Visualisation d’organoïdes rétiniens entiers avec résolution cellulaire

Résumé

Ce protocole combine la clarification optique et l’immunomarquage pour l’imagerie confocale à volume complet d’organoïdes rétiniens entiers. Il préserve la structure 3D, permettant une visualisation détaillée des principales voies neuronales, améliorant l’étude de la maturation rétinienne, l’organisation spatiale et ses applications potentielles dans la modélisation des maladies et la médecine personnalisée.

Résumé

Les organoïdes rétiniens dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines sont des structures 3D complexes qui imitent la rétine humaine, offrant une plate-forme puissante pour étudier le développement de la rétine, les mécanismes de la maladie et les stratégies thérapeutiques potentielles. De plus, comme ils sont dérivés de patients, ils deviennent de plus en plus populaires car ils sont très prometteurs en tant qu’outil de médecine personnalisée. Contrairement aux cultures cellulaires 2D conventionnelles, les organoïdes rétiniens préservent l’architecture 3D native de la rétine, ce qui permet une représentation plus réaliste et des études plus pertinentes sur le plan physiologique. Cependant, leur complexité structurale, leur densité cellulaire élevée et leur composition diversifiée présentent des défis importants pour la caractérisation.

Pour relever ces défis et améliorer notre compréhension de la maturation des organoïdes rétiniens tout en préservant le contexte 3D, nous avons combiné des méthodes de clarification optique avec l’immunomarquage pour visualiser la structure entière des organoïdes entiers avec la microscopie confocale. Pour cela, nous avons utilisé une méthode de clairage compatible avec les objectifs à faible et haute ouverture numérique, facilitant l’imagerie à plein volume et la capture de certaines régions d’intérêt avec une résolution cellulaire. En utilisant cette approche, nous avons identifié la morphologie et la distribution en 3D des trois principales voies neuronales responsables de la transmission de l’information visuelle : les photorécepteurs à cônes et à bâtonnets, les cellules bipolaires et ganglionnaires. Nos résultats mettent en lumière les techniques de visualisation permettant d’aborder l’organisation spatiale des cellules rétiniennes au sein de l’organoïde.

Introduction

Organoïdes rétiniens

Les organoïdes rétiniens sont des structures 3D complexes qui imitent la rétine humaine, offrant une plate-forme précieuse pour étudier le développement de la rétine, les mécanismes de la maladie et les stratégies thérapeutiques potentielles¹. Ils maintiennent l’architecture 3D naturelle de la rétine, démontrent une fidélité transcriptomique et une compétence fonctionnelle, reproduisant la phototransduction et la connectivité synaptique². De plus, ils imitent étroitement le développement in vivo ^3,4, ce qui permet une représentation plus réaliste par rapport aux cultures de cellules plates. Dans des études précédentes, Isla-Magrané et al. ont établi un protocole en deux étapes pour obtenir des organoïdes multioculaires dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) afin de modéliser les caractéristiques cellulaires de l’œil humain en développement ^5,6. En raison de la rareté des tissus fœtaux, la recherche sur le développement de l’œil humain a été limitée à des études anatomiques.

Les organoïdes rétiniens obtenus avec ce protocole présentaient une stratification appropriée et contenaient tous les principaux sous-types de cellules rétiniennes, tels que les photorécepteurs, les cellules bipolaires, les cellules ganglionnaires, les cellules amacrines et horizontales et la macroglie, ainsi que des caractéristiques morphologiques clés et une organisation et des connexions spatiales correctes. Les modèles organoïdes, bien qu’ils constituent une solution potentielle, présentent une variabilité importante, ce qui rend difficile l’obtention de résultats cohérents. Par conséquent, il est urgent d’utiliser une variété de technologies de pointe dans des modèles humains plus fiables. À ce jour, ces organoïdes n’ont été étudiés qu’à l’aide de coupes histologiques, car leur composition cellulaire complexe, leur densité et leur taille entravent la pénétration de la lumière, ce qui entraîne de mauvaises performances d’imagerie optique dans les couches plus profondes, limitant ainsi l’analyse complète.

Imagerie sur l’ensemble de la monture

Les techniques histologiques traditionnelles, qui impliquent la section et la coloration des tissus fixés, peuvent fournir des informations détaillées sur des régions spécifiques, mais ne parviennent pas à capturer l’architecture globale et les relations spatiales au sein de l’organoïde entier. Pour surmonter cette limitation, l’imagerie à monture entière apparaît comme un outil précieux pour l’étude des organoïdes rétiniens. L’imagerie à montage entier permet de visualiser l’organoïde entier dans sa forme 3D intacte, préservant ainsi la distribution spatiale des types de cellules et des composants de la matrice extracellulaire. Cette approche est particulièrement bénéfique pour étudier la composition cellulaire à l’intérieur et entre les organoïdes, fournissant une compréhension plus complète de leurs processus de développement et de leur organisation fonctionnelle. Cependant, en raison de leur densité cellulaire et de leur compaction, les organoïdes rétiniens sont opaques (Figure 1, non claircie). L’opacité inhérente des échantillons provoque une diffusion de la lumière, ce qui entrave la visualisation détaillée des structures internes à l’aide de la microscopie. Ici, les techniques de dégagement optique apparaissent comme un outil puissant.

Techniques de dégagement optique

La clarification optique fait référence aux traitements physicochimiques qui rendent transparents des échantillons biologiques épais en homogénéisant les gradients d’indice de réfraction (IR) du tissu pour correspondre à ceux de l’agent nettoyant et en éliminant les substances absorbant la lumière⁷. Ces méthodes réduisent considérablement la diffusion de la lumière et augmentent la transparence. Cette transformation nous permet de voir à travers l’ensemble de l’organoïde rétinien, ce qui permet une analyse complète de son organisation cellulaire complexe et de sa morphologie grâce à des techniques d’imagerie à montage entier. En pratique, cela est réalisé en imprégnant l’échantillon d’une substance à haute teneur en RI et en éliminant les lipides et les pigments.

Différentes méthodes de clarification sont disponibles, qui diffèrent sur divers aspects (par exemple, le degré de transparence, la compatibilité avec les techniques microscopiques, les échantillons et les molécules fluorescentes, la faisabilité, la durée), mais aucune ne se distingue comme le meilleur protocole commun⁸. Ils sont classés en quatre grands groupes : (1) l’immersion simple, (2) l’hydrophobe à base de solvant organique, (3) l’hyperhydratation et (4) l’enrobage de transformation tissulaire ou d’hydrogel, comme l’ont bien résumé Avilov et al⁷. Toutes les méthodes comprennent une étape pour l’appariement des RI, généralement en trempant l’échantillon dans une solution qui correspond à l’AR moyen du tissu. Dans les méthodes hydrophobes, les lipides et l’eau sont éliminés en trempant l’échantillon dans une concentration croissante de solvant organique (comme le méthanol ou le propanol).

Le protocole présenté est une méthode optimisée qui intègre la clarification optique à l’immunomarquage pour faciliter la visualisation 3D complète des organoïdes rétiniens avec la microscopie confocale, permettant une imagerie à volume complet tout en préservant l’intégrité structurelle. Cette approche permet d’identifier les principaux types de cellules rétiniennes au sein de l’organoïde, fournissant aux chercheurs un outil puissant pour étudier la maturation et l’organisation spatiale des organoïdes rétiniens dans un contexte physiologiquement pertinent.

Protocole

1. Préparation d’anticorps secondaires fluorescents sur mesure

REMARQUE : Cette approche sert d’alternative à l’utilisation d’anticorps fluorescents commerciaux (voir la discussion pour les avantages de la préparation d’anticorps secondaires fluorescents). De plus, ce protocole peut être utilisé pour conjuguer des fluorophores à des anticorps primaires dans le cas où une immunofluorescence directe doit être réalisée et que l’anticorps primaire fluorescent n’est pas disponible dans le commerce. Le contrôle du rapport fluorophore/anticorps en ajustant la quantité de fluorophore dans la réaction de marquage produit des anticorps conjugués plus brillants. Cependant, les anticorps secondaires fabriqués sur mesure sont moins stables et la concentration du conjugué résultant est 10 fois inférieure à celle des anticorps fluorescents commerciaux. Ce protocole est adapté des travaux décrits par Bálint et al⁹.

1. Dissoudre 1 mg de fluorophore dans du DMSO anhydre et aliquote dans des tubes pour un total final de 0,02 mg de fluorophore par tube. Retirez tout DMSO à l’aide d’un concentrateur sous vide rapide, pendant 1 h et 30 min. Stocker les aliquotes à -20 ºC à l’abri de la lumière. Pour Alexa Fluor 405, le_H2O ultrapur est le solvant approprié pour la fabrication d’aliquotes.
2. Pour effectuer la réaction de marquage, dissoudre une aliquote du fluorophore dans 1-10 μL de DMSO (ou_H2O ultra-pur pour Alexa Fluor 405).
   REMARQUE : La quantité exacte de DMSO est déterminée par des tests de conjugaison de contrôle précédents. Ces tests sont effectués lorsqu’un nouveau lot d’un fluorophore doit être utilisé (ou lorsqu’il n’y a plus d’un lot de fluorophore précédent), ou lorsqu’un nouveau fluorophore est utilisé pour la première fois dans la conjugaison. L’essai de conjugaison témoin consiste à effectuer des réactions de marquage avec des quantités variables de fluorophore afin de déterminer le rapport fluorophore/anticorps optimal dans le conjugué. Dans notre cas, le rapport optimal se situe généralement entre 3 μL et 5 μL.
3. Incuber 50 μL d’IgG secondaires (ou primaires), 6 μL de 1 M de NaHCO₃ et 1 à 5 μL de fluorophore pendant 40 min à température ambiante (RT) sur une plate-forme basculante, à l’abri de la lumière.
4. Pendant que la réaction progresse, préparez les colonnes d’exclusion de taille de purification en retirant leurs couvercles et en laissant passer le tampon. Équilibrez la colonne (une pour chaque réaction d’étiquetage) en faisant passer 3 x 2-3 mL de PBS dans la colonne. Dans le cas où la dernière étape d’équilibrage se termine avant la fin de l’incubation, remettez les couvercles en place pour éviter qu’ils ne se dessèchent et attendez la fin de la réaction d’étiquetage.
   REMARQUE : Les colonnes d’exclusion de taille de purification fonctionnent par gravité. Assurez-vous que la colonne ne se tarit pas à tout moment, sinon la réaction de purification ne fonctionnera pas correctement.
5. Lorsque la réaction est terminée (étape 1.3), ajoutez 140 μL de PBS à la réaction de marquage pour obtenir un volume d’environ 200 μL et tourbillonnez-le. Ajoutez cette solution au centre de la colonne, laissez l’échantillon entrer dans la colonne et, une fois la dernière goutte éluée, poussez en ajoutant 550 μL de PBS. Lorsque le liquide cesse de tomber, éluer en ajoutant 300 μL de PBS et recueillir dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
6. Calculez la concentration en anticorps et les rapports de marquage en mesurant l’absorbance de l’échantillon à 280 nm et l’absorbance des fluorophores utilisés. Appliquez la loi de Beer-Lambert pour déterminer la concentration (en molarité) comme suit :
   
   Où A représente l’absorbance, ε le coefficient d’extinction molaire, et CF₂₈₀ est une mesure de l’absorbance du fluorophore spécifique à 280 nm qui sert de facteur de correction. Ensuite, la concentration de l’anticorps est :
   
   Et le rapport d’étiquetage est de :
   
7. Conservez les anticorps marqués à 4 ºC, à l’abri de la lumière, jusqu’à 6 mois.

2. Marquage par immunofluorescence

1. Fixez les organoïdes avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) à RT pendant 45 min.
   REMARQUE : FACULTATIF : Incuber les organoïdes avec une solution de récupération d’antigènes (étapes 2.2 et 2.3) pour améliorer l’immunoréactivité des antigènes.
2. Préparez 40 mL de solution de récupération d’antigène en mélangeant 0,117 mg de citrate tribasique de sodium dihydraté dans du H₂O ultrapur et ajustez à pH 9.
3. Incuber les organoïdes avec la solution de récupération d’antigène en agitant doucement (30 tr/min) à 60 °C pendant 1 h.
4. Perméabiliser les organoïdes avec du PBST (PBS avec 1 % de Triton X-100) en agitant légèrement à RT pendant 4 h.
5. Bloquez les organoïdes avec une solution bloquante (albumine sérique bovine (BSA) à 2 % avec Triton X-100 à 0,1 %) à la RT pendant la nuit (ou pendant 1 jour).
   REMARQUE : Les concentrations d’anticorps primaires et secondaires dépendent de l’anticorps particulier. Pour l’immunofluorescence d’échantillons entiers, nous utilisons une concentration plus élevée par rapport aux échantillons sectionnés. Nous incubons l’anticorps primaire à 10 μg/mL, ce qui, dans la plupart des cas, correspond à 1:100 de la mère (tableau 1). Nous incubons nos anticorps secondaires sur mesure à une dose de 20 à 50 μg/mL.
6. Incuber les organoïdes avec les anticorps primaires dilués dans une solution de lavage (0,1 % BSA avec 0,1 % de Triton X-100) à 4 °C pendant 2 jours en agitant doucement.
7. Lavez les organoïdes pendant 3 x 15 min dans une solution de lavage en les secouant légèrement à RT.
8. Incuber les organoïdes avec les anticorps secondaires dilués dans une solution de lavage à 4 °C pendant 2 jours en agitant doucement.
9. Lavez les organoïdes pendant 3 x 15 min dans une solution de lavage en les secouant légèrement à RT.
   REMARQUE : Après l’immunomarquage, les colorants fluorescents de votre choix peuvent être incubés. Nous utilisons normalement des marqueurs de noyaux fluorescents, tels que DAPI (1:1 000) et DRAQ5 (1:500), ou phalloïdine (1:100) pour visualiser le réseau de filaments d’actine.
10. Incuber les organoïdes avec les colorants fluorescents dilués dans une solution de lavage à RT pendant 1 h en secouant doucement.
11. Lavez les organoïdes pendant 3 x 15 min dans une solution de lavage en les secouant légèrement à RT.

3. Dégagement optique avec FluoClear BABB

REMARQUE : Le 1-Propanol peut compromettre les contenants en plastique, en particulier pour une exposition à long terme. Pour plus de sécurité, utilisez des récipients en verre.

1. Étape de déshydratation
   1. Préparez des solutions de 1-propanol dans du H₂O ultrapur aux pourcentages donnés (15 %, 30 %, 45 %, 60 %, 75 %, 90 %), puis ajustez à pH 9,5 avec de la triméthylamine.
      ATTENTION : La triéthylamine est toxique si elle est inhalée. Travaillez sous une hotte. Les solutions peuvent être réutilisées si elles sont stockées correctement (contenant bien scellé). Ajustez le pH avant utilisation.
   2. Incuber les échantillons avec le gradient croissant de solutions de 1-propanol (15 %, 30 %, 45 %, 60 %, 75 %, 90 %) pendant 2 h chacun à 30 °C en agitant doucement.
   3. Incuber les échantillons avec du 1-propanol à 100 % pendant la nuit à 30 °C en secouant doucement.
2. Étape de déblaiement
   ATTENTION : BABB est un puissant mélange de solvants connu pour sa capacité à dissoudre ou à endommager considérablement de nombreux plastiques. Pour plus de sécurité, utilisez des récipients en verre avec des couvercles compatibles et travaillez à l’intérieur d’une hotte.
   1. Préparez le BABB en mélangeant de l’alcool benzylique (BA) et du benzoate de benzyle (BB) dans un rapport de 1:2.
   2. Immergez les échantillons dans BABB à RT pendant la nuit.
   3. Avant l’imagerie, actualisez le BABB.
      REMARQUE : Pour les organoïdes de ~1 mm de diamètre, BABB induit un effet de clarification qui est évident en quelques dizaines de minutes. Selon la taille et la nature de l’échantillon, le degré de clairance peut être différent et/ou nécessiter un temps d’exposition plus long à la solution de clarification. Nous vous recommandons d’acquérir des images avant et après l’immersion BABB afin d’améliorer le protocole de nettoyage.
   4. Stocker à long terme à 4 °C les échantillons débarrassés de BABB avec une solution de BABB. Protéger de la lumière pour préserver la fluorescence.

4. Acquisition d’images sur l’ensemble de la monture

1. À l’aide d’une pipette en verre, placez l’organoïde dans une boîte de Pétri à fond de verre avec une goutte de BABB. Assurez-vous que l’échantillon entre en contact avec la surface du verre de protection.
   ATTENTION : Veillez à ce que la goutte de BABB contenant l’échantillon n’entre pas en contact avec les bords en plastique de la boîte, sinon elle fera fondre le plastique, compromettant ainsi l’échantillon et la qualité de l’imagerie.
2. À l’aide d’un microscope confocal à balayage laser inversé équipé d’objectifs à faible et fort grossissement, acquérez des images de la pile Z pour obtenir une vue d’ensemble 3D complète de l’échantillon avec des détails cellulaires.
   REMARQUE : Pour cette étude, un objectif aérien à ouverture numérique (NA) 10x 0,4 et un objectif à 63x NA 1,4 ont été utilisés, avec une taille de pas de 3,5 μm et 1 μm, respectivement.

5. Traitement d’image

1. Recalibrez la taille du pas de l’acquisition de la pile Z en tenant compte de l’inadéquation de l’indice de réfraction (IR) entre la solution de clarification et le milieu d’immersion.
   1. Calculez la taille de pas recalibrée comme suit :
      
      Pour un échantillon intégré dans BABB, imagé avec un objectif aérien avec une taille de pas de 3,5 μm, ce sera comme suit :
      
   2. À l’aide d’ImageJ, modifiez la profondeur du voxel (cliquez sur Image | Propriétés...) pour la taille de pas recalculée.
2. Créez des projections d’images de la pile Z.
   1. À l’aide d’ImageJ, inspectez la pile Z en profondeur (cliquez sur Image | Piles | Vues orthogonales). Les vues XY, XZ et YZ de l’organoïde rétinien apparaîtront.
   2. Enregistrez les régions d’intérêt souhaitées (cliquez sur Fichier | Enregistrer sous...).
3. Créez une animation du rendu 3D de la pile Z à l’aide d’un logiciel de traitement (voir la Table des matériaux).
   1. Sélectionnez les canaux à visualiser en cochant leurs cases.
   2. Ajustez les plans Z pour visualiser l’intérieur de l’échantillon (activez l’option Écrêtage dans la case à cocher).
   3. Enregistrez l’animation à l’aide de l’éditeur de films (activez l’éditeur de films dans la case à cocher). Glissez-déposez, zoomez et dézoomez directement à l’aide de la souris. Cliquez sur Ajouter pour inclure un autre clip pour l’animation. Si vous ajustez les plans Z, activez l’option Plans de coupe (cliquez sur Paramètres... | cochez la case Clips planes ).

Résultats

Figure 1 : Comparaison de trois méthodes de déblaiement. À gauche : Images en fond clair d’échantillons (A) non effacés et (B-D) effacés. À droite : Z-stack avec vues orthogonales xz et yz de 90 organoïdes rétiniens DIV colorés avec le marqueur nucléaire DRAQ5 (jaune) acquis avec un microscope confocal à balayage laser équipé d’un objectif 10x d’air (RI = 1,00). (A) Organoïde rétinien non dégagé (N = 3). Les organoïdes rétiniens fixés au PFA ne sont pas assez transparents pour la visualisation 3D. (B) Organoïde éliminé par le fructose/glycérol (N = 3). (C) Organoïde éliminé par ECi (N = 3). (D) Organoïde FluoClear clair-BAB (N = 3). Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : BF = fond clair ; CLSM = microscope confocal à balayage laser ; RI = indice de réfraction ; PFA = paraformaldéhyde ; ECi = cinnamate d’éthyle ; BABB = alcool benzylique/benzoate de benzyle ; DIV = jours in vitro. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Comparaison des méthodes de clarification optique pour les études d’immunofluorescence dans les organoïdes neurorétiniens

Ici, nous présentons les résultats de trois méthodes de clarification pour démontrer l’efficacité de FluoClear BABB pour rendre les organoïdes rétiniens transparents. Dans la figure 1, nous observons des organoïdes rétiniens éliminés avec du fructose/glycérol (figure 1B), ECi (figure 1C) et FluoClear BABB (figure 1D). Les méthodes de clarification testées ont été choisies parce qu’il a toutes été prouvé^10,11 qu’elles sont compatibles avec la coloration par immunofluorescence et préservent la fluorescence des protéines endogènes (par exemple, la GFP présente dans les GCaMPs).

Le fructose/glycérol¹² est un protocole de nettoyage par immersion simple et non toxique qui ne nécessite pas de déshydratation, ce qui réduit considérablement le temps de traitement par rapport aux autres méthodes. Il a été rapporté qu’il est efficace pour rendre transparents les organoïdes dérivés de divers tissus : voies respiratoires, rein, foie et cancer du sein humain¹².

ECi (Ethyl Cinnamate)¹¹ est un arôme alimentaire et un additif approuvé par la FDA pour les cosmétiques^13,14, est considéré comme inoffensif et s’est avéré être un excellent réactif d’élimination pour les tissus de mammifères. Il est connu pour sa capacité d’élimination rapide et sa distorsion minimale des tissus. Il est classé comme une méthode de nettoyage hydrophobe, mais par rapport aux solvants à base de BABB, il est non toxique et préserve la fluorescence des protéines fluorescentes plus longtemps (jusqu’à 14 jours). Comme c’est souvent le cas dans la plupart des protocoles de nettoyage, ECi nécessite une étape de déshydratation préalable. Pour des résultats optimaux, cette étape est réalisée en trempant l’échantillon dans des solutions dont les concentrations en alcool augmentent progressivement. Étant donné que l’ECi n’est pas nocif, une fois l’échantillon éliminé, il peut être manipulé en toute sécurité et stocké dans des récipients en plastique. Cependant, les étapes de déshydratation sont effectuées à l’aide de 1-propanol, un solvant organique qui doit être manipulé sous une hotte et stocké dans des récipients en verre.

FluoClear BABB¹⁰ est une variante d’un protocole hydrophobe basé sur l’alcool benzylique/benzoate de benzyle (BABB) comme solution d’adaptation de l’indice de réfraction. Il est connu pour être très toxique et corrosif, il doit donc être manipulé avec soin. FluoClear BABB a été décrit comme une version améliorée qui préserve mieux la GFP et la RFP que les versions précédentes et permet l’utilisation de 1-propanol ou de tert-butanol comme agents de déshydratation.

Pour évaluer les performances des trois méthodes de dégagement, nous avons imagé des plans Z avec un microscope confocal équipé d’un objectif aérien 10x NA0.4, offrant un large champ de vision (FoV) de 2,5 x 2,5 x 2,56 mm pour capturer tout le volume de l’organoïde rétinien. Nous avons utilisé des organoïdes rétiniens à un stade intermédiaire de maturation (90 jours in vitro (DIV)) qui contiennent tous les neurones rétiniens (cellules ganglionnaires, cellules bipolaires et photorécepteurs), atteignant la densité cellulaire et la compaction et étant ainsi opaques. Comme expliqué dans l’introduction, la clairance optique est obtenue lorsque l’IR est apparié sur l’ensemble de l’objet à imager. Ainsi, le support d’immersion utilisé pour l’imagerie aura un impact drastique sur la transparence obtenue. Le tableau 2 détaille l’IR des milieux d’immersion et les solutions de clarification testées.

	Solution	Indice de réfraction
Supports d’immersion	Air	1
	Eau	1.33
	Glycérol	1.45
	Huile	1.51
Solutions de déblaiement	Fructose/Glycérol	1.468
	L’ECI	1.558
	FluoClear BABB	1.56

Tableau 2 : Indice de réfraction (IR) des milieux d’immersion les plus utilisés pour la microscopie optique et méthodologies de clarification optique testées pour l’élimination des organoïdes rétiniens. Abréviation : RI = indice de réfraction.

En comparant les images confocales résultantes (Figure 1, panneau de droite), le traitement au fructose/glycérol a entraîné la moindre amélioration de la transparence, limitant la visualisation des couches rétiniennes et empêchant la visualisation du noyau de l’organoïde. ECi a obtenu une meilleure transparence, permettant la visualisation des couches rétiniennes, mais une visualisation encore limitée du noyau de l’organoïde rétinien en raison de la diffusion de la lumière qui a entravé la détection de la fluorescence à partir des parties internes de l’échantillon. FluoClear BABB a apporté la plus grande amélioration en matière de transparence, permettant une visualisation claire du noyau et du cortex de l’organoïde rétinien à une résolution plus élevée avec une intensité de fluorescence similaire.

Il convient de mentionner que les protocoles ECi et FluoClear BABB ont induit un rétrécissement notable de l’échantillon, comme l’illustrent les images en fond clair correspondantes de chaque organoïde rétinien dégagé (Figure 1, panneau de gauche). Le rétrécissement de l’échantillon est dû aux étapes de déshydratation précédentes qui éliminent l’eau, et c’est la raison pour laquelle le protocole Fructose/Glycérol ne rétrécit pas l’échantillon. Ce rétrécissement présente toutefois une occasion unique d’approfondir l’exploration. Bien qu’il comprime la taille globale de l’organoïde et sous-estime potentiellement les distances internes, il augmente également la compacité. Cette compacité isotrope, relativement uniforme dans toutes les directions, nous permet d’exploiter des objectifs à fort grossissement avec un pouvoir de résolution supérieur (en raison de leur NA plus grand) qui, autrement, n’imageraient que la couche cellulaire la plus externe en raison de leurs distances de travail (WD) plus courtes. Par exemple, un objectif à air 10x NA 0.4 offre une WD de 2,53 mm, tandis qu’un objectif à huile 63x NA 1.4 avec une résolution nettement meilleure a une WD de seulement 0,14 mm. En utilisant des organoïdes plus compacts approuvés par BABB, nous pouvons surmonter efficacement cette limitation et obtenir une imagerie à haute résolution de structures plus profondes, telles que la couche de cellules ganglionnaires située à l’intérieur de l’organoïde (Figure 2).

Figure 2 : Reconstructions 3D d’un organoïde rétinien (200 DIV) dégagé avec FluoClear BABB imagé avec un microscope confocal à balayage laser. Le microscope était équipé d’un objectif à air (A) 10x NA 0,4 et (B) d’un objectif à huile 63x NA 1,5. Le dégagement et l’imagerie permettent de visualiser l’ensemble de l’organoïde et en même temps, d’imager avec des détails fins certaines régions d’intérêt. DRAQ5 (noyaux), opsine B+GR (cônes) et TUJ1 (neurones). Abréviations : DIV = jours in vitro ; BABB = alcool benzylique/benzoate de benzyle ; NA = ouverture numérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En conclusion, notre choix pour le nettoyage s’est porté sur FluoClear BABB car il offrait une visualisation supérieure de l’ensemble de l’organoïde rétinien avec une résolution élevée et un rapport signal/bruit élevé. Il est important de noter que le rétrécissement induit par BABB, compactant l’organoïde de manière isotrope. Cette compacité nous a permis d’exploiter des objectifs à fort grossissement pour l’exploration détaillée de structures plus profondes. Enfin, la compatibilité de BABB avec les objectifs à immersion dans l’huile a permis une diffusion minimale de la lumière et une imagerie de haute qualité sur tous les grossissements.

Identification et distribution spatio-temporelle des cellules rétiniennes au sein des organoïdes au cours de la maturation

En suivant la méthodologie détaillée ici, et en utilisant l’imagerie complète sur des organoïdes immunomarqués avec les anticorps spécifiques détaillés dans le tableau 1, nous avons étudié comment la neurorétine est façonnée à partir d’organoïdes à différents points de maturation, des premiers stades de développement (40 DIV) aux stades plus matures (jusqu’à 250 DIV), présentant une structure 3D bien définie. Cette approche nous a permis de visualiser la formation et l’organisation des différents composants rétiniens décrits dans cette section.

Anticorps	Spécificité	Cibles	Emplacement dans Retina	[ ]finale (dilution)	Hôte	#RRDI
Anti-GFP	GFP	GFP	Cellules GCaMP6s positives	10 μg/mL (1:1 000)	Ch	AB_300798
Chx10	Hypothalamus ventromédian homéobox 2 (Vsx2)	Facteur de transcription	Neuroblastes et cellules bipolaires	10 μg/mL (1:2)	Ms	AB_10842442
Opsine B	Bleu opsine	Segment externe des cônes bleus	Cônes bleus	10 μg/mL (1:100)	Rb	AB_177457
Opsin RG	Opsine vert et rouge	Segment extérieur des cônes verts et rouges	Cônes verts et rouges	10 μg/mL (1:100)	Ch	AB_11213279
RECOV	Récérine	Protéine de liaison au calcium	Photorécepteurs	10 μg/mL (1:100)	Rb	AB_2253622
RHO (RET-P1)	Rhodopsin	Segment extérieur des tiges	Tiges	63 μg/mL (1:100)	Ms	AB_260838
TUJ1	Bêta-tubuline de classe III spécifique des neurones	Isoforme de la tubuline bêta-III	Neurones	50 μg/mL (1:200)	Ms	AB_2315514

Tableau 1 : Anticorps primaires testés dans des organoïdes rétiniens à différents stades de maturation. Abréviations : Poulet = Ch ; souris = Mme ; Lapin = Rb.

L’immunomarquage avec différents marqueurs a permis d’identifier les cellules conformes à cette structure en couches. TUJ1 est une bêta-tubuline de classe III spécifique aux neurones (tableau 1), généralement utilisée dans les échantillons sectionnés pour marquer les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR)¹⁵ en raison de son abondance. TUJ1 est présent dans tous les neurones rétiniens¹⁶ et dès les premiers stades de la différenciation neuronale¹⁷. L’expression de TUJ1 a été retrouvée à tous les stades de maturation au niveau du cortex de l’organoïde, permettant le suivi de l’organisation des cellules rétiniennes en couches. Sur la figure 3, nous pouvons observer qu’aux premiers stades de développement (40 DIV), TUJ1 est uniformément distribué en une seule couche, mince et uniforme. À partir de 90 DIV, la région apicale de l’organoïde devient plus dense et plus compacte, car elle est peuplée de beaucoup plus de cellules qui s’accumulent dans la région apicale. À 170 DIV, l’organoïde rétinien a acquis une structure rétinienne stratifiée en 3D avec une couche apicale discrète. À 200 DIV, on peut voir qu’il existe d’autres corps cellulaires prolongeant de longues projections, qui sont beaucoup moins nombreuses, que l’on retrouve plus profondément à l’intérieur de l’organoïde. Enfin, à 250 DIV, la structure en trois couches nucléaires est évidente, correspondant à : (1) la couche nucléaire externe (ONL) conformée par les photorécepteurs matures, (2) la couche nucléaire interne (INL) principalement peuplée de cellules bipolaires et (3) la couche de cellules ganglionnaires (GCL) formée par les CGR, comme indiqué sur la figure 3 (en bas à droite).

Figure 3 : Organisation des neurones lors de la maturation des organoïdes rétiniens dans une structure stratifiée en couches. Projections en pile Z d’images confocales d’organoïdes rétiniens clairus FluoClear BABB colorés avec TUJ1. À 40 DIV, il n’y a pas de structures en couches formées. À partir de 170 DIV, la neurorétine se stratifie en couches. Les couches nucléaires rétiniennes sont indiquées : ONL, INL et GCL (pointes de flèches jaunes). Barres d’échelle = 25 μm (à gauche) et 10 μm (à droite). Abréviations : BABB = alcool benzylique/benzoate de benzyle ; DIV = jours in vitro ; ONL = couche nucléaire externe, INL = couche nucléaire interne ; GCL = couche de cellules ganglionnaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Avec cette méthodologie, nous pourrions également rapporter l’assemblage de faisceaux d’axones. Comme on le voit dans les régions agrandies (Figure 4), nous avons observé des faisceaux de fibres s’étendant du noyau interne de l’organoïde vers la périphérie, faisant saillie vers des régions éloignées (jusqu’à 1 mm). Il est intéressant de noter que la formation de ces fibres s’est produite à différents stades de maturation. Au fur et à mesure que l’organoïde se développe, les fibres s’épaississent, se complexifient et collectent davantage de projections cellulaires (Figure 4 [250 DIV] et vidéo supplémentaire S1). Les RGC sont les premières cellules à se différencier au cours du développement rétinien, et ainsi, elles peuvent organiser leurs projections dès les premiers stades de développement. Les CGR peuvent initier l’extension des neurites avant même d’établir leur position finale dans l’organoïde. Nos résultats s’alignent sur les rapports précédents¹⁸ qui démontrent la formation d’une structure semblable à celle du nerf optique dans les co-cultures d’organoïdes rétiniens et cérébraux.

Figure 4 : Assemblage de projections neuronales à différents stades de maturation. Les fibres s’étendent des plans internes de l’organoïde rétinien vers la périphérie. La formation de ces fibres s’est produite à travers différents stades de maturation, de 40 DIV au point de maturation le plus ancien étudié (250 DIV). Barres d’échelle = 25 μm (rangée du haut) et 100 μm (rangée du bas). Abréviations : DIV = jours in vitro. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Sur le site apical des organoïdes rétiniens, certains photorécepteurs se transforment en bâtonnets, qui contiennent de la rhodopsine dans les segments externes pour détecter la vision monochromatique dans des conditions de faible luminosité, tandis que d’autres se transforment en cônes, qui expriment les opsines bleues, vertes et rouges et sont responsables de la couleur et de la vision de haute acuité dans des conditions de lumière vive. La figure 5 (en haut) illustre la population de photorécepteurs coniques dans l’organoïde rétinien qui expriment les opsines bleues et/ou vertes/rouges (OPSINE B et GR, tableau 1). Ces cellules présentent une morphologie allongée avec les différentes opsines réparties dans tout le corps cellulaire, à l’exclusion du noyau. Notamment, l’extrémité externe de ces cellules apparaît plus brillante, ressemblant potentiellement au segment externe du photorécepteur contenant les disques. Pour visualiser à la fois les cônes bleus et vert/rouge à l’aide d’un seul canal pour la détection de fluorescence, les anticorps secondaires contre l’opsine bleue (OPSIN B, lapin) et l’opsine verte/rouge (OPSIN GR, poulet) ont été marqués avec le même fluorophore, optimisant l’utilisation du canal et rationalisant le processus d’imagerie tout en évitant le chevauchement spectral. Un sous-ensemble de cellules photoréceptrices de la figure 5 (en bas) exprimait la rhodopsine (RHO, tableau 1 et vidéo supplémentaire S2), indiquant sans équivoque leur identité en tant que bâtonnets. Ces cellules en bâtonnet partagent la morphologie allongée décrite précédemment, avec le noyau positionné au centre et le corps cellulaire riche en opsine orienté vers la périphérie de l’organoïde.

Figure 5 : Organoïdes rétiniens des derniers stades de développement. En haut : cônes matures, en bas : tiges. Projection Z d’images confocales d’organoïdes rétiniens clairus par FluoClear BABB colorés avec TUJ1 (neurones), DRAQ5 (noyaux), opsine-B+GR (cônes) et RHO (bâtonnets). Des dessins schématiques sont présentés à titre de référence. Barres d’échelle = 100 μm (à gauche) et 10 μm (à droite). Abréviations : DIV = jours in vitro ; BABB = alcool benzylique/benzoate de benzyle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les cellules bipolaires et leur distribution spatio-temporelle ont été identifiées en suivant l’expression de Chx10 (également connue sous le nom de Vsx2) sur 250 DIV de maturation (Figure 6). Chx10 (tableau 1) est un facteur de transcription essentiel à la prolifération des cellules progénitrices et à la détermination des cellules bipolaires dans la rétine en développement^19,20. En tant que gène homéobox, il est exprimé aux premiers stades de développement dans les neuroblastes, et dans la rétine mature, on le trouve exclusivement dans les cellules bipolaires. La figure 6 montre la distribution des cellules Chx10-positives au sein de l’organoïde en développement. Initialement, de nombreuses cellules positives à Chx10 sont observées s’étendant de la périphérie neurorétinienne vers le centre. Au fur et à mesure que l’organoïde mûrit, ces cellules deviennent moins abondantes et se déplacent vers l’INL, où résident les cellules bipolaires.

Figure 6 : Expression de Chx10 sur 250 DIV de maturation. Images confocales par projection Z d’un organoïde rétinien clairci par FluoClear BABB coloré avec DRAQ5 (noyaux) et Chx10 (neuroblastes et cellules bipolaires matures). Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : DIV = jours in vitro ; BABB = alcool benzylique/benzoate de benzyle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Enfin, nous démontrons que la GFP endogène des marqueurs calciques GCaMP est préservée après élimination avec cette méthodologie. Dans la figure 7, nous pouvons observer la neurorétine de 70 organoïdes rétiniens DIV infectés par Ad5-CMV-GCaMP6 et immunomarqués avec des anti-GFP (Tableau 1) pour améliorer la fluorescence après fixation à long terme.

Figure 7 : GCaMP endogène préservé dans la méthode de clarification FluoClear BABB. Un organoïde rétinien de 70 DIV infecté par Ad5-CMV-GCaMP6 immunomarqué avec des anti-GFP (cellules exprimant GCaMP), Chx10 (neuroblastes et cellules bipolaires à un stade précoce) et DRAQ5 (noyaux). Barres d’échelle = 100 μm (à gauche) et 25 μm (à droite). Abréviations : BABB = alcool benzylique/benzoate de benzyle ; DIV = jours in vitro. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire S1 : Reconstruction 3D d’un organoïde rétinien présentant un assemblage de projections neuronales. Projection Z d’images confocales d’organoïdes rétiniens clairus par FluoClear BABB à 250 DIV colorés avec TUJ1 (neurones) représenté en violet et DRAQ5 (noyaux) en jaune. Abréviations : BABB = alcool benzylique/benzoate de benzyle ; DIV = jours in vitro. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire S2 : Reconstruction 3D des bâtonnets alignés à la surface d’un organoïde rétinien à des stades avancés de développement (200 DIV). Projection Z d’images confocales d’organoïdes rétiniens clairus par FluoClear BABB à 200 DIV colorés avec RECOV (photorécepteurs) représentés en vert et RHO (bâtonnets) en violet. Abréviations : DIV = jours in vitro ; BABB = alcool benzylique/benzoate de benzyle. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Le protocole décrit ici facilite l’étude de la distribution spatio-temporelle des cellules formant l’organoïde rétinien à différents stades de maturation, en préservant son architecture 3D naturelle, un aspect critique pour la compréhension de ces modèles dans le contexte de la future médecine personnalisée. Il fournit une vue détaillée de l’architecture rétinienne au niveau des couches distinctes et des types de cellules individuelles, permettant de visualiser les structures subcellulaires tout en préservant le contexte 3D global.

L’alternative à l’imagerie à montage entier est le post-traitement de l’échantillon pour réaliser l’imagerie sur des coupes conventionnelles (paraffinée ou cryoconservée). Bien que le sectionnement fournisse des informations précieuses sur la localisation des protéines et des structures, ces données sont limitées à un seul plan, ce qui limite la compréhension des connexions cellulaires spatiales. Par conséquent, des caractéristiques telles que la proportion de cônes et de bâtonnets ou la formation de faisceaux axonaux dans des régions spécifiques peuvent ne pas être représentées avec précision, ce qui complique l’interprétation en trois dimensions. Les organoïdes rétiniens sont très hétérogènes, différentes régions contenant potentiellement différents types de cellules et/ou présentant des degrés variables de complexité et de différenciation. L’imagerie à montage entier résout ce problème car elle permet d’analyser les gradients d’hétérogénéité à l’échelle mondiale sans dépendre de la sélection d’un sous-ensemble de sections qui pourraient ne pas représenter l’intégralité de l’échantillon.

La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM)21,22,23 pourrait être utilisée comme alternative à la microscopie confocale à balayage laser. Dans le LSFM, l’échantillon est éclairé par une fine feuille de lumière de quelques microns d’épaisseur, et toute la fluorescence générée par la section optique éclairée est détectée à l’aide d’une caméra. La LSFM est une technique de détection basée sur un champ large qui représente une stratégie très efficace pour la visualisation rapide de grands volumes (jusqu’à des échantillons à l’échelle du centimètre) avec des effets minimaux de photoblanchiment et de phototoxicité. Cependant, les organoïdes peuvent présenter une aberration sphérique importante car la lumière passant à travers les surfaces courbes est réfractée différemment selon l’angle d’incidence. Dans ces expériences, cette distorsion a produit une perte de focalisation, entraînant un flou et compromettant la résolution des structures plus profondes. Pour l’imagerie de nos organoïdes rétiniens (environ 1 mm de diamètre), la microscopie confocale à balayage laser s’est avérée être l’approche la plus efficace.

Ce protocole est adapté à nos exigences expérimentales. Il peut être utilisé comme guide de départ pour les chercheurs qui s’aventurent dans l’imagerie complète d’organoïdes rétiniens optiquement clairsemés et doit être adapté si ceux-ci diffèrent. Dans cette section, les étapes critiques, les modifications et les limites de la méthodologie sont décrites en détail.

Une étape cruciale est la décision sur le protocole d’autorisation. De nombreux critères sont à prendre en compte. Tout d’abord, considérez la typologie de l’échantillon. Nettoyer les os n’est pas la même chose que nettoyer les tissus cérébraux, tout comme nettoyer les organoïdes rétiniens diffère de nettoyer les organoïdes gastriques, car chacun nécessite une approche distincte. Pour visualiser des organoïdes clairsemés d’un type différent, il est essentiel de consulter la littérature afin d’identifier les protocoles qui ont été optimisés spécifiquement pour l’échantillon d’intérêt. Le fructose/glycérol est une méthode d’élimination rapide et non toxique qui s’est avérée utile pour éliminer les organoïdes dérivés de différents tissus (organoïdes tumoraux des voies respiratoires humaines, du côlon, des reins, du foie et du sein, et organoïdes de glandes mammaires de souris)¹² , mais ne convenait pas pour rendre transparents les organoïdes rétiniens humains. À notre connaissance, aucune étude ne rapporte l’application de fructose/glycérol aux tissus neuraux/organoïdes. Par conséquent, nous concluons que cette méthode de clarification n’est pas appropriée pour clarifier les tissus neuraux. Une enquête plus approfondie est nécessaire pour élucider les raisons sous-jacentes de cette incompatibilité.

Un autre facteur critique à prendre en compte est le champ de vision requis, car il a un impact direct sur la stratégie d’imagerie et le choix des composants optiques. Des champs de vision élevés sont généralement obtenus avec des objectifs à faible grossissement, qui sont souvent conçus pour être utilisés sans milieu d’immersion (par exemple, air, RI = 1,00). Ces objectifs présentent un décalage d’IR plus important lors de l’imagerie d’échantillons approuvés par BABB (RI = 1,56), ce qui entraîne des décalages de profondeur de focalisation qui doivent être corrigés lors du post-traitement. En revanche, les objectifs à immersion dans l’huile (RI = 1,51) présentent moins de décalage RI avec les solutions de nettoyage comme BABB (RI = 1,56) et, par conséquent, ne nécessitent pas de réétalonnage.

Les méthodes d’immersion simples n’atteignent généralement pas une transparence élevée et ne conviennent pas à l’acquisition d’images de haute qualité d’échantillons entiers. Les protocoles de nettoyage des tissus influencent la résolution efficace via le gonflement ou le rétrécissement des échantillons. Selon l’objectif de l’expérience, le gonflement ou le rétrécissement peut être bénéfique. Les protocoles qui élargissent l’échantillon peuvent améliorer la résolution des détails fins dans le même système optique incapable de montrer les mêmes détails auparavant. Le retrait peut être souhaité pour visualiser de grands échantillons qui, autrement, ne rentreraient pas dans la chambre d’échantillonnage ou ne s’ajusteraient pas aux distances de travail objectives. Cependant, étant donné que le retrait comprime l’échantillon et peut déformer les distances internes, cette technique n’est pas adaptée à l’évaluation dimensionnelle ou à la mesure précise des distances intercellulaires.

Un autre facteur important à prendre en compte est la compatibilité avec les protéines fluorescentes. Principalement à base de solvants organiques, les protocoles éteignent les protéines fluorescentes car elles nécessitent des températures élevées ou dégradent les protéines fluorescentes lors de l’intégration avec des solutions d’adaptation RI. Heureusement, la plupart des méthodes sont compatibles avec les techniques d’immunomarquage. Cependant, la compatibilité de chaque épitope doit être confirmée expérimentalement.

De plus, la pénétration de grosses molécules d’IgG à travers les tissus peut être obstruée, ce qui diminue l’efficacité de la coloration et limite la visualisation de la structure ciblée à la surface de l’échantillon. La coloration d’échantillons entiers avec des anticorps peut prendre plusieurs jours (voire plusieurs semaines), selon la taille et la nature de l’échantillon, ce qui augmente considérablement la durée du protocole.

Enfin, la compatibilité avec l’instrument optique est obligatoire. La plupart des méthodes à base de solvants organiques (à l’exception de l’ECi) sont très corrosives et ne sont pas chimiquement compatibles avec les chambres d’échantillonnage commerciales et les objectifs d’immersion. De plus, certaines solutions de déblaiement ont un IR qui ne correspond pas à la portée requise par les objectifs disponibles (généralement de l’eau).

Certaines étapes du protocole nécessitent une attention particulière. FluoClear BABB, en tant que méthode de nettoyage hydrophobe, nécessite une étape de déshydratation préalable. Le pH joue un rôle important dans la préservation de la fluorescence des protéines endogènes telles que la GFP. Ensuite, il est crucial de s’assurer que le pH des solutions alcoolisées est correctement ajusté. La déshydratation est la clé d’une élimination complète. Des résultats optimaux sont obtenus en incubant les échantillons avec un gradient croissant de solutions alcooliques.

La taille de l’échantillon joue un rôle important pour permettre aux anticorps d’atteindre leurs cibles spécifiques. Les anticorps peuvent ne pas pénétrer de manière homogène et être retenus à l’extérieur de votre échantillon. Si cela se produit, envisagez de passer à un autre type de détergent (Tween-20 ou Saponin), en augmentant la concentration et le temps d’incubation du détergent et des anticorps. Si ces ajustements sont insuffisants, d’autres stratégies peuvent améliorer la perméabilisation des anticorps. Pour l’immunomarquage complet de grands échantillons (échelle centimétrique), les chercheurs ont découvert que le SDS peut faciliter une pénétration plus profonde des anticorps²⁴. Le SDS induit une perte partielle de la structure tertiaire des anticorps, linéarisant efficacement la protéine et lui permettant de pénétrer plus profondément dans le tissu. Ensuite, le lavage du SDS restaure les propriétés de liaison à l’antigène des anticorps, ce qui permet une coloration plus uniforme des tissus plus épais et réduit le gradient couramment observé d’un marquage plus fort à la surface de l’échantillon.

La préparation de vos propres anticorps secondaires fluorescents offre plusieurs avantages, car elle offre une plus grande flexibilité dans la conception de l’immunomarquage, ce qui permet de sélectionner la combinaison spécifique d’anticorps fluorophores-secondaires, augmentant ainsi le nombre de couleurs pouvant être utilisées dans le même échantillon. De plus, le rapport fluorophore/anticorps peut être réglé, de sorte qu’ils sont généralement plus brillants. Cependant, certains aspects doivent être pris en compte. Les anticorps secondaires fabriqués sur mesure sont généralement moins stables que ceux disponibles dans le commerce et doivent être utilisés frais. La plupart conservent leur affinité avec les ligands pendant 3 à 6 mois à 4 °C, mais la stabilité doit être déterminée expérimentalement, car certaines combinaisons pourraient se dégrader plus rapidement. De plus, certaines associations anticorps-fluorophore peuvent modifier l’affinité de l’anticorps pour son épitope, entraînant un marquage non spécifique partiel ou complet. Pour garantir la fiabilité, il est conseillé de tester d’abord des anticorps secondaires sur mesure à l’aide de contrôles, tels que des cellules en culture, avant de les appliquer sur des échantillons expérimentaux.

Ce protocole optimisé intègre la clarification optique avec l’immunomarquage pour faciliter l’imagerie confocale des organoïdes rétiniens entiers. Il préserve l’intégrité structurelle et permet l’identification des principaux types de cellules rétiniennes au sein de l’organoïde. Ainsi, le protocole fournit aux chercheurs un outil puissant pour étudier la maturation des organoïdes rétiniens et l’organisation spatiale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10x objectif NA0.40 DRY	Leica	HC PL APO CS2	-
63x objectif NA1.40 OIL	Leica	HC PL APO CS2	-
anticorps anti-GFP	Abcam	AB13970	-
Alcool benzylique (BA)	Sigma Aldrich	13162	-
Benzoate de benzyle (BB)	Sigma Aldrich	W213802	-
Boîte de Pétri en verre à fond	MatTek	P35G-1.5-14-C	-
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	-
Anticorps Chx10	Sta Cruz Biotech	SC-365519	-
Colonnes de filtration gel Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25	Sigma Aldrich	17-0853-02	-
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	-
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	-
DRAQ5	Thermopêcheur	62251	-
Colorant (acide carboxylique, ester de succinimidyle)	Invitrogen ou Abberior	-	-
ImageJ/Fidji  ;	NIH	; v1.50i	-
Microscope confocal à balayage laser inversé	Microsystèmes Leica	TCS SP8 STED 3X-FALCON	-
Logiciel de traitement 3D LAS X	Microsystèmes Leica	-	-
mQ H2O	-	-	Eau ultrapure issue du système de purification d’eau Synergy
NaHCO3	Acros Organics	424270010	-
IgG secondaires non marquées	Jackson Immunorecherche	-	-
Anticorps bleu d’opsine	Millipore  ;   ;	AB5407  ;	-
Anticorps Opsin RG	Millipore	AB5745  ;	-
Paraformaldéhyde (PFA) 4 %	Thermo scientifique  ;	J199943-K2	-
PBS Solution	Gibco	18912-014	-
Sondes de marquage à la phalloïdine	Thermopêcheur	-	-
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco  ;	10010023	-
Anticorps RECOV	Millipore	AB5585-I  ;	-
Anticorps RHO (RET-P1)	Sigma Aldrich	O4886  ;	-
Citrate de sodium tribasique dihydraté	Sigma Aldrich	Réf. C8532	-
Triton X-100	Sigma Aldrich	Réf. T8787	-
Anticorps TUJ1	Covance  ;	MMS-435P  ;	-