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Article de méthode

Production d’un système de particules semblable au virus SARS-CoV-2 pour étudier les cycles de vie viraux in vitro

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DOI :

10.3791/68389

⸱

6 juin 2025

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole in vitro optimisé pour produire des particules semblables au virus du SRAS-CoV-2 qui imitent étroitement le virus authentique. Cette approche permet d’étudier les mécanismes d’infection, d’assemblage et de sortie virales sans les contraintes de nécessiter un laboratoire de biosécurité de niveau 3.

Résumé

La méthode des particules pseudo-virales du syndrome respiratoire aigu sévère-coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) (SC2-VLP) offre un outil puissant et accessible pour étudier le cycle de vie du SARS-CoV-2 sans avoir besoin de laboratoires de niveau de biosécurité 3 (BSL-3). Ce système imite efficacement les étapes critiques du cycle de vie viral, y compris l’assemblage, l’emballage du génome et la sortie, à l’aide d’un rapporteur de luciférase fusionné au signal T20 pour une détection sensible et précise de la production de particules virales. Les SC2-VLP sont générées par la co-expression des protéines structurelles du SRAS-CoV-2, notamment la membrane (M), la nucléocapside (N), l’enveloppe (E) et la pointe (S), ainsi que par le signal d’emballage de l’ARN dans les cellules HEK-293T. Contrairement aux systèmes traditionnels de particules pseudo-virales, la méthode SC2-VLP garantit une quantification précise et une plus grande fidélité au cycle de vie viral naturel. De plus, par rapport aux méthodes de pseudotypage lentiviral, qui se limitent à étudier l’entrée virale par l’incorporation de la protéine S dans des particules lentivirales basées sur le VIH, le système SC2-VLP fournit une plate-forme plus complète pour explorer les multiples étapes de la biologie du SRAS-CoV-2. Bien que cette méthode contourne les risques liés à la gestion de virus vivants et élargisse l’accessibilité. La méthode SC2-VLP représente une avancée significative dans la recherche antivirale et le développement de stratégies thérapeutiques contre le SARS-CoV-2.

Introduction

La pandémie de COVID-19 est devenue l’une des crises sanitaires mondiales les plus dévastatrices de l’histoire moderne, entraînant la mort de millions de personnes dans le monde1. Le virus responsable, le SRAS-CoV-2, suit un cycle de vie complexe qui comprend des étapes clés telles que l’infection, la réplication du génome, l’assemblage et la sortie. Le processus d’infection commence lorsque la protéine de pointe virale (S) se lie au récepteur de la cellule hôte, l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2), facilitant la libération du génome viral dans la cellule hôte 2,3. L’ARN polymérase virale dépendante de l’ARN (RdRp) catalyse ensuite la réplication de l’ARN génomique. Cet ARN, en complexe avec la protéine de la nucléocapside (N), forme une structure stable qui est reconnue par la protéine membranaire (M). La protéine M joue un rôle central dans l’assemblage viral en recrutant le complexe ARN-N, S, et la protéine d’enveloppe (E)4,5. Après l’assemblage, le virion termine sa sortie par une voie de trafic non canonique médiée par les lysosomes6.

En réponse à la pandémie, d’importantes ressources mondiales ont été mobilisées pour mettre au point des vaccins, des anticorps neutralisants et des médicaments antiviraux. L’évaluation de ces interventions a été essentielle pour faire avancer la recherche sur le SRAS-CoV-27. Cependant, l’étude du virus vivant présente d’importants défis logistiques, car les expériences impliquant le virus doivent être menées dans des laboratoires de niveau de biosécurité 3 (BSL-3). La disponibilité limitée des installations BSL-3 a limité le rythme des recherches visant à comprendre et à combattre le SARS-CoV-2.

Pour relever ces défis, deux systèmes majeurs, à savoir le pseudotypage des particules pseudo-virales (VLP) et le pseudotypage lentiviral, ont été largement adoptés dans la recherche sur le SRAS-CoV-2, qui ne nécessitent pas de confinement BSL-38. Le système VLP implique la co-transfection de cellules avec des gènes codant pour des protéines structurelles virales, notamment M, S, E et N, qui génèrent ensemble des particules pseudo-virales. Ces particules imitent les propriétés structurelles et fonctionnelles du virus, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les processus clés du cycle de vie du SRAS-CoV-2, et même un antigène efficace pour le développement de vaccins 9,10,11.

À l’inverse, le système de pseudotypage lentiviral consiste à remplacer la protéine G du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) dans le lentivirus par la protéine S du SRAS-CoV-2, permettant la production de particules lentivirales pouvant incorporer des gènes rapporteurs tels que la luciférase ou la GFP. Ce système est particulièrement utile pour étudier les anticorps neutralisants qui bloquent l’interaction S-ACE212. Cependant, le pseudotypage lentiviral ne reflète pas l’assemblage ou la sortie du virus SARS-CoV-2 en raison de l’utilisation de protéines structurelles du VIH, qui interviennent dans la libération de particules au niveau de la membrane plasmique.

Pour surmonter ces limitations, Syed et al. ont récemment identifié le signal d’emballage du SRAS-CoV-2 dans son génome ARN, ce qui démontre la spécificité de la protéine N vis-à-vis de la reconnaissance du génome viral13. En fusionnant ce signal d’emballage avec des gènes rapporteurs, il est possible d’incorporer efficacement ces gènes dans des particules pseudo-virales du SARS-CoV-2 (SC2-VLPs)13. Cette stratégie permet non seulement de reproduire les processus d’assemblage et de sortie du SRAS-CoV-2, mais aussi de mesurer de manière sensible les étapes de l’infection. Dans cette étude, nous présentons la méthodologie expérimentale d’utilisation du système SC2-VLP et soulignons les principaux facteurs à prendre en compte pour mener cette approche.

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Protocole

1. Génération de SC2-VLP

  1. Semez ~3,0 × 106 cellules HEK-293T dans une plaque de culture tissulaire de 10 cm de diamètre avec un milieu complet DMEM, complétée par 10 % v/v de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.
    REMARQUE : Pour assurer une efficacité de transfection élevée et une production optimale de SC2-VLP, les cellules HEK-293T doivent être maintenues à un faible nombre de passages ~10.
  2. Cultivez la cellule HEK-293T à 37 °C, 5 % de CO2 pendant environ 24 h, et vérifiez la confluence cellulaire au microscope. Procéder si ~70 % confluent.
  3. Diluer 60 μL de PEI à partir d’une couche mère de 1 mg/mL à 200 μL avec un milieu sans sérum.
  4. Ajouter 6,7 μg de plasmide N, 10 μg de plasmide Luc-T20, 0,016 μg de plasmide S et 3,3 μg de plasmide M-IRES-E dans 200 μL de milieu sans sérum (voir le fichier supplémentaire 1).
  5. Ajouter délicatement le PEI dilué de l’étape 1.3 dans la solution contenant les plasmides codant pour les protéines de structure virale de l’étape 1.4, et incuber à température ambiante pendant 10 min. C’est la solution de transfection.
  6. Déposez délicatement la solution de transfection de l’étape 1.5 sur les cellules HEK-293T et faites tourner doucement la plaque de culture tissulaire pour un mélange minutieux.
  7. Remplacez le milieu de culture cellulaire 6 h après l’infection par le milieu complet DMEM et incubez les cellules HEK-293T transfectées à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 48 h.
  8. Prélever le surnageant des cellules HEK-293T infectées, qui contient les SC2-VLP, puis filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm pour éliminer les débris cellulaires. Il s’agit du support SC2-VLP.
    REMARQUE : Nous avons tenté de produire des SC2-VLP dans les lignées cellulaires HeLa, Vero E6 et Caco2, mais aucun titre viral mesurable n’a été obtenu, ce qui indique la spécificité du protocole pour les cellules HEK-293T.

2. Examen de l’efficacité du SC2-VLP

REMARQUE : La lignée cellulaire HEK-293T exprimant de manière stable l’ACE2 et la TMPRSS2 a été établie en utilisant une approche de transduction lentivirale14,15. L’expression protéique de l’ACE2 et de l’TMPRSS2 a été confirmée par l’analyse par transfert Western, selon un protocole similaire à celui décrit à l’étape 3 (analyse de la composition SC2-VLP).

  1. Amorcez 4.0 × 104 cellules HEK-293T avec une expression stable de l’ACE2 et de la TMPRSS2 dans une plaque de 96 puits et ajoutez 50 μL de milieu SC2-VLP à partir de l’étape 1.8.
  2. Incuber la plaque de culture tissulaire à 96 puits à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h.
  3. Retirer le milieu de la plaque à 96 puits et laver une fois avec 100 μL de tampon PBS à 37 °C, contenant 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 et 1,8 mM de KH2PO4.
  4. Lysez les cellules HEK-293T ACE2/TMPRSS2 avec 20 μL de tampon de lyse passive, en secouant doucement l’échantillon pendant 15 min sur un agitateur orbital à température ambiante.
    REMARQUE : Le tampon de lyse contient 25 mM de Tris-phosphate (pH 7,8), 2 mM de DTT, 2 mM de 1,2-diaminocyclohexane-N,N,N,N′,N'-acide tétraacétique, 1,25 mg/mL de lysozyme, 2,5 mg/mL de BSA, 10 % de glycérol et 1 % de Triton X-100).
  5. Faites tourner la plaque à 96 puits à 4 000 × g pendant 15 min à 4 °C dans une centrifugeuse à microplaques réfrigérée, puis transférez immédiatement la plaque dans un bain de glace.
  6. Prenez 100 μL de tampon de dosage de la luciférase reconstituée dans une plaque blanche opaque à 96 puits et ajoutez 20 μL de lysat à partir de l’étape 2.5. Mélangez-les brièvement en pipetant de haut en bas 2-3x.
  7. Mesurez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques avec les paramètres suivants : Mode de détection : Luminescence ; Gamme de longueurs d’onde : Spectre complet ; Format de la plaque : plaque opaque standard à 96 puits ; Temps d’intégration : 200 ms.

3. Examen de la composition SC2-VLP

  1. Ajouter 1,36 mL de solution de PEG 8000, contenant 50 % de PEG 8000 et 2,2 % de NaCl, à 10 mL de milieu SC2-VLP à partir de l’étape 1.8.
  2. Conservez le mélange sur un agitateur orbital et mélangez lentement la solution à 4 °C pendant la nuit.
  3. Centrifuger la solution à 4 °C, 2 000 × g pendant 30 min, puis prélever la pastille SC2-VLP pour l’analyse par western blot16.
    REMARQUE : Pour l’analyse par transfert Western, tous les renseignements concernant les anticorps sont fournis dans la table des matières.

4. Analyse de localisation subcellulaire de S et de ses mutants dans les cellules productrices de SC2-VLP

  1. Semez uniformément ~3,0 × 106 cellules HEK-293T dans la boîte de culture à fond de verre de 15 mm de diamètre, puis laissez les cellules adhérer et se développer jusqu’à ~70 % de confluence avant la transfection.
  2. Répétez la procédure de transfection comme décrit aux étapes 1.3 à 1.7 et modifiez uniquement les quantités de plasmide comme suit : plasmide N : 1,3 μg, plasmide Luc-T20 : 2 μg, plasmide S : 0,0032 μg et plasmide M-IRES-E : 0,66 μg.
  3. Lavez délicatement la boîte de culture deux fois avec 1 mL de PBS glacé, puis ajoutez 1 mL de solution de fixation de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à température ambiante (RT) pendant 15 min.
  4. Lavez les cellules pendant 2 x 5 minutes avec 1 mL de PBS à la RT, puis perméabilisez les cellules en ajoutant 1 mL de Triton X-100 à 0,25 % à la RT pendant 10 min.
  5. Laver les cellules pendant 2 x 5 minutes avec 1 mL de PBS à la RT, puis ajouter 1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % à la RT pendant 1 h pour bloquer les interactions d’anticorps non spécifiques.
  6. Ajouter ~200 μL de solution d’anticorps primaires (suffisamment pour couvrir le fond du verre) et incuber à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Les solutions d’anticorps primaires sont préparées en les diluant dans 5 % de BSA dissous dans du PBS aux taux de dilution suivants : l’anticorps anti-S de souris à 1:200, l’anticorps anti-Sec61β de lapin à 1:200, l’anticorps anti-GM130 de lapin à 1:200 et l’anticorps anti-ERGIC53 de lapin à 1:200. La solution BSA/PBS à 5 % a servi à la fois de diluant et de tampon bloquant pour minimiser la liaison non spécifique lors des procédures ultérieures de coloration par immunofluorescence.
  7. Retirer la solution d’anticorps primaires, puis laver les cellules pendant 3 x 5 minutes avec 1 mL de PBS à RT.
  8. Ajouter une solution d’anticorps secondaires conjugués à la fluorescence pendant 1 h de RT, puis laver les cellules pendant 3 x 5 min avec 1 mL de PBS à RT.
    REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans l’obscurité ou sous une exposition minimale à la lumière afin d’éviter le photoblanchiment des conjugués fluorescents et de préserver l’intégrité du signal. Deux types d’anticorps secondaires conjugués à la fluorescence, dérivés de la souris ou du lapin, sont utilisés pour colorer la protéine S ou les protéines marqueurs de l’organite cellulaire.
  9. Colorer les noyaux avec une solution de Hoechst de 2,5 μg/mL à RT pendant 5 min, puis laver les cellules pendant 3 x 5 min avec 1 mL de PBS à RT.
  10. Observez la coloration des protéines S ou des organites et acquérez des images à l’aide d’un microscope confocal avec les paramètres suivants : Mode PMT réglé sur VBF (pas de moyenne, balayage séquentiel de lignes) avec ouverture confocale automatique. Pour le canal 1 (FITC), utilisez le laser 488 nm à 25 % de puissance avec une émission de 500 à 548 nm, HV 525 V, gain 1x et décalage 5 %. Pour le canal 2 (Alexa Fluor 594), utilisez le laser 594 nm à 25 % de puissance avec une émission de 610 à 670 nm, HV 500 V, gain 1x et décalage 5 %. Pour le canal 3 (DAPI), utilisez le laser 405 nm à 25 % de puissance avec une émission de 430 à 470 nm, HV 490 V, gain 1x et décalage 5 %.

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Résultats

Les étapes de sortie et d’assemblage du cycle de vie du SARS-CoV-2 ont été moins étudiées que les étapes d’infection et de réplication17,18. Avant le développement de la méthode SC2-VLP, ces processus ne pouvaient être étudiés qu’à l’aide de SARS-CoV-2 vivants, confinant la recherche aux laboratoires BSL-313. Le flux de travail SC2-VLP, illustré à la figure 1, décrit le protocole expérimental et illustre les p...

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Discussion

Une méthode simple et efficace pour modéliser le cycle de vie du SARS-CoV-2 dans les systèmes de culture cellulaire, sans les contraintes des laboratoires BSL-3, représente une avancée cruciale pour la recherche anti-SARS-CoV-2. La méthode SC2-VLP répond à ce besoin, en offrant une plateforme robuste et accessible. Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé pour la méthode SC2-VLP, décrivant les étapes expérimentales critiques pour la production de SC2-VLP. De plus, nous so...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le programme Startup fund de l’Université de médecine chinoise de Pékin (BUCM) (90011451310011). Nous exprimons notre gratitude à tous les membres du laboratoire du Dr Ma au BUCM pour la discussion inestimable et l’aide apportée aux expériences.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Albumine sérique bovine (BSA)Technologie de signalisation cellulaire9998S
Microscope confocal à balayage laserOlympusFV3000
DMEMCorning10-013-CV
Sérum fœtal bovin (FBS)ThermofisherA5670402
chèvre Anti-souris IgG H& L (Alexa Fluor 488)InvitrogenA11001taux de dilution : IF 1:1000
Goat Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 594)Abcamab150080taux de dilution : IF 1:1000
Lignée cellulaire HEK-293Tnationale des ressources en lignées cellulaires (NICR)NICR-293T-001Pour assurer une efficacité de transfection élevée et une production optimale de SC2-VLP, les cellules HEK-293T doivent être maintenues à de faibles nombres de passage (&le ; P10).
Hoechst 33342InvitrogenH1399Concentration de travail : 2,5 &mu ; g/mL
Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1500
Luc-T20Addgene177941
Souris monoclonal anti-GAPDHProteintech60004-1-IgTaux de dilution : WB 1:20 000
Souris monoclonale anti-S RBDAbclonalA23771Taux de dilution : IF 1:200
OptiMEMThermofisher31985070milieu sans sérum pour la transfection
PEG3350Sigma-AldrichP3635
PEG8000Sigma-AldrichP2139
Pénicilline-StreptomycineThermofisher15140122
Polyéthylèneimine (PEI)Thermofisher43896.01
Tampon de lyse passive PromegaE1941
Polyclonal de lapin anti-ACE2Proteintech21115-1-APtaux de dilution : WB 1:1000
polyclonal anti-ERGIC53Proteintech13364-1-APtaux de dilution : IF 1:200
Polyclonal de lapin anti-GM130Proteintech11308-1-APtaux de dilution : IF 1:200
Polyclonal de lapin anti-SAbcamab272504taux de dilution : WB 1:1000
Lapin polyclonal anti-Sec61&beta ;Proteintech15087-1-AP Taux dedilution : IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-TMPRSS2Abcamab109131Taux de dilution : WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-E plasmideAddgene177938
SARS-CoV-2 N PlasmideAddgene177959
SARS-CoV-2 Nucléoprotéine Rabbit mAbAbclonalA21042Taux de dilution : WB 1:4000
Plasmide SARS-CoV-2 SAddgene177960
Anticorps secondaire, HRP, IgG anti-souris de chèvre (H+L)Invitrogen31460Taux de dilution : WB 1:5000
Anticorps secondaire, HRP, IgG anti-lapin de chèvre (H+L)Invitrogen31430Taux de dilution : WB 1:5000
SpectraMax i3x lecteur de plaques  ;Dispositifs moléculairesSpectraMax i3x
anticorps anticorps Infrastructure Lapin

Références

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