses hôtes présumées de cyanobactéries (ou de microalgues) à partir de stocks de travail (étape 3.1.2). Pipeter 0,5 mL de suspension VLP dans 4,5 mL de support sur les pelouses (figure 6A, à gauche) et agiter doucement jusqu’à ce que toute la surface de la pelouse soit recouverte d’une suspension. Incuber dans un photobioréacteur pendant 3 à 10 jours à 25 °C avec une intensité lumineuse de 20 à 40 mmol de photons/m2/s ou jusqu’à ce que des plaques soient visibles sur les plaques (figure 6A, à droite).
  2. Grattage de plaques et développement de suspensions de virus ou de bactériophages à génotype unique
    REMARQUE : En grattant les phénotypes individuels de la plaque et en propageant le bactériophage dans des cultures liquides de l’hôte, les interactions hôte-bactériophage (ou hôte-virus) de bonne foi sont confirmées, ce qui permet de développer des stocks de travail de bactériophages (ou de virus) pour les tests d’infection. Les stocks de travail de bactériophages (ou de virus) doivent être mesurés par l’une des méthodes suivantes (p. ex., qPCR, tests sur plaques) pour procéder à des tests d’infection à une multiplicité d’infection (MOI) définie.
    1. Isolement et propagation d’un génotype de bactériophage (ou de virus) : Une fois que les plaques individuelles sont visibles sur les plaques (en raison d’une dilution adéquate du concentré VLP), utilisez une boucle stérile pour gratter une seule plaque. Faites tourner la boucle dans une culture de graines de 10 mL de l’hôte (figure 6B, à gauche). Incuber en secouant légèrement (p. ex., 70 à 120 tr/min) dans un photobioréacteur pendant 3 à 10 jours à 25 °C avec une intensité lumineuse réglée à 20-40 mmol photon/m2/s ou jusqu’à ce que des gouttes de730 nm OD ou des débris cellulaires soient détectés au fond du tube, ce qui indique la mort/lyse cellulaire (Figure 6B, à droite)25.
      REMARQUE : Si des plaques se forment sur les pelouses hôtes, mais qu’il n’y a aucun signe d’infection en culture liquide, les plaques peuvent avoir été formées par une bactériocine26 plutôt que par un bactériophage (ou un virus). La MET peut étayer les tests sur plaque en indiquant la mort cellulaire par infection bactériophage (ou virale).
    2. Quantification du titre des stocks de travail des bactériophages (ou virus) : L’isolement des bactériophages (ou virus) est réalisé à l’aide des méthodes de filtration et de concentration de spin décrites ci-dessus. Quantifier les titres des suspensions de bactériophages (ou de virus) à l’aide d’essais de dilution en sériesur plaque 27. Vous pouvez également effectuer l’extraction de l’ADN, le séquençage du génome du virus entier et la phylogénétique (figure 5B) afin de mettre au point des amorces pour effectuer un titrage du bactériophage basé sur la qPCR afin d’établir des stocks de travail pour les tests d’infection ultérieurs.
      REMARQUE : La propagation d’un seul génotype de bactériophage (ou de virus) peut être augmentée à des cultures de 50 mL ou de 100 mL si le titre ou le volume du stock de travail est trop faible pour les besoins expérimentaux. Tenir compte de la nature du système virus-hôte (p. ex., virulence élevée ou faible virulence), de la multiplicité des infections (MOI) prévues pour les tests d’infection et du nombre de tests d’infection qui seront réalisés pour un projet lors de la mise au point de stocks de travail de bactériophages (ou de virus). Il n’est pas conseillé de décongeler et de recongeler les stocks de virus. Décongeler et utiliser un stock complet de virus à partir de répliques de la même préparation au même titre pour chaque expérience. D’autres techniques de titrage peuvent compléter les méthodes décrites, notamment l’ionisation par électronébulisation et la spectrométrie de masse (ESI/MS)28.

5. Tests d’infection

REMARQUE : Ce protocole décrit des tests d’infection hôte-phage (ou hôte-virus) qui sont utilisés pour : caractériser qualitativement la virulence, la gamme d’hôtes et le phénotype de l’infection (un indicateur de la stratégie de réplication) sur des milieux solides ; et évaluer quantitativement la cinétique de croissance, la virulencedu virus 14 et la résilience de l’hôte15 en culture liquide.

  1. Détermination de la virulence relative des bactériophages (ou virus) et de la gamme d’hôtes sur des milieux solides
    REMARQUE : Tous les essais en milieu solide, y compris les essais localisés sur pelouse, les essais sur plaque de dilution en série sur plaque unique et les essais sur plaque de résistance de l’hôte, fournissent des données qualitatives sur les paramètres d’infection bactériophage-hôte, tels que la virulence du virus, la gamme d’hôtes et la stratégie de réplication. Les tests de croissance en culture liquide permettent des mesures plus quantitatives et une modélisation de la dynamique virus-hôte.
    1. Essais ponctuels sur la pelouse : Pour déterminer la gamme d’hôtes, préparez des pelouses composées de plusieurs hôtes présumés isolés à partir d’échantillons environnementaux ou de souches acquises dans d’autres laboratoires ou collections de cultures. Sur les pelouses, repérez 2 μL de suspension de bactériophage (ou de virus) sur la pelouse à l’aide d’une pipette. Sur une région distincte de la même plaque, repérez le même volume de Triton X-100 et d’eau nanopure (18MW) comme témoins positifs et négatifs, respectivement16. Effectuer plusieurs essais ponctuels sur la pelouse avec un bactériophage (ou un virus) donné sur plusieurs hôtes afin d’évaluer la gamme d’hôtes du bactériophage16. Les phénotypes de plaque offrent un aperçu de la stratégie de réplication des bactériophages (ou virus). Les plaques qui ont des bords nets et qui s’éclaircissent jusqu’à la gélose indiquent une réplication lytique, tandis que les plaques avec des bords diffus ou un halo peuvent indiquer une réplication non lytique16,17.
      REMARQUE : Alternativement, les dosages de plaque de dilution en série sur une seule plaque indiquent s’il existe une relation linéaire entre la taille de la plaque et le titre de bactériophage. Utilisez un marqueur à l’arrière de l’assiette pour diviser l’assiette en une grille ou des sections de tarte. Ensuite, en utilisant le même volume (c.-à-d. 2 mL) mais avec des dilutions de suspension de bactériophage (p. ex. 1:1, 1:4, 1:16, 1:64), effectuer l’essai localisé sur la pelouse sur une plaque hôte unique.
    2. Essais de résistance de l’hôte : Pour déterminer si une série de bactériophages peut produire une infection sur un hôte donné, préparez une pelouse hôte sur une plaque comme décrit ci-dessus. À l’aide d’un marqueur à l’arrière de l’assiette, divisez l’assiette en une grille ou en sections de tarte. Ensuite, placez 2 ml de chaque suspension de bactériophage (ou de virus) dans une section de la grille (ou de la tarte), en utilisant du Triton X-100 et de l’eau nanopure comme témoins. Si toutes les suspensions de bactériophages (ou de virus) sont ajoutées à des titres égaux, évaluer qualitativement la virulence relative entre les souches de bactériophages (ou de virus) sur l’hôte (c.-à-d. plaque plus grande = virus plus virulent).
  2. Quantification de la virulence, de la résilience et de la croissance dans les tests d’infection en culture liquide
    REMARQUE : Les premiers résultats qualitatifs fournissent une base pour cibler des paires bactériophages-hôtes spécifiques et effectuer des analyses plus quantitatives de la dynamique des interactions virus-hôte. Dans la culture liquide, une courbe de croissance de l’hôte infecté est générée et comparée à la croissance de l’hôte non infecté (témoin).
    1. Effectuez un test d’infection par un seul virus ou un seul hôte en culture liquide comme décrit ci-dessous.
      1. Établir des cultures liquides parallèles (~6-12) d’un microorganisme (p. ex., une cyanobactérie) dont la sensibilité et la permissivité ont été révélées par des essais sur plaque en milieu solide (étape 5.1) dans des flacons de culture déflecteurs de 1,0 L (320 mL), 500 mL (160 mL de culture) ou 250 mL (80 mL de culture), comme décrit précédemment17. À un moment prédéfini (généralement un temps de doublement de l’hôte de 0,5 ou 1 hôte), inoculer un sous-ensemble de cultures parallèles à une densité cellulaire équivalente (p. ex.,DO 730 nm = 0,08) en triple exemplaire avec une suspension de bactériophage en utilisant le volume approprié requis pour produire une multiplicité d’infection (MOI) présélectionnée avec le titre de stock de travail disponible.
      2. Laisser d’autres cultures parallèles (également en trois exemplaires) non inoculées (c.-à-d. non infectées) comme témoins. Facultativement, inoculez une troisième série de cultures parallèles avec une souche de bactériophage (ou de virus) différente pour des comparaisons entre certaines paires bactériophage-hôte. Laisser les cultures se développer dans un photobioréacteur pendant 3 à 10 jours à 25 °C avec une intensité lumineuse réglée à 20-40 mmol photons/m2/s.
      3. Générer des courbes de croissance de l’hôte en prenant des lectures deDO de 730 nm à intervalles réguliers (par exemple, 8 h) à partir de cultures infectées par des bactériophages et non infectées (témoins) (Figure 7A). Utiliser la vérification TEM des cultures témoins non infectées (figure 7C) et l’infection productive dans les cultures de cellules hôtes (figure 7D). Les effets cytopathiques 29,30 sont facilement observables dans la plupart des cellules infectées, tandis que les cellules non infectées ne montrent aucun signe de transformation morphologique ou de stress.
    2. Analyse de référence pour les tests d’infection par culture liquide : À partir des tests d’infection par culture liquide à virus unique/hôte unique (SVSH), plusieurs paramètres de référence peuvent être dérivés, tels que : le taux de croissance spécifique maximal (μmax)31, la virulence relative du bactériophage (ou du virus)14 et la résilience relative de l’hôte15- pour une description plus quantitative de la dynamique bactériophage-hôte ou virus-hôte (Figure 7B). Les paramètres standard à signaler comprennent le taux de croissance (souvent exprimé en taux de croissance spécifique maximal ou μmax) et la virulence relative (VR)14 par rapport à un hôte témoin non infecté et/ou à un bactériophage distinct sur le même hôte. D’autres mesures, telles que la capacité de charge du système (N asymptote) et la résilience relative de l’hôte (R,R)15, peuvent également être rapportées.

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Résultats

L’utilisation d’une génératrice électrique portative à essence, d’une pompe de transfert d’eau et d’un tube résistant à l’effondrement constitue un moyen efficace d’extraire des échantillons d’eau de l’océan, des lacs, des lacs gelés et d’autres milieux aquatiques (p. ex. lagunes) à certaines profondeurs (figure 1, trois rangées du haut). De l’équipement alternatif est nécessaire pour les eaux acides à haute température des sources chaudes géothermiques, des...

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Discussion

La virosphère est vaste et diversifiée, ce qui nécessite différentes approches expérimentales pour étudier différents systèmes viraux. Cela comprend différentes stratégies pour isoler les virus et leurs hôtes dans différents environnements et différentes méthodes de traitement pour s’assurer que des cultures pures d’hôtes et de leurs virus peuvent être produites à partir d’échantillons bruts. Ces cultures pures peuvent être utilisées dans des tests d’infection par la SVSH, à la fois sur ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette étude a été financée en partie par la subvention OISE n° 1856091 (PI-Ceballos) de la National Science Foundation (NSF) des États-Unis et la subvention n° 2119968 de la NSF DBI (PI-Ceballos). Les auteurs remercient le Dr Chinnapong Wangnai et le Dr Chakrit Tachaapaikoon de l’Université de technologie du roi Mongkut de Thonburi (Thaïlande), qui ont fourni respectivement une vidéographie et un soutien sur le terrain pour l’échantillonnage environnemental. Les auteurs remercient également le Dr Jorge Armando Leiva Sanabria de l’Université du Costa Rica - Guanacaste pour son aide dans l’obtention de permis d’échantillonnage dans les parcs nationaux du Costa Rica et dans la collecte d’échantillons dans les piscines géothermiques. Les auteurs remercient également M. Enrique Marroquin, Jr. (Université de Californie Merced) et Mme Alexia Maceda (Université du Maine, Orono, Maine, États-Unis), qui ont aidé à l’échantillonnage au large des côtes du sud de la Californie et des lacs du nord du Minnesota, respectivement. Les auteurs remercient et remercient Mme Socheata Hour, qui a calculé les paramètres d’infection pour l’ensemble de données φSBL14-SWII.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pompe de transfert en acier inoxydable 1 hp  ;Utilitech, Charlotte, Caroline du Nord, États-UnisN/A
Tubes de 1,5 mlwww.eppendorf.com30123611
Concentrateur de spin 10K NMWL Centricon Plus 70  ;www.sigmaaldrich.comUFC701008
250 mL de flacons Erlenmeyer à chicaneswww.sigmaaldrich.comCLS4450250
Générateur Inverter 3800 watts  ;WEN Products, West Dundee, IL, États-UnisWEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 mL  ;www.sigmaaldrich.comUFC800308
Fioles Erlenmeyer à chicanes de 500 mLwww.sigmaaldrich.comCLS4450500
Carabines d’eau de 5 gallons  ;www.homedepot.comN/A
80 pieds de long, 0,5 po diamètre, nylon  ;https://facomex.mx/producto/combo/N/A
Un Sailfish 2660 à console centrale en V de 26 pieds de profondeur avec deux moteurs hors-bord Yamaha de 150 ch.https://yamahaoutboards.com/N/A
Acétate d’ammonium (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
Acide borique (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
Centrifugeuse 5920  ; Rwww.eppendorf.com5948000107
Acide citrique (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
Nitrate de cobalt(II) hexahydraté [Co(NO3)2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
Tuyau flexible en caoutchouc résistant à l’effondrement  ;swanhose.comCELTF58050
Sulfate de cuivre(II) pentahydraté (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
Tubes à centrifuger Corning 50 mLwww.sigmaaldrich.comCLS430291
Phosphate dipotassique (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
Acide éthylènediaminetétraacétique disodique (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume et spectrophotomètre et floromètrewww.denovix.comN/A
Ruban adhésif  ;www.homedepot.comN/A
Tubes Eppendorfwww.sigmaaldrich.comEP022364120
Éthanolwww.sigmaaldrich.com64175
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
Citrate d’ammonium ferrique (C6H8O7· ; xFe3+· ; yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
Tube en PVC bleu Flex-plus  ;www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - Agitateur d’incubateur empilablewww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 Microscope électronique Microscope_Transmission électronique (MET) de paillassedelongamerica.comN/A
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
Chlorure de manganèse(II) tétrahydraté (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
Mushroom Anchor noir enduit de vinyle / 30 lbswww.homedepot.comN/A
Boîtes de Pétri en polystyrènewww.sigmaaldrich.comRéf. P5481
Coupelle filtrante à membrane en polyéthersulfone (PES) de 0,22 mmwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
Coupelle filtrante à membrane en polyéthersulfone (PES) de 0,45 mmwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
Xanthogénate d’éthyle de potassium (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
Carbonate de sodium (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
Dodécylsulfate de sodium [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
Molybdate de sodium dihydraté (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
Nitrate de sodium (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
Tris(hydroxyméthyl)méthyl]-2-aminoéthanesulfonique aci (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
Triton X-100  ;www.sigmaaldrich.comRéf. T8787
Chlorhydrate de Trizma (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
Pompe à vide/pressionCole-Parmer ; Vernon Hills, IL, États-UnisEW-79204-00
Tubes en vinyle  ;www.homedepot.comN/A
Sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

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