Method Article

La microscopie électronique à transmission comme technique de visualisation pour l’analyse de la plasticité synaptique circadienne dans le cortex cylindrique de la souris

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole présenté décrit l’utilisation de la microscopie électronique à transmission (MET) pour quantifier les changements circadiens dans le cortex du baril de la souris, en se concentrant principalement sur le nombre de synapses et la morphologie de la colonne dendritique.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude de la plasticité synaptique circadienne nécessite de loger des souris dans différentes conditions d’éclairage (cycle lumière/obscurité, LD 12:12, et obscurité constante, DD), de leur donner accès à des roues en marche et de les sacrifier à quatre points de temps définis dans les 24 heures - au début et au milieu de la journée/journée subjective et au début et au milieu de la nuit/nuit subjective. Les cerveaux sont ensuite correctement fixés pour la microscopie électronique à transmission (MET). Le cortex en baril, avec son organisation somatotopique précise, fournit un modèle idéal pour une telle analyse. Pour obtenir la zone cérébrale requise, les cerveaux sont coupés tangentiellement avec un vibratome, puis des sections contenant le cortex cylindrique sont sélectionnées et intégrées dans de la résine Polybed. À partir des blocs préparés contenant les canons sélectionnés, des sections ultraminces consécutives sont découpées. La densité synaptique, excitatrice et inhibitrice, est analysée à partir de micrographies électroniques à l’aide de la méthode du dissecteur stéréologique. De plus, les images TEM sont utilisées pour les reconstructions 3D des épines dendritiques. Les changements dans la forme des épines dendritiques indiquent un remodelage des neurones au cours de la journée. Le nombre de synapses excitatrices atteint un pic pendant le sommeil (jour) chez la souris, tandis que les synapses inhibitrices atteignent un pic pendant leur phase d’activité (au milieu de la nuit).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les rythmes circadiens sont générés par les horloges circadiennes dans presque tous les processus d’un organisme. Chez les animaux et les humains, ils ont été détectés aux niveaux moléculaire, cellulaire et de l’organisme entier, ainsi que dans leur comportement. Le système circadien d’un organisme se compose de l’horloge circadienne principale (stimulateur cardiaque) et des horloges périphériques. Toutes les horloges circadiennes génèrent des oscillations circadiennes par l’expression cyclique des gènes de l’horloge, qui sont contrôlés par leurs protéines. Le mécanisme moléculaire de l’horloge génère des rythmes circadiens avec une période de ~1 jour (plus longue ou plus courte que 24 h), mais dans des conditions jour/nuit, la période des rythmes endogènes est synchronisée à 24 h. De nombreux rythmes circadiens ont été détectés dans la physiologie du système nerveux des invertébrés et des vertébrés ; Cependant, certaines études ont montré qu’ils sont également présents dans la plasticité synaptique et neuronale, c’est-à-dire des changements dans le nombre et la structure des synapses et des dendrites 1,2,3,4.

Le cortex somatosensoriel de la souris constitue un excellent site pour étudier la plasticité synaptique tout au long de la journée en raison de son organisation bien définie et de son lien direct avec l’activité locomotrice animale 5,6,7,8,9. Dans la couche IV du cortex somatosensoriel, il existe des structures neuronales distinctes (tonneaux) qui sont très perceptibles même dans un cerveau non coloré10,11. Leur disposition reflète la morphologie et l’organisation des moustaches sur le museau de l’animal, permettant une cartographie précise des stimuli sensoriels. Les grands tonneaux sont organisés en cinq rangées régulières, chacune contenant entre quatre et sept barils. Les rangées de barils qui correspondent à de grandes moustaches sont marquées de lettres majuscules de A à E et représentent les moustaches disposées du contour des yeux vers le bas le long du museau. Chaque baril se compose de deux zones principales : le creux, la partie centrale remplie de neuropil, et la paroi appelée le côté, qui est dominée par les corps des cellules étoilées. Les barils sont séparés les uns des autres par des zones de densité cellulaire plus faible, appelées septa. Chaque baril reçoit des impulsions d’une moustache spécifique située sur le côté controlatéral du museau de l’animal10,12.

La division en canons spécifiques, disposés en rangées régulières, permet une identification rapide et facile de la zone sélectionnée10,13. La sélection des barils de la rangée B pour l’analyse des changements circadiens est basée sur des études de plasticité dépendante de l’activité 14,15,16,17. La rangée B est caractérisée par des limites somatotopiques bien définies et ne contient que quatre grands barils distincts, ce qui simplifie son emplacement dans les échantillons. En raison de sa position centrale, l’activité neuronale de la rangée B est corrélée aux comportements naturels de la souris tels que l’exploration de l’environnement et l’activité locomotrice. Pour compter les synapses sur les épines et les tiges dendritiques, il est important de sélectionner les parties centrales des barils, où les corps cellulaires sont clairsemés 12,15,18.

L’immunohistochimie combinée à l’imagerie par microscopie confocale est une technique qui a joué un rôle crucial dans la clarification des mécanismes clés de la plasticité synaptique chez la souris. Bien que l’utilisation de la microscopie confocale fournisse des images haute résolution avec une fluorescence de fond réduite et une clarté de structure cellulaire améliorée, elle souffre de photoblanchiment et nécessite une préparation complexe des échantillons, ce qui peut modifier l’état des tissus biologiques. Sa dépendance à l’égard de marqueurs fluorescents peut limiter les types de protéines qui peuvent être étudiées simultanément en raison de leur chevauchement. La microscopie confocale à immunofluorescence permet de marquer des protéines spécifiques, leurs niveaux d’expression et la localisation associée à l’activité synaptique en utilisant des anticorps pour détecter les antigènes cibles dans des coupes de tissus fixés. Bien que cette méthode offre spécificité et flexibilité pour étudier diverses protéines impliquées dans la neurotransmission, elle est limitée par son incapacité à fournir des données en temps réel sur les processus dynamiques en raison de l’étape de fixation impliquée. L’incohérence de la liaison de l’anticorps pourrait également entraîner des résultats peu fiables 19,20,21.

L’utilisation de la microscopie électronique au lieu des méthodes d’immunofluorescence avec la microscopie optique permet une résolution nettement plus élevée et une plus grande précision dans la sélection de la localisation et la distinction des structures neurales. Les coupes de microscopie électronique à transmission en série (MET) aident à visualiser la structure synaptique au niveau ultrastructurel et ont l’avantage d’être utilisées pour étudier la formation ou l’élimination des synapses. La MET permet aux chercheurs d’analyser les propriétés physiques des synapses et les changements de densité et de structure qu’on appelle la plasticité des synapses. Bien que la préparation des échantillons et l’imagerie nécessitent beaucoup de main-d’œuvre, la TEM fournit une compréhension plus détaillée des changements qui se produisent pendant l’apprentissage, la formation de la mémoire et le traitement de l’information sensorielle, ainsi que pendant la journée, l’année et l’âge de l’animal.

Notre méthode vise à étudier la dynamique circadienne de la densité synaptique et de la morphologie en utilisant une approche basée sur un minimum de quatre points temporels combinée à la méthode du dissecteur stéréologique basée sur des images TEM en série. La méthode du dissecteur stéréologique permet d’estimer de manière fiable le nombre de synapses même en n’utilisant que quelques coupes en série ultraminces 22,23,24,25,26. L’organisation somatotopique bien définie du cortex cylindrique assure une sélection anatomique précise des emplacements d’étude, tandis que la TEM en série permet de différencier les types de synapses (excitatrices et inhibitrices) et leurs emplacements (sur les épines et les tiges dendritiques). Cette méthode constitue un outil précieux pour les chercheurs qui étudient la neuroplasticité diurne et circadienne, permettant d’explorer comment les facteurs environnementaux et internes influencent la dynamique synaptique. Les composants individuels de notre méthode permettent son application pour l’analyse des changements de neuroplasticité dans un éventail beaucoup plus large d’études, qui ne se limitent pas nécessairement aux changements liés au rythme circadien.

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Protocol

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Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par le comité d’éthique institutionnel approprié et menées conformément à la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, ainsi qu’aux réglementations nationales. Tous les efforts ont été déployés pour minimiser la souffrance animale et réduire le nombre d’animaux utilisés.

1. Préparation des tissus cérébraux

  1. Sacrifiez des souris à quatre moments différents toutes les 6 heures sur un cycle de 24 heures, dans des conditions de lumière/obscurité (LD 12:12) et d’obscurité constante (DD) (Figure 1). Dans les conditions LD 12:12, reportez-vous à l’heure de Zeitgeber (ZT), où ZT0 correspond au début de la phase de lumière et ZT12 au début de la phase sombre. Dans l’obscurité constante, reportez-vous au temps circadien (TC), où CT0 représente le début du jour subjectif et CT12 désigne le début de la nuit subjective.
    REMARQUE : Les points temporels sont ZT0/CT0 (début de la journée, jour subjectif), ZT6/CT6 (milieu de la journée, jour subjectif), ZT12/CT12 (début de la nuit, nuit subjective) et ZT18/CT18 (milieu de la nuit, nuit subjective).
  2. Perfuser et fixer le cerveau de souris avec 2,5 % de glutaraldéhyde et 2 % de paraformaldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4).
  3. Retirer chaque cerveau du crâne et le laisser dans une solution fixatrice (2,5 % de glutaraldéhyde et 2 % de paraformaldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4) pendant 24 h à 4 °C.
  4. Pour préparer le cerveau à la section, coupez le cervelet et divisez le cerveau en deux hémisphères (Figure 2A, B).
  5. Choisissez un hémisphère (droit ou gauche) et orientez-le de manière à ce que les sections soient coupées tangentiellement au cortex du canon. Montez l’hémisphère sélectionné sur le mandrin du vibratome et collez-le fermement (Figure 2C).
  6. Couper des sections à 60 μm d’épaisseur (vitesse de la section du vibratome : 7,10 et fréquence : 5,00) (Figure 2D) puis transférer les sections dans le mélange de tampon phosphate 0,1 M et de solution fixatrice (rapport 1:5).
  7. Examinez les sections au microscope optique avec un grossissement de 4x et ne prélevez que celles dont le cortex du champ de barillet est visible pour l’étape suivante (figure 2E). Utilisez la glissière concave pour vous assurer que la section reste constamment dans le liquide.

2. Fixation et sectionnement du cerveau

  1. À l’aide d’un pinceau, transférez délicatement les mouchoirs dans une petite boîte de Pétri en verre. Ensuite, rincez les sections cérébrales dans le tampon cacodylate 0,1 M (BC, pH 7,4) pendant 3 x 5 min.
  2. Fixer les sections dans du tétroxyde d’osmium à 1 % (OsO4) dans 0,1 M BC avec du ferricyanure de potassium à 1,5 % et laisser à +4 °C pendant 1 h.
    REMARQUE : Préparez la solution OsO4 immédiatement avant utilisation car OsO4 est instable et son activité diminue avec le temps.
  3. Post-fixer les sections dans 1 % d’OsO4 dans une solution de 0,1 M BC pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE : Effectuez toutes ces étapes en portant des gants de protection et sous la hotte avec une ventilation fonctionnelle car l’OsO4 est très toxique.
    Les déchets doivent être conservés dans une bouteille séparée avec un bouchon hermétique. Ne laissez pas le produit pénétrer dans les drains.
  4. Après la fixation, rincer les sections à l’eau distillée pendant 2 x 5 min.
  5. Dans l’étape suivante, incubez des sections de cerveau pendant 40 minutes dans la solution d’éthanol à 70 % contenant 1 % d’acétate d’uranyle. Après avoir mélangé, utilisez une seringue munie d’un filtre (25 mm) et versez lentement 2 ml de la solution dans chaque boîte de Pétri avec les mouchoirs.
  6. Déshydrater les tissus à des concentrations croissantes d’alcool : 70 %, 80 % et 90 % d’éthanol pendant 5 min chacun et 100 % d’éthanol, 3 x 5 min chacun.
    REMARQUE : Il est possible de laisser les mouchoirs dans de l’éthanol à 70 % pendant la nuit à +4 °C.
  7. Laver les mouchoirs à l’oxyde de propylène 2 x 10 min.
    REMARQUE : L’oxyde de propylène est un produit chimique hautement corrosif ; Utilisez-le avec prudence tout en portant des gants de protection et en travaillant sous la hotte. L’utilisation d’un récipient en verre (boîte de Pétri en verre) est cruciale pour cette étape.
    L’oxyde de propylène est un liquide et une vapeur extrêmement inflammables. Les déchets doivent être conservés dans un récipient en verre séparé et hermétiquement fermé. Ne laissez pas le produit pénétrer dans les drains, il y a un risque d’explosion.
  8. Remplacez l’oxyde de propylène par un mélange de résine Polybed et d’oxyde de propylène (rapport 1:1). Verser au moins 2 ml de la solution dans chaque boîte de Pétri avec les sections, couvrir avec un couvercle et incuber pendant 40 min.
  9. Enfin, intégrez des sections cérébrales dans le mélange de résine Polybed et d’oxyde de propylène (rapport 3:1). Utilisez au moins 2 ml du mélange par boîte de Pétri, couvrez-la et laissez reposer 1,5 h.
    REMARQUE : Assurez-vous que les mouchoirs sont complètement immergés et assurez-vous qu’ils ne flottent pas au-dessus du liquide.
  10. Coupez le film Aclar en morceaux de la taille d’une lame de verre. À l’aide d’une pipette en plastique, appliquez un petit volume de résine sur le film Aclar et transférez les sections cérébrales de la boîte de Pétri à la résine à l’aide d’un pinceau. Enfoncez chaque section entre deux films Aclar et incubez pendant 48 h dans un four à 65 °C pour polymériser.

3. Imagerie et sectionnement du cortex en baril

  1. Photographiez des coupes cérébrales à un grossissement d’objectif de 2x avec un microscope optique (Figure 2F).
  2. Collectez toutes les images et importez-les dans un logiciel graphique.
    1. Pour ouvrir les images, cliquez sur Fichier |Ouvrez et sélectionnez les images à l’aide de Maj |Ouvrez. Les images s’ouvriront dans des fenêtres distinctes.
    2. Commencez à empiler les images du cortex (le plus petit morceau) et continuez jusqu’à ce que toutes les sections soient correctement alignées.
    3. Faites un clic droit sur le calque 1 |Dupliquer le calque sur chaque image. Dans la boîte de dialogue, entrez le numéro de l’image comme nom, choisissez une image comme fichier de destination, puis cliquez sur OK. Répétez ces étapes pour toutes les images, en les dupliquant dans le même fichier de destination.
    4. Alignez les images pour reconstruire le champ du canon, en assurant un ordre anatomique correct. Utilisez l’outil Déplacer pour positionner chaque calque manuellement, puis cliquez sur Modifier |Transformer |Rotation ou retournement de l’outil pour ajuster l’orientation si nécessaire. Pour affiner l’alignement, utilisez Edition | Transformer | Déformez et déplacez les coins de l’image pour qu’ils correspondent aux structures anatomiques indépendamment. Pour faciliter l’alignement, réglez le mode de fusion du calque supérieur sur Superposition dans le panneau Calques .
    5. Comparez les repères anatomiques tels que les contours du canon et les vaisseaux sanguins pour assurer un positionnement correct. Pour enregistrer la pile, cliquez sur Fichier |Enregistrer sous, nommer le fichier et choisir son format (PSD ou TIFF) ; cliquez ensuite sur OK.
  3. Examinez les multiples sections contenant le champ de barils de manière séquentielle, en identifiant les barils visibles dans chaque section.
  4. Tracez manuellement le contour de chaque canon visible sur une couche commune supplémentaire, en assurant la reconstruction de l’ensemble du champ du canon. Pour créer un calque supplémentaire, cliquez sur Calque |Nouveau |Calque, nommez-le, puis cliquez sur OK. Sélectionnez l’outil Pinceau dans la barre d’outils et, sur le nouveau calque, dessinez manuellement chaque barillet visible.
    1. Pour une plus grande précision, utilisez le zoom et ajustez la taille du pinceau selon vos besoins. Pour effectuer un zoom avant ou arrière sur l’image, utilisez l’outil Zoom ou appuyez sur Ctrl + « + » / Ctrl + « -« . Pour modifier la taille du pinceau, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le canevas pendant que l’outil Pinceau est actif et déplacez le curseur Taille .
  5. Identifiez le canon sélectionné sur la base de cette reconstruction.
  6. Trouvez le baril sélectionné au microscope optique en fonction de la configuration du champ de baril (cinq rangées, chacune de quatre à sept barils) et de la disposition des vaisseaux sanguins qui indiquent son emplacement dans le champ de baril.
  7. Dans chaque section avec un cortex de canon visible, identifiez le canon sélectionné au microscope stéréoscopique et découpez-le avec le canon adjacent à l’aide d’une lame de rasoir.
  8. Retirez le petit morceau de la section, collez-le sur un bloc de résine et mettez-le à sécher. Plus tard, coupez l’excès de résine entourant le tissu.
    REMARQUE : Assurez-vous de placer le morceau de tissu à plat sur la surface de la résine.
  9. À l’aide d’un ultramicrotome et d’un couteau diamanté, coupez des sections consécutives ultraminces (3 à 6 sections, 65 nm d’épaisseur) (Figure 3A) et collectez-les sur des grilles de nickel à fente unique recouvertes de formvar (2 x 0,75 mm).
  10. Une fois secs, contrastez les échantillons avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 3 min et du citrate de plomb à 0,03 % pendant 1,5 min.
    REMARQUE : Pour contraster, il est important de laver les grilles plusieurs fois et de les laisser sécher complètement après chaque étape. Utilisez des seringues avec des filtres pour l’acétate d’uranyle et le citrate de plomb.
  11. Prendre des images consécutives depuis le creux du canon sélectionné (par exemple, B2) sous un MET (tension d’accélération de 80 kV à des grossissements de 4K ou 8K, en fonction de la zone et du volume requis pour l’analyse.
    REMARQUE : Habituellement, au moins un volume total de 100 μm3 par animal est analysé.

4. Analyse d’images

REMARQUE : La création et l’alignement de piles d’images TEM peuvent se faire de la même manière à l’aide de logiciels gratuits (comme GIMP) et commerciaux (par exemple, Photoshop). Les reconstructions peuvent également être effectuées de la même manière à l’aide de logiciels commerciaux (par exemple, 3D Studio Max) et de programmes entièrement gratuits, tels que Blender.

  1. Pour estimer la densité des synapses, empilez un minimum de trois images TEM dans le logiciel graphique (Figure 6). Plus le nombre d’images en série est élevé, plus la précision des calculs est élevée.
    1. Pour ouvrir les images, cliquez sur Fichier |Ouvrez et sélectionnez les images à l’aide de Maj |Ouvert ; Les images s’ouvriront dans des fenêtres distinctes.
    2. Pour chaque image, faites un clic droit sur Calque 1 |Dupliquer la couche. Dans la boîte de dialogue, entrez le numéro de l’image comme nom, choisissez une image comme destination, puis cliquez sur OK. Répétez les mêmes étapes pour toutes les images et dupliquez-les dans la même destination.
    3. Pour enregistrer la pile, cliquez sur Fichier |Enregistrer sous, nommez le fichier, choisissez son format (PSD ou TIFF), puis cliquez sur OK.
  2. Pour aligner les images TEM, sélectionnez le calque supérieur de l’image et réglez le mode de fusion sur Superposition dans le panneau Calques . Utiliser Modifier |Transformer |Rotation ou l’outil Retournement pour ajuster l’orientation de l’image. Utilisez l’outil Déplacer pour aligner les structures.
    1. Pour des réglages plus précis, utilisez Edition |Transformer | Déformer pour déplacer les coins de l’image indépendamment. Pour augmenter la précision, maintenez la touche Ctrl enfoncée et faites glisser des points d’angle individuels. Utilisez les changements de taille et de forme des mitochondries et des gaines de myéline axonale entre les images TEM successives pour vérifier la séquence correcte des images.
  3. Utilisez une méthode de dissecteur pour compter les synapses.
    1. Ajoutez un calque à la pile d’images EM en cliquant sur Calque |Nouveau |Calque |D’accord. Assurez-vous que le nouveau calque est transparent (sans remplissage d’arrière-plan).
    2. Pour définir la zone d’analyse, cliquez sur Couche |Nouveau |Calque |D’accord ; puis sélectionnez l’outil Rectangle , allez dans Calque |Style de calque |Trait, définissez la couleur, l’épaisseur (Taille) et la position (Intérieur recommandé), cliquez sur OK et tracez un rectangle. Sélectionnez Remplissage : 0 %. Marquez toutes les synapses présentes dans les images TEM qui ne traversent pas deux bords adjacents du rectangle (par exemple, la droite et le bas ou le haut et la gauche).
    3. Ajoutez un nouveau calque pour les annotations en cliquant sur Calque |Nouveau |Calque |D’accord. Utilisez l’outil Pinceau pour marquer les synapses sur le nouveau calque. Utilisez l’outil Zoom et l’outil à main pour un marquage précis.
    4. Choisissez une couleur pour marquer les synapses excitatrices et une autre pour les synapses inhibitrices. Pour modifier la couleur, cliquez sur la case de couleur de premier plan dans la barre d’outils, sélectionnez une couleur dans la fenêtre du sélecteur de couleurs , puis cliquez sur OK.
  4. Si les images TEM contiennent de grandes structures (par exemple, des fibres nerveuses myélinisées, de grandes dendrites ou des parties du corps cellulaire), utilisez une grille avec plusieurs carrés. Cela permet d’exclure toutes les places entièrement occupées par de grandes structures.
    1. Ajoutez un nouveau calque transparent en cliquant sur Calque |Nouveau |Calque |D’accord. Activez la vue en grille en cliquant sur Afficher |Spectacle |Grille, et activez l’alignement sur la grille en cliquant sur Affichage |Aligner sur |Grille.
    2. Définissez l’espacement de la grille en cliquant sur Modifier |Préférences |Guides, grille et tranches. Sélectionnez l’outil Ligne , réglez le mode sur Forme ou Pixels, définissez l’épaisseur de la ligne (par exemple, 1 px) et tracez des lignes verticales et horizontales le long de la grille visible pour couvrir toute la zone de l’image.
  5. Définissez les sections « haut » et « bas » de chaque pile d’images. Ne comptez que les synapses absentes de la dernière image mais présentes dans les images précédentes. Cela permet d’identifier avec précision les synapses sans surestimer leur nombre.
  6. Utilisez l’échelle sur l’image et calculez le volume de l’échantillon (pile d’images TEM). Mesurez la zone où les synapses sont comptées et multipliez-la par le nombre d’images TEM dans la pile et l’épaisseur des sections ultraminces.
  7. Divisez le nombre de synapses par volume pour déterminer la densité de synapses par unité de volume.
  8. Utilisez toutes les images TEM contenant une épine dendritique (généralement 10 à 12 micrographies électroniques consécutives) pour reconstruire une épine dendritique et les synapses qu’elle forme.
    1. Ouvrez la pile d’images dans le logiciel graphique. Sélectionnez l’outil Recadrage , marquez la zone contenant l’épine dendritique dans la pile et appuyez sur Entrée. La zone sélectionnée sera recadrée dans tous les calques visibles. Ne rendez visible qu’un seul calque à la fois, masquez les autres calques à l’aide de l’icône en forme d’œil dans le panneau Calques .
    2. Enregistrez chaque image recadrée séparément en cliquant sur Fichier |Enregistrer sous, nommez le fichier, choisissez un format (JPG recommandé), puis cliquez sur OK. Répétez l’opération pour chaque couche de la pile.
      REMARQUE : Avant de transférer les images vers un logiciel de reconstruction 3D, il est préférable de marquer d’abord les éléments qui sont reconstruits avec des couleurs.
    3. Ajoutez un nouveau calque pour l’annotation en cliquant sur Calque | Nouveau |Calque | D’accord.
    4. Réglez l’opacité du calque sur 30-50 % dans le panneau Calques .
    5. Sélectionnez l’outil Pinceau , choisissez une couleur différente pour chaque structure (par exemple, épine dendritique, synapse) et marquez les éléments. Travaillez uniquement sur le nouveau calque pour conserver l’image d’origine. Lorsque vous avez terminé, fusionnez le calque d’annotation avec l’image, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le calque supérieur et fusionnez vers le bas. Répétez ces étapes pour chaque image TEM contenant une coupe transversale de la colonne dendritique.
  9. Transférez les images TEM avec les coupes transversales visibles de l’épine dendritique vers un logiciel de reconstruction 3D. Pour supprimer l’objet Cube par défaut, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’objet, puis supprimez-le. Pour aligner la perspective de la fenêtre d’affichage avant de télécharger des images, cliquez sur Z dans le gizmo de navigation ou appuyez sur le pavé numérique 7. Pour télécharger des images, cliquez sur Ajouter |Illustration |Référencez, sélectionnez la première image et double-cliquez dessus pour confirmer. Répétez l’opération pour chaque image, en veillant à ce que la perspective de la fenêtre d’affichage reste cohérente tout au long de l’image.1
    REMARQUE : Pour faire pivoter la vue, maintenez le bouton central de la souris enfoncé et déplacez la souris ou utilisez le gizmo de navigation. Pour effectuer un panoramique de la vue, maintenez les touches Maj + centrale de la souris enfoncées, déplacez la souris ou utilisez Déplacer la vue.
  10. Disposer les images TEM à la distance appropriée, en tenant compte de l’épaisseur des sections ultraminces (figure 4A). Pour positionner la dernière image TEM le long de l’axe Z, cliquez sur l’image, cliquez sur Propriétés de l’objet (barre latérale droite) et entrez la valeur dans Emplacement Z. Les images peuvent maintenant être réparties entre la première et la dernière image. Pour les distribuer, sélectionnez toutes les images, appuyez sur N pour ouvrir le panneau N, puis cliquez sur l’onglet Modifier (dans le panneau N) | Dist Z.
    REMARQUE : Avant d’effectuer des réglages, alignez la perspective de la fenêtre d’affichage, puis cliquez sur Z sur le gizmo de navigation ou appuyez sur le pavé numérique 7.
    L’outil Distribuer doit être activé pour distribuer les images. Pour l’activer, allez dans Modifier | Préférences | Obtenez les extensions, recherchez « Distribuer » et cliquez sur Installer. Une fois activé, l’outil Distribuer reste actif d’une session à l’autre et n’a pas besoin d’être réactivé, tant que la même version du programme est utilisée.
  11. Tracez manuellement la forme de la colonne dendritique sur chaque image à l’aide d’une seule courbe par image TEM (Figure 4B, C).
    1. Assurez-vous que seule la première image TEM est visible. Dans la collection de scènes, masquez tous les autres objets à l’aide de l’icône en forme d’œil . Pour créer une courbe de base pour le contour, cliquez sur Ajouter |Courbe |Cercle. Déplacez l’objet BézierCircle , maintenez G, déplacez la souris et cliquez pour accepter les modifications.
    2. Pour correspondre à la taille du profil de la colonne dendritique, mettez l’objet à l’échelle, maintenez la touche S enfoncée, déplacez la souris et cliquez. Entrez dans l’onglet Modélisation avec l’objet BézierCircle sélectionné. Alignez à nouveau la perspective de la fenêtre d’affichage et cliquez sur Z dans le gizmo de navigation ou appuyez sur le pavé numérique 7.
    3. Pour ajuster la forme de la courbe, sélectionnez un point de contrôle , maintenez G enfoncé, déplacez la souris et cliquez.
    4. Pour régler la direction et l’intensité des poignées, sélectionnez un point de poignée, appuyez sur G pour déplacer ou S pour mettre à l’échelle, puis cliquez pour confirmer. Répétez l’opération pour chaque point.
    5. Pour ajouter un nouveau point de contrôle, sélectionnez deux points de contrôle existants, maintenez la touche Maj enfoncée et cliquez sur chaque point, cliquez avec le bouton droit de la souris, sélectionnez Subdiviser. Lorsque la courbe correspond suffisamment à la limite du profil de l’épine dendritique, entrez dans l’onglet Mise en page , faites un clic droit sur l’objet BézierCircle et Dupliquez l’objet, puis cliquez sans bouger la souris. Créez le même nombre de copies de BézierCircle qu’il y a d’images TEM utilisées pour la reconstruction. Alignez-les avec les images TEM disposées à l’aide de l’outil Répartir comme à l’étape 4.10.
    6. Ajustez chaque courbe du BézierCircle dans l’onglet Modélisation pour qu’elle corresponde au profil de la colonne vertébrale dendritique de chaque image. Assurez-vous que seuls l’objet BézierCircle actuellement modifié et l’image TEM correspondante sont visibles à la fois.
      REMARQUE : Toutes les actions de clic droit requises pour certaines étapes doivent être effectuées dans les limites de la scène. Les courbes successives doivent correspondre aux limites de sections d’épines dendritiques consécutives et contenir le même nombre de points de contrôle.
  12. Connectez des lignes adjacentes à l’aide de la fonction de reconstruction 3D pour former une surface continue et créer la forme 3D finale (Figure 4D).
    1. Assurez-vous que seuls les objets BézierCircle sont visibles. Dans la collection de scènes, masquez tous les autres objets à l’aide de l’icône en forme d’œil dans la barre latérale.
    2. Pour créer l’objet épine dendritique, allez dans l’onglet Disposition , sélectionnez tous les objets BézierCircle, cliquez avec le bouton droit de la souris, puis cliquez sur Joindre. Convertissez l’objet joint en maillage en cliquant avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant Convertir en |Maille.
    3. Pour connecter les arêtes de l’objet joint, entrez dans l’onglet Modélisation , appuyez sur 2 pour entrer en mode de sélection d’arête |Sélectionner |Tout |clic droit |Boucles de bord de pont.
    4. Pour combler l’espace en haut de l’objet, désélectionnez tout en cliquant à côté de l’objet, maintenez la touche Alt enfoncée et cliquez sur une section d’arête du rebord supérieur, cliquez avec le bouton droit de la souris, sélectionnez Extruder les arêtes, faites glisser le pointeur vers le haut sur l’axe Z, appuyez sur S et déplacez la souris pour réduire la nouvelle boucle d’arête, cliquez pour accepter la modification. Alors que la nouvelle boucle d’arête est toujours sélectionnée, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Nouvelle face à partir des arêtes. Remplissez l’espace inférieur en utilisant la même méthode.
    5. Pour lisser l’objet, entrez dans l’onglet Disposition , cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Teinte lisse. Pour lisser davantage la forme, allez dans Modificateurs (barre latérale droite) |Ajouter un modificateur |Générer |Surface de lotissement. Définissez les niveaux Fenêtre d’affichage et Rendu sur la même valeur (recommandé 1).
  13. Répétez les étapes 4.11-4.12 pour la reconstruction des synapses (Figure 4E, F).
  14. Attribuez une couleur à chaque structure et utilisez la fonction de rendu pour préparer l’image finale (Figure 4G,H). Allez dans le menu Ombrage de la fenêtre et sélectionnez Rendu pour prévisualiser les modifications de matériau. Sélectionnez l’objet à colorer et cliquez sur Matériau (barre latérale droite) |Nouveau |ajuster la couleur de base.
    1. Pour affiner l’apparence du matériau, ajustez les curseurs Rugosité ou Métallisé selon vos besoins. Utilisez cette méthode pour attribuer une couleur distincte à chaque structure.
    2. Pour régler l’éclairage de la scène, cliquez sur l’objet Lumière, maintenez G enfoncé et déplacez la souris pour le repositionner. Pour modifier l’intensité lumineuse, allez dans Données (barre latérale droite) et ajustez la valeur de puissance.
    3. Pour positionner la caméra, orientez la fenêtre d’affichage pour faire face à la colonne vertébrale reconstruite telle qu’elle devrait apparaître dans l’image finale, appuyez sur Ctrl + Alt + Pavé numérique 0. Sélectionnez le cadre visible de l’appareil photo, maintenez G enfoncé et déplacez la souris pour le repositionner si nécessaire.
    4. Pour préparer le rendu, allez dans la sortie (barre latérale droite), modifiez les valeurs de résolution X et Y pour qu’elles correspondent à l’image souhaitée. Pour améliorer la qualité de l’image, accédez à Rendu (barre latérale droite) |Rendu, ajustez la valeur des échantillons entre 120 et 250. Pour un arrière-plan transparent, accédez à Rendu |Cinéma |cochez Transparent. Pour effectuer le rendu de l’image, appuyez sur F12 ou accédez à Rendu (menu supérieur) |Rendu de l’image.

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Results

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Pour appliquer correctement notre méthode à l’analyse des changements synaptiques circadiens, il est nécessaire de commencer par sélectionner au moins quatre points temporels à intervalles égaux, avec deux points pour chaque phase de l’activité des animaux (toutes les 6 h). À ces moments désignés, les animaux sont sacrifiés et leurs cerveaux sont collectés. Cette approche permet d’identifier les schémas quotidiens ou circadiens de la plasticité synaptique et de les relier aux changements de l’activité locomotrice des ani...

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Discussion

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Ici, nous avons présenté la méthodologie utilisée pour étudier la plasticité circadienne des synapses et la reconstruction des épines dendritiques dans le cortex cylindrique de souris. Pour garantir des résultats fiables, l’étude de plasticité circadienne doit inclure au moins quatre points temporels. Nos recherches ont montré que les données de deux points temporels - l’un pendant la phase de repos (jour) et l’autre pendant la phase d’activité (nuit) - fournissaient des informations sur...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail est soutenu par des subventions du Centre national des sciences de Pologne, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 à EP et du Collège médical de l’Université Jagellonne, nr N41/DBS/001129 à MJ.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Film AclarAgar scientifiqueAGL4458
Logiciel Blender  ;Version : v. 2.91.2
Acide cacodylique, sel de sodium trihydratéPolysciences01131-100
Toboggan concaveMenzel9.161 151
Couteau diamanté  ;Diatomée15-États-UnisAngle du couteau : Ultra 45° ;   ;
Appareil photo numérique  ;Nikon·s ;DXM 1200 F
hydrogénophosphate disodique dodécahydratéPOCH799280115
Résine d’enrobagePolysciences08792-1Formulation Luft  ;
ÉthanolPol-AuraRéf. PA-11-0004
Logiciel GIMPVersion : V 3.0.4
Citrate de plombTAABL018
Microscopie optique  ;Nikon·s ;Optiphot
Tétroxyde d’osmium  ;PolysciencesRéférence 0223C-10Cristallin (99.95 %)
Pinceau
Logiciel Photoshopversion : CS5
Ferricyanure de potassiumSigmaaldrichRéf. P8131
Oxyde de propylène  ;Sigmaaldrich82320puriss. p.a., &ge ; 99,5 % (GC)
Grilles à un seul emplacementAgar scientifiqueAGG25252 x 0,75 mm ou 2 x 1 mm
Chlorure de sodium  ;Chempur117941206
Dihydrogénophosphate de sodium dihydratéChempur117991808
Stéréomicroscopepzo
Filtre à seringue  ;BiosensBS25PES045
TEM  ;JoëlJEM-2100
UltramicrotomeLeicaUC7
Acétate d’uranyleLachema
VibratomeLeicaVT1000 S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jasinska, M., Pyza, E. Circadian plasticity of mammalian inhibitory interneurons. Neural Plast. 2017, 1-12 (2017).
  2. Krzeptowski, W., Hess, G., Pyza, E. Circadian plasticity in the brain of insects and rodents. Front Neural Circuits. 12, 32(2018).
  3. Mansilla, A., et al. Molecular mechanisms that change synapse number. J Neurogenet. 32 (3), 155-170 (2018).
  4. Frank, M. G. Renormalizing synapses in sleep: the clock is ticking. Biochem Pharmacol. 191, 114533(2021).
  5. Jasinska, M., et al. Daily rhythm of synapse turnover in mouse somatosensory cortex. Acta Neurobiol Exp. 74 (1), 104-110 (2014).
  6. Jasinska, M., et al. Circadian rhythmicity of synapses in mouse somatosensory cortex. Eur J Neurosci. 42 (8), 2585-2594 (2015).
  7. Jasinska, M., et al. Circadian clock regulates the shape and content of dendritic spines in mouse barrel cortex. PLOS ONE. 14 (11), e0225394(2019).
  8. Jasinska, M., et al. Circadian changes of dendritic spine geometry in mouse barrel cortex. Front Neurosci. 14, 578881(2020).
  9. Jasinska, M., et al. Light-modulated circadian synaptic plasticity in the somatosensory cortex: link to locomotor activity. Int J Mol Sci. 25 (23), 12870(2024).
  10. Woolsey, T. A., Vander Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
  11. Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the Sml-face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
  12. Armstrong-James, M., Fox, K. Spatiotemporal convergence and divergence in the rat SI barrel cortex. J Comp Neurol. 263 (2), 265-281 (1987).
  13. Barrel cortex. Fox, K. , Cambridge University Press. (2008).
  14. Jasinska, M., et al. Rapid, learning-induced inhibitory synaptogenesis in murine barrel field. J Neurosci. 30 (3), 1176-1184 (2010).
  15. Knott, G. W., Quairiaux, C., Genoud, C., Welker, E. Formation of dendritic spines with GABAergic synapses induced by whisker stimulation in adult mice. Neuron. 34 (2), 265-273 (2002).
  16. Jasinska, M., et al. Effect of associative learning on memory spine formation in mouse barrel cortex. Neural Plast. 2016, 1-11 (2015).
  17. Jasinska, M., et al. Fear learning increases the number of polyribosomes associated with excitatory and inhibitory synapses in the barrel cortex. PLOS ONE. 8 (2), e54301(2013).
  18. White, E. L. Ultrastructure and synaptic contacts in barrels of mouse SI cortex. Brain Res. 105 (2), 229-251 (1976).
  19. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing whole-brain activity and development at the single-cell level using light-sheet microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  20. Serrano, M. E., Kim, E., Petrinovic, M. M., Turkheimer, F., Cash, D. Imaging synaptic density: the next holy grail of neuroscience. Front Neurosci. 16, 796129(2022).
  21. Woelfle, S., et al. CLARITY increases sensitivity and specificity of fluorescence immunostaining in long-term archived human brain tissue. BMC Biol. 21 (1), 113(2023).
  22. Weibel, E. R. Stereological methods. Vol. 1: practical methods for biological morphometry. , Academic Press. London. (1979).
  23. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134 (2), 127-136 (1984).
  24. Gundersen, H. J. G. Stereology of arbitrary particles. J Microsc. 143 (1), 3-45 (1986).
  25. Fiala, J. C., Harris, K. M. Cylindrical diameters method for calibrating section thickness in serial electron microscopy. J Microsc. 202 (3), 468-472 (2001).
  26. Napper, R. M. A. Total number is important: using the disector method in design-based stereology to understand the structure of the rodent brain. Front Neuroanat. 12, 16(2018).
  27. Perez-Cruz, C., Simon, M., Czéh, B., Flügge, G., Fuchs, E. Hemispheric differences in basilar dendrites and spines of pyramidal neurons in the rat prelimbic cortex: activity- and stress-induced changes. Eur J Neurosci. 29 (4), 738-747 (2009).
  28. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  29. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nat Methods. 9 (12), 1198-1201 (2012).
  30. Videnovic, A., Zee, P. C. Consequences of circadian disruption on neurologic health. Sleep Med Clin. 10 (4), 469-480 (2015).
  31. Logan, R. W., McClung, C. A. Rhythms of life: circadian disruption and brain disorders across the lifespan. Nat Rev Neurosci. 20 (1), 49-65 (2018).
  32. Nassan, M., Videnovic, A. Circadian rhythms in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurol. 18 (1), 7-24 (2021).
  33. Shen, Y., et al. Circadian disruption and sleep disorders in neurodegeneration. Transl Neurodegener. 12 (1), 8(2023).
  34. Dufort-Gervais, J., Mongrain, V., Brouillette, J. Bidirectional relationships between sleep and amyloid-beta in the hippocampus. Neurobiol Learn Mem. 160, 108-117 (2019).
  35. Adler, P., et al. Aging disrupts the circadian patterns of protein expression in the murine hippocampus. Front Aging Neurosci. 11, 368(2020).

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